Wideo: Bioinformatyczna analiza wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Protokół ten demonstruje metodę bioinformatyki wideo do pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez analizę filmów poklatkowych zebranych w inkubatorze CT stacji biologicznej icon, wyposażonym w kamerę do obrazowania wideo. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste lub kolonie HESC są hodowane do 70% płynności CO, ponownie powlekane i inkubowane przez 48 godzin, po czym kolonie HESC są filmowane przez dodatkowe 48 godzin w Biot ct. Tempo wzrostu jest określane za pomocą ulepszenia segmentacji i receptur pomiarowych opracowanych za pomocą oprogramowania CL quant

Receptury są weryfikowane przez porównanie z Adobe Photoshop, narzędziem do analizy obrazu, które umożliwia precyzyjne ręczne dopasowanie maski do każdej kolonii. Rozwijająca się dziedzina bioinformatyki wideo może być wykorzystana do automatyzacji przetwarzania, analizy i eksploracji danych biologicznych z mikroskopijnych filmów wideo. Cześć, nazywam się Serena Lin i pracuję w laboratorium dr Prou Talbota na Wydziale Biologii Komórki i Neurologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside.

Cześć, nazywam się Sean Fino, również pracuję w Talbot Lab. Cześć, jestem TI Satish z Cell Molecular and Developmental Biology Graduate Program. Dzisiaj pokażemy Ci, jak mierzyć wzrost kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą narzędzi bioinformatycznych wideo.

Używamy tej procedury w naszym laboratorium do pomiaru wpływu toksyn środowiskowych na zachowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Zademonstrujemy tę procedurę w naszym nowym ośrodku komórek macierzystych. Więc zacznijmy.

Aby przygotować HESC do analizy wideo, hoduj HESC On na płytkach sześciodołkowych pokrytych matriżelem do uzyskania 70% zlewającego się podłoża aspiracyjnego z jednej studzienki zawierającej HESC i spłucz dwa razy jednym mililitrem PBS. Dodaj jeden mililitr Accutane i inkubuj przez minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Następnie dodaj 10 do 12 szklanych koralików do studzienki i delikatnie potrząśnij talerzem, aż kolonie całkowicie się oderwą.

Zneutralizuj Accutane za pomocą jednego mililitra ludzkiego embrionalnego utrzymania komórek macierzystych, pożywki lub pożywki kondycjonowanej mysimi fibroblastami embrionalnymi. Zebrać oderwane komórki bez kulek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwirować przy 200 G przez trzy minuty. Zdekantować natant SUP i rozbić osad za pomocą 500 mikrolitrów świeżej pożywki do konserwacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub płytki M-T-E-S-R, 100 mikrolitrów zawiesiny HESC kroplami do wielu dołków 12-dołkowej płytki pokrytej matryżelem.

Delikatnie kołysz płytką w przód iw tył i obserwuj kultury pod mikroskopem świetlnym, aby grudki komórek były równomiernie rozmieszczone w studzienkach. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni i 5% dwutlenku węgla na 48 godzin, aby upewnić się, że komórki są przymocowane płasko i wystarczająco duże, aby można je było łatwo uwidocznić. Po 48 godzinach odessać pożywkę i przemyć studzienki 500 mikrolitrami PBS w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek, a następnie dodać do każdej z nich 500 mikrolitrów pożywki M-T-E-S-R.

Cóż, natychmiast umieść płytkę w Biot CT i zacznij zbierać obrazy poklatkowe. Staraj się wybierać pola z dyskretnymi pojedynczymi koloniami, które prawdopodobnie nie wyrosną na inne kolonie. W tym protokole komórki są nagrywane wideo przez dodatkowe 48 godzin z klatkami w siedmiominutowych odstępach.

Aby najpierw utworzyć przepis na segmentację, ręcznie zeskanuj cały film, aby sprawdzić, czy zawiera on pojedynczą kolonię, która pozostaje skupiona przez cały okres nagrywania. Następnie otwórz kreatora segmentacji w oprogramowaniu CL quants i kliknij następny przycisk. Wybierz właściwy kanał obrazu i kliknij przycisk Dalej.

Wybierz dopasowanie miękkie i kliknij przycisk Dalej. Wybierz jeden lub dwa pożądane regiony, okrążając zewnętrzną krawędź do środkowego obszaru kolonii. Obszar ten powinien być jak najmniejszy, ale powinien być reprezentatywny dla całej kolonii.

Nie wybieraj zbyt wielu regionów, ponieważ może to spowodować niedokładną aplikację maski. Kliknij przycisk Dalej. Wybierz opcję Nie chcę regionów, zakreślając regiony, które nie są częścią kolonii i nie są częścią tła.

Regiony te mają wzorce, które należy stłumić, takie jak szczątki i martwe komórki. Kliknij Dalej. Wybierz tło, zakreślając obszary, które nie są koloniami, szczątkami ani martwymi komórkami.

Tło powinno być jednolite i z dużym prawdopodobieństwem pojawi się w każdej klatce. Zazwyczaj wybieramy szare tło wokół kolonii. Kliknij przycisk Dalej.

Kolorowa maska powinna być wyświetlana nad obszarem zainteresowania, jeśli maska nie zakrywa dokładnie obszaru zainteresowania. Zakres progu segmentacji w prawym dolnym rogu ekranu może zostać zwiększony lub zmniejszony, jeśli konieczna jest zmiana maski. Wybierz opcję aktualizuje nietrwale dopasowujące regiony.

Pozwala to na zmianę obszarów nie chcę lub tła. Jeśli maska jest zadowalająca, wybierz opcję zastosuj próg i zapisz moją maskę. Następnie kliknij następny przycisk.

Maska będzie wtedy wyświetlana w innym kolorze. Wybierz pozycję Zakończ. Receptura powinna być wyświetlana w prawym górnym rogu oprogramowania jako receptura segmentacji.

W razie potrzeby zmień nazwę przepisu, klikając prawym przyciskiem myszy i wprowadzając nową nazwę. Aby zastosować przepis. Kliknij prawym przyciskiem myszy i umieść kursor myszy.

Zastosuj przepis. Pojawi się menu umożliwiające wybór liczby ramek do użycia. Ustaw interwał klatek na co 20 klatek, aby zapewnić wierność maski.

Losowo ręcznie sprawdź wyrywkowo 10% ramek, na które nałożono maskę, aby stworzyć przepis wzmacniający, który eliminuje niechciane obszary w gruzach. Kliknij prawym przyciskiem myszy folder z przepisami ulepszającymi, a następnie kliknij przycisk Nowy. Nowa receptura ulepszenia powinna być wyświetlana z oryginalnego pola widzenia.

Najedź myszką na ikony na pasku narzędzi, aby zidentyfikować przycisk przełączania modułu ulepszania znajdujący się po prawej stronie obrazu i kliknij go. Wybierz menu rozwijane etykietowania. Wybierz etykietowanie dla połączonego, wybierz etykietowanie dla połączonych dwóch.

Powinien zostać wyświetlony nowy pasek zadań. Chwyć początkową maskę z przepisu segmentacji i przeciągnij ją do pola wprowadzania. Na pasku powinien teraz wyświetlać się numer maski wprowadzania.

Przeciągnij ikonę z numerem maski wprowadzania na ikonę maski zerowej. Znajdź minimalny rozmiar na pasku zadań i dostosuj liczbę, aż zostanie wyświetlony tylko obszar zainteresowania. Upewnij się, że kliknąłeś na wykonaj dla każdej próby dopasowania.

Gdy minimalna regulacja rozmiaru będzie zadowalająca, kliknij poprzedni przepis na ulepszenie u dołu ekranu, wybierz zapisz w przepisie. Oprogramowanie poprosi teraz o nadpisanie wybranej receptury i wybranie tak miejsca. Sprawdź recepturę ulepszenia, stosując tę samą procedurę, co w przypadku segmentacji kontroli wyrywkowej.

Jeśli są zadowoleni z przepisów na segmentację i ulepszenia, kontynuuj tworzenie szablonu pomiaru. Aby rozpocząć wybieranie, utwórz szablon pomiaru na pasku narzędzi po prawej stronie. W oknie pomiaru wybierz opcję przesuń kursor na figurę komórki clipart.

Przytrzymaj kontrolny i wybierz komórkę w sekcji morfologii, odznacz parametr domyślny i sprawdź parametr obszaru. Następnie zamknij okno szablonu. Wybierz ikonę.

Utwórz recepturę pomiaru. Zmień nazwę przepisu. Przejdź do zakładki szablonu i wybierz ją W prawym górnym rogu przeciągnij i upuść wcześniej utworzony szablon pomiaru na okno pomiaru.

Kliknij tak, aby kontynuować, w oknie receptury pomiaru wybierz mapowania kanałów. Następnie cała komórka zaznacza mapowania maski. Następnie wybierz opcję całej komórki Aby uzyskać ulepszoną maskę, wybierz przepis pomiaru pod zakładką przepisu.

W oknie głównym wybierz ikonę zapisu w oknie receptury pomiaru. Następnie zamknij okno Następnie zamknij i ponownie otwórz pole widzenia. Kliknij prawym przyciskiem myszy folder z listą przepisów, a następnie kliknij nowy przeciągnij przepisy w kolejności potrzebnej aplikacji na listę przepisów, wybierz zablokuj listę przepisów i uruchom przepisy sekwencyjnie na danych wideo za pomocą programu Adobe Photoshop.

Analizowano co 20 klatkę tych samych kolonii. Ręcznie otwórz klatkę obrazu kolonii w programie Adobe Photoshop. Kliknij narzędzie magicznej różdżki na pasku narzędzi.

Kliknij obszar wokół kolonii, aby pokryć całe pole z wyjątkiem regionu kolonii. Upewnij się, że przerywana linia wokół kolonii pasuje do jej obrzeża, a nie do jej wnętrza. Jeśli linia kropkowana nie znajduje się wokół obrzeża, zmień odpowiednio wartość tolerancji na górnym pasku narzędzi.

Kliknij edytuj w trybie szybkiej maski na pasku narzędzi i kliknij kolonię, aby kolonia została zaznaczona. Przejdź do okna, rozwiń menu i kliknij histogram. Pamięć podręczna powinna być ustawiona na jeden.

Jeśli pamięć podręczna składa się z dwóch, kliknij wykrzyknik znacznika wyrażenia, aby zmienić pamięć podręczną na jeden. Zapisz wartość pikseli w arkuszu kalkulacyjnym. Powtórz powyższy proces dla każdej 20 klatki.

Dane zebrane za pomocą programu Photoshop i oprogramowania CL quant można następnie wykreślić razem. Nasz protokół ilościowego określania wzrostu kolonii HESC demonstruje jedno zastosowanie bioinformatyki wideo do problemu biologicznego. Tutaj pokazujemy wykres porównujący wzrost wielkości kolonii w ciągu 48 godzin, określony za pomocą oprogramowania CL quant i Adobe Photoshop.

Wykres przedstawia pięć różnych kolonii, z których każda jest analizowana przez oba pakiety oprogramowania. Każda kolonia jest reprezentowana przez inny kolor. Linie ciągłe zostały wyprowadzone za pomocą oprogramowania do pomiaru wysokości żagli, podczas gdy linie przerywane zostały zebrane za pomocą Photoshopa.

Wykres surowych danych pokazuje, że obie metody pomiaru są zgodne z faktem, że kolonie mają różną wielkość początkową. Na tym rysunku przedstawiono dane ponownie wykreślone jako procentowy wzrost wielkości kolonii. Tempo wzrostu jest podobne niezależnie od początkowej wielkości kolonii i obie miary analizy dają podobne wyniki.

Poniższy wykres przedstawia średnie z poprzednich danych o zmianie procentowej wzrostu kolonii HESC. Ten wykres wyraźnie pokazuje dobrą zgodność między analizą wykonaną przy użyciu bioinformatyki wideo a Adobe Photoshop. Właśnie pokazaliśmy, jak mierzyć wzrost kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą narzędzi bioinformatycznych wideo.

Wykonując tę procedurę przy użyciu mikroskopii z kontrastem fazowym, pamiętaj o uwzględnieniu aureoli wokół kolonii w celu precyzyjnego wyboru kolonii przez oprogramowanie. Ważne jest również, aby pamiętać, że zamiast zademonstrowanego przez nas protokołu można zastosować inne metody hodowli, inkubacji i zbierania wideo. Po opracowaniu i walidacji receptur będą one przeprowadzać analizę znacznie szybciej i z mniejszą zmiennością eksperymentalną niż w przypadku analizy ręcznej.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.