Name: Ludzki system pseudowysp do synchronicznej oceny dynamiki biosensorów fluorescencyjnych i profili wydzielania hormonów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj metodę pseudowysp ludzkich do synchronicznej oceny biosensorów cAMP i profili wydzielania insuliny oraz glukagonu. Technika ta umożliwia badanie dynamiki sygnalizacji komórkowej w cukrzycy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dawcy organów i ich rodziny są doceniani za ich nieocenione darowizny, a Międzynarodowy Instytut Organizacji Pobierania Narządów, Postęp Medycyny (IIAM) i Krajowa Wymiana Badań nad Chorobami (NDRI) są doceniane za partnerstwo w udostępnianiu ludzkiej tkanki trzustki do badań. Prace te były wspierane przez Human Islet Research Network (RRID:SCR_014393), Human Pancreas Analysis Program (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 i DK20593 (Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), The Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, Departament ds. Weteranów Stanów Zjednoczonych (BX000666), NIGMS Narodowych Instytutów Zdrowia (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 oraz stypendium badawcze National Science Foundation Graduate Research Fellowship (1937963).

Intracellular Signaling Events and Hormone Secretion in Human Pseudoislets

<ol><li>Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+systemic+insulin+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of systemic insulin function.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).</li>
<li>Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+controls+glucagon+secretion+by+directly+modulating+cAMP+in+alpha+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells.</a> Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).</li>
<li>Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+islet+glucagon+secretion%3A+Beyond+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Obesity+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium.</a> Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).</li>
<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes%3A+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li>
<li>Halban, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-cell+failure+in+type+2+diabetes%3A+Postulated+mechanisms+and+prospects+for+prevention+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).</li>
<li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1+cell+function+and+gene+expression+are+compromised+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes.</a> Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).</li>
<li>Walker, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+human+pseudoislet+system+and+microfluidic+platform+demonstrate+differences+in+GPCR+signaling+in+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells.</a> JCI Insight. 5 (10), e06990(2020).</li>
<li>Giannoukakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+intact+human+islets+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Infection of intact human islets by a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).</li>
<li>Curran, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+pancreatic+islets+by+feline+immunodeficiency+virus+vectors1%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1.</a> Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).</li>
<li>Kayton, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+preparations+distributed+for+research+exhibit+a+variety+of+insulin-secretory+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).</li>
<li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+assays+for+evaluation+of+human+pancreatic+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function.</a> Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).</li>
<li>Lenguito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resealable%2C+optically+accessible%2C+PDMS-free+fluidic+platform+for+ex+vivo+interrogation+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets.</a> Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).</li>
<li>Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DAG+and+cAMP+sensors+optimized+for+live-cell+assays+in+automated+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories.</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).</li>
<li>Tengholm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+dynamics+in+the+pancreatic+%CE%B2-cell%5BTitle%5D)+AND+%22Upsala+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).</li>
<li>Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+triggering+pathway+to+insulin+secretion%3A+Functional+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+%CE%B2+cells+and+their+translational+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance.</a> Islets. 9 (6), 109-139 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Integracja systemu mikroperyfuzji, pseudowysp trzustkowych z ekspresją biosensorów i laserowo-skaningowej mikroskopii konfokalnej pozwala na synchroniczną ocenę wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych i dynamicznych profili wydzielania hormonów. Dynamiczny system mikroperyfuzji może dostarczać szereg dobrze zdefiniowanych bodźców do wysp pseudowyspowych i pozwala na zbieranie ścieków, w których stężenia insuliny i glukagonu można zmierzyć za pomocą dostępnego na rynku testu ELISA. Równocześnie, obrazowanie żywych ko...

Wysepki Langerhansa to mini organy rozsiane po całej trzustce, których funkcja jest kluczowa dla utrzymania homeostazy glukozy. Insulina jest wydzielana z komórek beta w wyniku metabolizmu glukozy, wzrostu stosunku ATP / ADP, zamknięcia wrażliwych na ATP kanałów potasowych, depolaryzacji błony plazmatycznej i napływu zewnątrzkomórkowego wapnia 1. Wydzielanie glukagonu z komórek alfa jest mniej zrozumiałe, ale postuluje się, że szlaki wewnątrzkomórkowe i parakrynne przyczyniają się do egzocytozy granulek glukagonu2,3,4. Zarówno cukrzyca typu 1, jak i typu 2 są związane z dysfunkcją komórek wysp trzustkowych5,6,7. Dlatego wyjaśnienie wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych pośredniczących w wydzielaniu hormonu wysp trzustkowych jest niezbędne do zrozumienia mechanizmów fizjologicznych i patologicznych w wyspach trzustkowych.
Sferyczna architektura wysepek stwarza pewne przeszkody dla eksperymentów. Wyzwania te obejmują zmienność wielkości wysepek i naturę 3D wysepek, która zmniejsza transdukcję wirusa w rdzeniu wysepek8,9. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano system pseudowysepek, w którym pierwotne ludzkie wyspy trzustkowe są rozpraszane w pojedyncze komórki, adenowijnie transdukowane za pomocą konstruktów kodujących interesujące cele i ponownie agregowane w celu utworzenia kontrolowanych rozmiarów, podobnych do wysepek struktur określanych jako pseudoislets7. W porównaniu z rodzimymi wysepkami od tego samego dawcy, które były hodowane równolegle, te pseudowysepki są podobne pod względem morfologii, składu komórek endokrynnych i wydzielania hormonów7. Metoda ta pozwala na ekspresję konstruktów w całej pseudowysepce, co oznacza, że pokonuje wcześniejszą barierę dla jednolitej manipulacji genetycznej pierwotnych ludzkich wysepek7,8,9.
W tym protokole, system pseudowysp jest zintegrowany z urządzeniem mikroprzepływowym do wyrażania biosensorów w pierwotnych ludzkich komórkach wysp trzustkowych i uzyskiwania czasowej rozdzielczości wydzielania hormonu pseudowysp podczas dynamicznej peryfuzji10,11,12. Pseudowysepki umieszcza się w mikroczipie i wystawia na stały przepływ różnych sekretagogów za pomocą pompy perystaltycznej12. Mikroczip ma przezroczyste szklane dno i jest zamontowany na mikroskopie konfokalnym w celu rejestrowania dynamiki sygnalizacji wewnątrzkomórkowej poprzez zmiany intensywności fluorescencji biosensora. Obrazowanie biosensora jest zsynchronizowane z gromadzeniem ścieków z mikroperfuzji w celu późniejszej analizy wydzielania insuliny i glukagonu7. W porównaniu z makroperyfuzją, to podejście mikroperyfuzji pozwala na użycie mniejszej liczby pseudowysepek ze względu na mniejszą objętość urządzenia mikroprzepływowego w porównaniu z komorą makroperyfuzyjną7.
Aby wykorzystać użyteczność tego systemu, biosensor cyklicznego detektora różnic monofosforanu adenozyny (cAMP) in situ (cADDis) został wyrażony w ludzkich pseudowyspach w celu oceny dynamiki cAMP i wydzielania hormonów. Bioczujnik cADDis składa się z kolisto permutowanego białka zielonej fluorescencji (cpGFP) umieszczonego w obszarze zawiasowym białka wymiennego aktywowanego przez cAMP 2 (EPAC2), łącząc jego regiony regulacyjne i katalityczne. Wiązanie cAMP z regionem regulatorowym EPAC2 wywołuje zmianę konformacyjną w obszarze zawiasu, która zwiększa fluorescencję z cpGFP13. Przekaźniki wewnątrzkomórkowe, takie jak cAMP, wywołują wydzielanie insuliny i glukagonu po aktywacji receptorów sprzężonych z białkiem G14. Obrazowanie żywych komórek w połączeniu z mikroperyfuzją pomaga połączyć wewnątrzkomórkową dynamikę cAMP z wydzielaniem hormonu wysp trzustkowych. W szczególności w tym protokole generowane są pseudowysepki z ekspresją cADDis w celu monitorowania odpowiedzi cAMP w komórkach alfa i beta na różne bodźce: niski poziom glukozy (2 mM glukozy; G2), wysoka zawartość glukozy plus izobutylometyloksantyna (IBMX; 20 mM glukozy + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX) i niska glukoza plus epinefryna (Epi; 2 mM glukozy + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Ten przebieg leczenia pozwala na ocenę wewnątrzkomórkowej dynamiki cAMP bezpośrednio poprzez 1) hamowanie fosfodiesterazy za pośrednictwem IBMX, które zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom cAMP, zapobiegając jego degradacji, oraz 2) epinefrynę, znany zależny od cAMP stymulator wydzielania glukagonu w komórkach alfa, w którym pośredniczy aktywacja receptora β-adrenergicznego. Kroki konfiguracji aparatu do mikroperyfuzji do eksperymentów obrazowania żywych komórek, ładowanie pseudowysp do mikroprocesora, synchroniczne obrazowanie żywych komórek i mikroperyfuzja oraz analiza śladów biosensora i wydzielania hormonów za pomocą testów hormonalnych na mikropłytkach są szczegółowo opisane poniżej.

<table><tbody><tr><td>AD-CMV-cADDis</td><td>Welgen</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0,01" Rurki FEP</td><td>IDEX</td><td>1527L</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Wzbogacony CMRL Składnik mediów</td></tr><tr><td>1,5 ml i rurki stożkowe</td><td>Dowolne</td><td>10</td><td></td></tr><tr><td>&mu; m Filtr PTFE</td><td>Cole-Parmer</td><td>SK-21940-41</td><td>Zmieniaj co 8-10</td></tr><tr><td>przebiegów 100 mM Pirogronian sodu</td><td>Thermo Scientific</td><td>11360070</td><td>Wzbogacony CMRL Składnik mediów</td></tr><tr><td>190 proof Etanol</td><td>Decon labs</td><td>2816</td><td>Kwaśny składnik etanolowy</td></tr><tr><td>200 mM Suplement GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Wzbogacony CMRL Składnik mediów</td></tr><tr><td>Askorbinian</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td>Składnik bufora peryfuzyjnego DMEM</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A7888</td><td>Składnik bufora peryfuzyjnego DMEM</td></tr><tr><td>Pułapka bąbelkowa&nbsp;</td><td>Omnifit</td><td>006BT</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik komórkowy ULA&nbsp; 96-dołkowe mikropłytki</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055330</td><td></td></tr><tr><td>cellSens oprogramowanie do analizy</td><td>Olympus</td><td>v3.1</td><td>Oprogramowanie używane do analizy danych</td></tr><tr><td>CMRL 1066</td><td>MediaTech&nbsp;</td><td>15-110-CV</td><td>Wzbogacony CMRL Komponent Adapter</td></tr><tr><td>stożkowy (IDEX, P-794)</td><td>IDEX</td><td>P-794</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>Składnik buforu glukozy</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D5030</td><td>DMEM Składnik buforowy peryfuzji</td></tr><tr><td>Komora środowiskowa</td><td>okolab</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Epinepherine (Epi)</td><td>Sigma</td><td>E4250</td><td>Składnik buforowy stymulacji</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznie</td><td>Sigma</td><td>12306C</td><td>Wzbogacony CMRL Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Glukagon ELISA</td><td>Mercodia</td><td>10-1281-01</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw glukagonu HTRF</td><td>Cisbio</td><td>62CGLPEH</td><td></td></tr><tr><td>HCl (12N)</td><td>Dowolny</td><td></td><td>dowolny składnik kwasu etylowego</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7523</td><td>DMEM Składnik buforowy peryfuzyjny</td></tr><tr><td>iCell Śródbłonek Średni suplement</td><td>Cell Dynamics</td><td>M1019</td><td>iEC Składnik mediów</td></tr><tr><td>Idex Derlin nakrętka i skuwka 1/4-24</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-00414-LW</td><td></td></tr><tr><td>Insulina ELISA</td><td>Mercodia</td><td>10-1113-01</td><td></td></tr><tr><td>Izobutylometylonina (IBMX)</td> <td>Sigma</td><td>I5879</td><td>Składnik bufora stymulacji</td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV3000</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540</td> Mikrochip <td>buforowy do perfuzji DMEM</td></tr><tr><td>(Uniwersytet w Miami, FP-3W)</td><td>Uniwersytet w Miami</td><td>Uchwyt</td> na mikroczipy FP-3W<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Micronit Microfluidics</td><td>FC_PRO_CH4525</td><td></td></tr><tr><td>Model 2110 Kolektor frakcji</td><td>Biorad</td><td>7318122</td><td></td></tr><tr><td>pipety i końcówki P10, P200 i P1000</td><td>Dowolna</td><td>dowolna</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Wzbogacony CMRL Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna&nbsp;</td><td>Instech</td><td>P720</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Wash Islets</td></tr><tr><td>Naczynia Sarstedt</td><td>Sarstedt</td><td>zależy od średnicy</td><td></td>naczynia</tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td>DMEM Składnik buforowy peryfuzyjny</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>&nbsp; Komponent bufora peryfuzyjnego DMEM</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Filtr steriflip (0,22 &mu; m)</td> <td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Dwukrotnie filtruj wszystkie</td></tr><tr><td>VascuLife VEGF Medium Kompletny zestaw</td><td>LifeLine Cell Technology</td><td>LL-0003</td><td>iEC Media Component</td></tr></tbody></table>

ludzki system pseudowysp do synchronicznej oceny dynamiki biosensorów fluorescencyjnych i profili wydzielania hormonów

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

Wysepki trzustkowe Langerhansa, które są małymi zbiorami 3D wyspecjalizowanych komórek endokrynnych i podporowych rozsianych po całej trzustce, odgrywają kluczową rolę w kontroli homeostazy glukozy poprzez wydzielanie insuliny przez komórki beta, co obniża poziom glukozy we krwi, oraz glukagonu przez komórki alfa, co podnosi poziom glukozy we krwi. Wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe, w tym te, w których pośredniczy cAMP, mają kluczowe znaczenie dla regulowanego wydzielania hormonów komórek alfa i beta. Struktura 3D wysp trzustkowych, choć niezbędna do skoordynowanej funkcji wysp trzustkowych, stanowi wyzwanie eksperymentalne dla badań mechanistycznych wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych w pierwotnych ludzkich komórkach wysp trzustkowych. Aby przezwyciężyć te wyzwania i ograniczenia, protokół ten opisuje zintegrowaną platformę obrazowania żywych komórek i mikroprzepływową wykorzystującą pierwotne ludzkie pseudowyspy trzustkowe wygenerowane od dawców bez cukrzycy, które przypominają rodzime wyspy trzustkowe pod względem morfologii, składu i funkcji. Te pseudowysepki są kontrolowane pod względem wielkości w procesie dyspersji i reagregacji pierwotnych komórek ludzkich wysp trzustkowych. W stanie rozproszonym można manipulować ekspresją genów komórek wysp trzustkowych; Na przykład można wprowadzić bioczujniki, takie jak genetycznie kodowany bioczujnik cAMP, cADDis. Po uformowaniu pseudowysp wykazujących ekspresję genetycznie kodowanego biosensora, w połączeniu z mikroskopią konfokalną i platformą mikroperyfuzyjną, pozwalają na synchroniczną ocenę dynamiki biosensora fluorescencyjnego oraz profili wydzielania hormonów komórek alfa i beta, aby zapewnić lepszy wgląd w procesy i funkcje komórkowe.

Ludzkie pseudowysepki wykazujące ekspresję biosensora stworzono poprzez adenowiralną dostawę konstruktów kodujących biosensor cAMP cADDis (Rysunek 1A). Rysunek 1B przedstawia reagregację przetransdukowanych ludzkich komórek wysepek w czasie, przy czym w pełni uformowane pseudowysepki zaobserwowano po 6 dniach hodowli. Komórki zaczęły wykazywać widoczną fluorescencję cADDis w ciągu 48 h, a pod koniec okresu hodowli w przetransdukowanych komórkach stwierd...

Ten protokół opisuje metodę synchronicznego pozyskiwania i korejestracji wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych oraz wydzielania insuliny i glukagonu przez pierwotne ludzkie pseudowyspy za pomocą adenowirusowego dostarczania cyklicznego biosensora monofosforanu adenozyny (cAMP), detektora różnic cAMP in situ (cADDis) oraz systemu mikroperyfuzji.

Ludzki system pseudowysp do synchronicznej oceny dynamiki biosensorów fluorescencyjnych i profili wydzielania hormonów

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

Nasze laboratorium pracuje nad zrozumieniem, zapobieganiem i odwracaniem dysfunkcji komórek beta i innych nieprawidłowości wysp trzustkowych w cukrzycy typu 1 i typu 2. Nasze badania koncentrują się na patogenezie cukrzycy u ludzi, integrując badania nad biologią ludzkiej trzustki i wysp trzustkowych oraz zdrowiem i chorobą. Ludzkie wysepki są sferycznymi strukturami 3D, a dostęp do komórek w całej wysepce stanowi pewne wyzwanie eksperymentalne, na przykład podczas próby wprowadzenia bioczujników w celu zrozumienia sygnalizacji komórek wysp trzustkowych.Nasz protokół pseudowysp pozwala przezwyciężyć to wyzwanie, przeprowadzając manipulacje genetyczne w stanie pojedynczej komórki i reagregując te transdukowane ludzkie komórki wysp trzustkowych w pseudowyspy trzustkowe do dalszych badań. Nasz system pseudowysepek pozwala nam na ekspresję bioczujników na całej wysepce, a nie tylko na jej powierzchni. W połączeniu z naszym systemem obrazowania stylu życia i mikroperfuzji możemy zarówno mierzyć, jak i rejestrować dynamiczne procesy wewnątrzkomórkowe z dalszym wydzielaniem hormonów.Protokół ten może być zastosowany do udzielenia odpowiedzi na wiele ważnych pytań naukowych. Na przykład st

human-pseudoislet-system-for-synchronous-assessment-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowano mikrofluidyczne urządzenie do perifuzji wysepek trzustkowych w celu oceny dynamicznego wydzielania insuliny przez wiele wysepek oraz jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnego napływu jonów wapnia i zmian potencjału mitochondrialnego.

Wieloparametryczny system perfuzji wysepek w mikroprzepływowym urządzeniu perfuzyjnym

Tutaj opisujemy ustawienia do równoległego monitorowania bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich komórek wysp trzustkowych i pierwotnych miotub. W tym celu zastosowaliśmy dostarczanie genu lentiwirusowego za pomocą reportera zegara rdzeniowego lucyferazy, a następnie synchronizację in vitro i zbieranie pożywki odpływowej przez ciągłą peryfuzję komórek.

Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych hodowlach komórkowych człowieka

Opisujemy protokół wizualizacji egzocytozy insuliny w nienaruszonych wyspach trzustkowych za pomocą pHluoryny, wrażliwego na pH białka zielonej fluorescencji. Izolowane wysepki są zakażone adenowirusem kodującym pHluorynę sprzężoną z neuropeptydem Y ładunku pęcherzyka. Pozwala to na wykrycie zdarzeń fuzji granulek insuliny za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie konfokalne neuropeptydu Y-pHluorin: technika wizualizacji egzocytozy granulek insuliny w nienaruszonych mysich i ludzkich wyspach trzustkowych

Tutaj prezentujemy jednorodny FRET (HTRF) jako skuteczną metodę szybkiego wykrywania insuliny wydzielanej przez komórki.

Jednorodny, rozdzielczy w czasie test rezonansowy oparty na transferze energii Förstera do wykrywania wydzielania insuliny

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić szybkie, tanie testy lucyferazy przy średniej przepustowości przy użyciu lucyferazy Gaussia połączonej z insuliną jako wskaźnika wydzielania insuliny z komórek beta. Test można wykonać za pomocą większości czytników płytek luminescencyjnych i pipet wielokanałowych.

Pomiar względnego wydzielania insuliny za pomocą współwydzielanego surogatu lucyferazy

Ten protokół opisuje, jak generować ludzkie wycinki trzustki od zmarłych dawców narządów w celu badania funkcji komórek w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. To innowacyjne podejście umożliwia badanie normalnych i strukturalnie uszkodzonych wysp trzustkowych oraz skomplikowanych interakcji między przedziałami endokrynnymi i zewnątrzwydzielniczymi.

Generowanie wycinków ludzkiej tkanki trzustki w celu badania fizjologii endokrynnej i zewnątrzwydzielniczej trzustki

Wybór, mikroiniekcja i obrazowanie znakowanej fluorescencyjnie F-aktyny za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii plamkowej (FSM).

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy dynamiki F-aktyny za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii plamistej (FSM)

Opisujemy in vivo protokół obrazowania fluorescencyjnego służący do monitorowania regeneracji mięśni za pomocą mioblastów znakowanych białkiem GFP po transplantacji do mięśni szkieletowych myszy zdrowych oraz dystroficznych. Protokół ten można zaadaptować do badania regeneracji mięśni poprzez transplantację innych typów komórek, a także w innych stanach chorobowych mięśni.

Śledzenie dynamiki wszczepiania mięśni u małych zwierząt za pomocą obrazowania fluorescencyjnego in vivo

Opisano dwuetapowy proces znakowania z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (β-GT) w celu przeniesienia azydoglućkozy na 5-hmC, a następnie zastosowanie chemii klik w celu przeniesienia łącznika biotynowego dla łatwego i niezależnego od gęstości wzbogacenia. Ta wydajna i specyficzna metoda znakowania umożliwia wzbogacenie 5-hmC przy niezwykle niskim poziomie tła oraz wysokoprzepustowe mapowanie epigenomiczne za pomocą sekwencjonowania następnej generacji.

Selektywne wychwytywanie 5-hydroksymetylocytozyny z DNA genomowego

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę pseudowysp ludzkich do synchronicznej oceny biosensorów cAMP i profili wydzielania insuliny oraz glukagonu. Technika ta umożliwia badanie dynamiki sygnalizacji komórkowej w cukrzycy.

Ludzki system pseudowysp do synchronicznej oceny dynamiki biosensorów fluorescencyjnych i profili wydzielania hormonów

Przeglądaj więcej filmów