Wieloparametryczny system peryfuzji wysp trzustkowych w mikroprzepływowym urządzeniu peryfuzyjnym

W tej prezentacji przedstawimy mikroprzepływowy system perfuzji powiek do jednoczesnego pomiaru dynamicznego wydzielania insuliny, napływu wapnia i zmian potencjału mitochondrialnego oczek trzustki w odpowiedzi na psy wydzielające insulinę. System perfuzyjny składa się z trójwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego, pomp strzykawkowych i kolektora frakcji insuliny. Indukowany przez wydzielanie napływ wapnia i potencjały mitochondrialne są obrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Cześć, mam na imię Ola, pracuję w laboratorium doktora Vala Holtera na Wydziale Chirurgii Transplantacyjnej Uniwersytetu Illinois w Chicago. Cześć, nazywam się Don Lee i również pochodzę z Październikowego Laboratorium. Cześć, nazywam się Tricia Hart i również pracuję w laboratorium Dr.Al Holster.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę jednoczesnego obrazowania powiek za pomocą liniowego gradientu glukozy. Zastosowaliśmy tę procedurę w naszym laboratorium do zbadania wyglądu i funkcji oczek. Więc zacznijmy.

Urządzenie mikroprzepływowe używane do tej procedury składa się z trzech warstw utwardzonego PDMS wygenerowanego przez standardową fotolitografię. Pierwsza warstwa wytworzona z wzorca silikonowego zawiera dołki urządzenia mikroprzepływowego, które delikatnie utrzyma oczka na miejscu, o głębokości 150 mikrometrów i średnicy 500 mikrometrów. Druga warstwa ma kanały o wysokości 500 mikrometrów i szerokości dwóch milimetrów.

Środek kanału jest rozszerzony, aby rozłożyć przepływ w celu lepszej wymiany roztworu Wewnątrz urządzenia, w zamian studnia jest wykonana przez wybicie otworu o wysokości trzech milimetrów i szerokości siedmiu milimetrów w środku warstwy. Trzecia warstwa to gruba płyta PDMS. Aby przygotować tę warstwę, wybij małe otwory po obu stronach, które pokrywają się z wlotem i wylotem kanału.

Na drugiej warstwie, po wygenerowaniu wszystkich trzech warstw, pierwsza warstwa jest przyklejana do szkiełka podstawowego ze studzienkami skierowanymi do góry. Druga warstwa jest następnie przyklejana do pierwszej warstwy z odstępami między kanałami w górę. Na koniec trzecia warstwa jest przyklejana do drugiej warstwy.

Po sklejeniu warstw urządzenie jest gotowe do użycia w eksperymentach. Za pomocą 10-mililitrowej strzykawki wypełnionej 70% etanolem i podłączonej do portu wlotowego urządzenia z Tai na rurkach, wysterylizuj urządzenie mikroprzepływowe, przepływając etanol przez kanały urządzenia. Następnie, używając tego samego przepływu konfiguracji, zdejonizowana woda wypłukała etanol.

Po wysterylizowaniu urządzenia umieść je na podgrzewanym stoliku mikroskopu za pomocą rurki tigon, podłącz pompy strzykawkowe zawierające roztwory o wysokiej i niskiej zawartości glukozy do złącza Y. Następnie podłącz do wlotu urządzenia mikroprzepływowego. Podłączyć wylot urządzenia mikroprzepływowego do kolektora frakcji.

Upewnij się, że rurka spoczywa na płycie grzejnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Bardzo ważne jest, aby utrzymywać roztwory w temperaturze fizjologicznej przez cały czas trwania eksperymentu. Następnie użyj programu widoku laboratoryjnego, aby zainicjować gradient glukozy, który będzie perfundowany przez sieć mikroprzepływową podczas eksperymentu.

To oprogramowanie zmienia szybkość przepływu dwóch roztworów glukozy. Sterując pompami strzykawkowymi, można tutaj tworzyć różne profile gradientu glukozy, liniowe, dzwonowe i kwadratowe. W porównaniu z obliczonymi wartościami oczekiwanymi pokazanymi w tym eksperymencie, zostanie zastosowany gradient liniowy od dwóch milimolowych do 25 milimolowych glukozy ze zmiennym natężeniem przepływu 0,01 mililitra na minutę dwóch roztworów glukozy i stałym natężeniem przepływu 0,25 mililitra na minutę wchodzącego do urządzenia po zmieszaniu roztworów.

Po wybraniu odpowiedniego profilu nachylenia należy przetestować stabilność gradientu. Najpierw uruchom system gradientu. Następnie uruchom kolektor frakcji i zbierz perfuzję osiem w jednym mililitrze eend orph probówek

Następnie za pomocą glukometru przetestuj stężenie glukozy w każdej probówce za pomocą programu Excel. Przeanalizuj wyniki uzyskane z glukometru. Następnie zastrzykaj strzykawkę o wysokiej zawartości glukozy strzykawką zawierającą 0,5% roztwór BSA w buforze Dzwonka Krebsa PERFUSE 50 mililitrów przez urządzenie z szybkością jednego mililitra na minutę.

Zapobiegnie to niespecyficznemu wchłanianiu insuliny do ścian mikrokanałów, aby zapewnić dokładność podczas późniejszego pomiaru poziomu wydzielanej insuliny po perfuzji z BSA. Zastąp go roztworem o wysokim poziomie glukozy reus. Zawiesić od 25 do 30 ręcznie dobranych mysich oczek w dwumilimolowym buforze pierścienia Krebsa zawierającym barwnik wskaźnikowy wapnia fira 2:00 i wskaźnik potencjałów mitochondrialnych barwnik żwacza 1 2 3, inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji odłącz urządzenie od układu perfuzyjnego i ostrożnie załaduj oczka do urządzenia mikroprzepływowego, wkładając końcówkę pipety, zawierającą wysepki do portu wlotowego i powoli dozując wysepki po załadowaniu, ponownie podłącz urządzenie do systemu perfuzyjnego. Uważaj, aby nie wprowadzać bąbelków. Następnie uruchom pompę strzykawkową, aby rozpocząć perfuzję oczek za pomocą KRB zawierającego dwa milimolowe glukozy.

Ten krok spowoduje wypłukanie nadmiaru barwnika z pożywki, wyznaczenie zestawów filtrów wzbudzenia i emisji oraz czasy ekspozycji, które mają być użyte podczas eksperymentu. Następnie ustaw kolektor frakcji tak, aby zbierał w odstępach jednominutowych, podczas gdy para używa oczek z roztworem o niskiej zawartości glukozy. Użyj obszaru zainteresowania lub narzędzia ROI z prostego oprogramowania do obrazowania PCI, aby zdefiniować obszary lub oczka, które chcesz zobrazować.

Zakreśl również obszar tła, który zostanie odjęty po umyciu komórek przez 10 minut, uruchom kolektor frakcji gradientu glukozy i rozpocznij obrazowanie poklatkowe. Po 30 minutach wyłącz oprogramowanie i pompę strzykawkową o wysokim poziomie glukozy. Kontynuuj perfuzję z niską glukozą, aby wypłukać efekt wysokiego poziomu glukozy.

Po 10 minutach zatrzymaj przepływ niskiego poziomu glukozy, wyłączając pompę strzykawkową. Po perfuzji wyeksportuj dane do programu Excel w celu analizy. Ilość insuliny wydzielanej do ósemki perfu można określić za pomocą mysich oczek ELA.

Zostały perfundowane z liniowym gradientem od dwóch do 25 milimolowych glukozy, jak pokazano tutaj. Napływ wapnia i wydzielanie insuliny są wyzwalane po około 13 minutach perfuzji odpowiadającej sześciu milimolom. Glukoza. Zmiany potencjałów mitochondrialnych są widoczne wcześniej, zgodnie z oczekiwaniami po około 11 minutach.

Dane te pokazują korzyści płynące z wykorzystania tej sieci mikroprzepływowej do scharakteryzowania fizjologii oczek. Właśnie pokazaliśmy, jak używać naszego mikroprzepływowego urządzenia do fuzji parafuzyjnej do badania fizjologii oczek. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby upewnić się, że w urządzeniu nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ może to spowodować przesuwanie się oczek podczas eksperymentu.

Ponadto flury można regulować do jednego ml na minutę bez naruszania oczek. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.