Name: Wideo: Bioinformatyczna analiza wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Poznaj metodę bioinformatyczną do pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu analizy wideo poklatkowego. Automatyzacja przetwarzania danych biologicznych z mikroskopowych nagrań wideo usprawnia badania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opracowanie tej metody było możliwe dzięki finansowaniu z California Tobacco-Related Disease Research Program, California Institute for Regenerative Medicine oraz grantu NSF IGERT w zakresie Video Bioinformatics (#0903667) na UCR (<a href="http://www.cris.ucr.edu/IGERT/index.php">http://www.cris.ucr.edu/IGERT/index.php</a>). Sabrina Lin otrzymała wsparcie w ramach stypendium doktoranckiego Graduate Division, Shawn Forteno korzysta ze wsparcia stypendium NIH MARC, a Shruthi Satish ze wsparcia stypendium Graduate Division. Jesteśmy wdzięczni Annie Trtchounian za pomoc w przygotowaniu rycin. Dziękujemy również Samowi Alworthowi i Nedowi Jastrombowi za przeszkolenie nas w obsłudze oprogramowania CL-Quant.

Część 1: Procedura eksperymentalna
Dane wideo zawierają ogromną ilość informacji. Jednak informacje te są często trudne do wyodrębnienia, a ich manualna analiza przez ludzi może wymagać wielu godzin pracy personelu. Analiza manualna jest również podatna na błędy oraz różnice w interpretacji. Bioinformatyka wideo polega na wykorzystaniu oprogramowania komputerowego do wydobywania konkretnych danych z obrazów wideo. Ta metoda analizy jest szybka i pozwala wyeliminować błędy występujące podczas manualnej analizy przeprowadzanej przez ludzi. Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie metody ilościowego określania wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem metody bioinformatyki wideo.
W niniejszej pracy obrazy wideo time-lapse zostały zebrane przy użyciu jednostki inkubacyjnej Nikon BioStation CT, która umożliwia obrazowanie wielu pól komórek w czasie (Rys. 1). Metody opisane w tym raporcie mają zastosowanie do danych wideo zebranych za pomocą dowolnego zestawu do mikroskopii wideo.
W naszym projekcie eksperymentalnym wysialiśmy H9 hESC na 12-dołkowe płytki do hodowli tkanek na 48 godzin. W tym czasie kolonie mogły w pełni przytwierdzić się i rozprzestrzenić na Matrigelu. Następnie płytki z przytwierdzonymi koloniami hESC przeniesiono do BioStation CT i inkubowano przez kolejne 48 godzin. Podczas przebywania w BioStation obrazy kolonii były zbierane w odstępach 7-minutowych, a następnie wykorzystane do stworzenia sekwencji wideo time-lapse. Filmy dla każdej kolonii zostały poddane analizie w celu ilościowego określenia wzrostu kolonii przy użyciu receptur bioinformatyki wideo opracowanych w oprogramowaniu CL-Quant. Analizy wykonane za pomocą receptur stworzonych w oprogramowaniu CL-Quant zostały zweryfikowane pod kątem poprawności ręcznie w programie Adobe Photoshop.
Część 2: Przygotowanie przylegających kolonii hESC
<ol>
 <li>Hodować hESC na płytkach 6-dołkowych powlekanych Matrigel, a po osiągnięciu 70% konfluencji, przesianie zawartości jednego dołka płytki 6-dołkowej do 5 dołków powlekanej Matrigel płytki 12-dołkowej w następujący sposób.</li>
 <li>Odssać pożywkę z dołka zawierającego hESC.</li>
 <li>Przepłukać dołek 2x 1ml PBS.</li>
 <li>Dodać 1ml Accutase i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
 <li>Wprowadzić do dołka 10-12 szklanych kulek i delikatnie potrząsać płytką, aż kolonie całkowicie oddzielą się od dna dołka.</li>
 <li>Zneutralizować Accutase za pomocą 1ml pożywki mTeSR lub pożywki kondycjonowanej mEF.</li>
 <li>Odwirować zawiesinę komórkową w stożkowej probówce 15ml przy 200g przez 3 minuty.</li>
 <li>Odlać nadsącz i rozbić osad za pomocą 500μl świeżej pożywki mTeSR.</li>
 <li>Nakroplować 100μl zawiesiny hESC do każdego dołka w płytce 12-dołkowej.</li>
 <li>Delikatnie kołysać płytką w przód i w tył i obserwować hodowle pod mikroskopem świetlnym. Upewnić się, że skupiska komórek są równomiernie rozłożone na całej płytce.</li>
 <li>Umieścić płytkę 12-dołkową z powrotem w inkubatorze.</li>
 <li>Pozostawić hESC do przytwierdzenia i wzrostu na 48 godzin (można zastosować krótszy czas).</li>
 <li>Po 48 godzinach odlać pożywkę i przemyć dołki 500ul PBS, aby usunąć nieprzytwierdzone komórki.</li>
 <li>Dodać 1ml pożywki mTeSR do każdego dołka.</li>
 <li>Komentarz: Natychmiast umieścić płytkę w inkubatorze/mikroskopie w celu obrazowania wideo.</li>
 <li>Rozpocząć zbieranie obrazów time-lapse. Należy starać się wybierać pola z osobnymi, pojedynczymi koloniami, które nie będą miały tendencji do zrastania się z innymi koloniami.</li>
 <li>Zamiast powyższego protokołu można zastosować inne metody hodowli i przygotowania hESC.</li>
</ol>
Część 3: Bioinformatyka wideo
Oprogramowanie CL-Quant zostało wykorzystane do stworzenia trzech „przepisów”, które po uruchomieniu w sekwencji pozwolą określić liczbę pikseli lub powierzchnię w mikronach dla każdej kolonii w czasie. Trzy przepisy są zbudowane sekwencyjnie i w tym zastosowaniu obejmują segmentację, wzmocnienie obrazu oraz pomiar.
Analiza wzrostu kolonii hESC z wykorzystaniem oprogramowania CL-Quant/opracowywanie receptury:
<ol>
 <li>W pierwszej kolejności tworzy się recepturę segmentacji (segmentation recipe).</li>
 <li>Przeskanuj cały film, aby upewnić się, że materiał nadaje się do analizy. Sprawdź, czy cała kolonia pozostaje w polu widzenia i czy inne kolonie do niego nie wkraczają.</li>
 <li>Otwórz kreator segmentacji i kliknij przycisk „next”.</li>
 <li>Wybierz odpowiedni kanał obrazu (np. fazowy, zielony, czerwony itd.) i kliknij przycisk „next”.</li>
 <li>Z 3 dostępnych opcji wybierz „soft matching” i kliknij „next”.</li>
 <li>Zaznacz obszary pożądane („want”), obrysowując na obrazie regiony – zazwyczaj od zewnętrznej krawędzi kolonii do jej obszaru centralnego.
 <ul>
 <li>Obszar ten powinien być jak najmniejszy, ale reprezentatywny dla całej kolonii.</li>
 <li>Przy użyciu mikroskopii fazowej pamiętaj o uwzględnieniu halo wokół kolonii, aby oprogramowanie mogło precyzyjnie zaznaczyć kolonię.</li>
 <li>Wybierz 1 lub 2 obszary zainteresowania (ROI), które mogą wykazywać różne wzory pikseli w obrębie kolonii, ale nie wybieraj zbyt wielu obszarów „want”, co mogłoby doprowadzić do nieprawidłowego nałożenia maski.</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Kliknij przycisk „next”.</li>
 <li>Zaznacz obszary niepożądane („don't want”), obrysowując na obrazie regiony, które nie są częścią kolonii ani tła. Są to obszary o wzorach, które chcesz wyeliminować, zawierające piksele artefaktów, takich jak zanieczyszczenia i martwe komórki. Kliknij „next”.</li>
 <li>Zaznacz „tło” (background), obrysowując regiony, które chcesz wyeliminować.
 <ul>
 <li>Obszary „don't want” i „background” różnią się tym, że tło powinno być jednorodne i prawdopodobnie występować w każdej klatce.</li>
 <li>Zazwyczaj wybieramy szare tło wokół kolonii.</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Kliknij przycisk „next”.</li>
 <li>Nad obszarem zainteresowania powinna wyświetlić się kolorowa maska (Rys. 2A).</li>
 <li>Jeśli maska nie pokrywa dokładnie obszaru zainteresowania, można zwiększyć lub zmniejszyć zakres progu segmentacji (znajdujący się w prawym dolnym rogu ekranu oprogramowania).</li>
 <li>Kreator segmentacji może poprosić o dalsze doprecyzowanie obszaru maski, jeśli jest to konieczne.</li>
 <li>Jeśli chcesz zmienić maskę, wybierz „update soft matching regions”. Pozwala to na zmianę obszarów „want”, „don't want” lub „background”.</li>
 <li>Jeśli maska jest zadowalająca, wybierz „apply threshold and save my mask” i kliknij przycisk „next”.</li>
 <li>Maska zostanie wówczas wyświetlona w innym kolorze.</li>
 <li>Wybierz „finish”.</li>
 <li>Receptura powinna wyświetlić się w prawym górnym rogu oprogramowania pod nazwą „segmentation recipe”.</li>
 <li>Jeśli chcesz, zmień nazwę receptury, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając „rename”.</li>
 <li>Aby przeprowadzić kontrolną weryfikację, kliknij prawym przyciskiem myszy i najedź kursorem na „apply recipe”.</li>
 <li>Pojawi się menu umożliwiające wybranie liczby klatek, których chcesz użyć do weryfikacji receptury. Uruchom recepturę co 10 klatek, aby sprawdzić dokładność rozmieszczenia maski.</li>
 <li>Jeśli maska obejmuje fragmenty niewielkich niepożądanych obszarów lub zanieczyszczeń, możesz utworzyć „recepturę ulepszenia” (enhancement recipe), aby lepiej dopasować maskę do obszaru zainteresowania.</li>
 <li>Aby utworzyć recepturę ulepszenia, kliknij prawym przyciskiem myszy folder „enhancement recipe”, a następnie kliknij „new”. Powinna wyświetlić się nowa receptura ulepszenia.</li>
 <li>W oryginalnym polu widzenia (FOV) kliknij przycisk „toggles enhancement module” znajdujący się po prawej stronie obrazu. Najedź kursorem na ikony na pasku narzędzi, aby zidentyfikować właściwy przycisk.</li>
 <li>Otwórz menu rozwijane „labeling”.</li>
 <li>Wybierz „labeling 4 connected”.</li>
 <li>Wybierz „labeling 4 connected2”.</li>
 <li>Powinien wyświetlić się nowy pasek zadań.</li>
 <li>Pobierz początkową maskę (mask0) z receptury segmentacji i przeciągnij ją do pola „input”.</li>
 <li>Na pasku powinien teraz pojawić się napis „input mask #”.</li>
 <li>Przeciągnij ikonę z napisem „input mask #” na ikonę maski 0.</li>
 <li>Znajdź opcję „min size” na pasku zadań i reguluj wartość, aż wyświetli się tylko obszar zainteresowania. Pamiętaj, aby klikać „execute” po każdej próbie dopasowania.</li>
 <li>Gdy uznasz regulację minimalnego rozmiaru za zadowalającą, kliknij w utworzoną wcześniej „recepturę ulepszenia” (Rys. 2B).</li>
 <li>Na dole ekranu wybierz „save to recipe”.</li>
 <li>Oprogramowanie zapyta „overwrite selected recipe?”, wybierz „yes”.</li>
 <li>Przeprowadź kontrolną weryfikację receptury ulepszenia, stosując te same procedury, co w przypadku weryfikacji segmentacji.</li>
 <li>Jeśli jesteś zadowolony z receptur segmentacji i ulepszenia, wybierz „create measurement template” na prawym pasku narzędzi.</li>
 <li>Jeśli chcesz, zmień nazwę szablonu.</li>
 <li>W oknie szablonu pomiarowego najedź kursorem na grafikę komórki. Przytrzymaj klawisz Ctrl i zaznacz komórkę.</li>
 <li>Odznacz „default parameter” i zaznacz „area parameter” w sekcji „morphology”.</li>
 <li>Wyjdź z okna „template”.</li>
 <li>Wybierz ikonę utworzoną w recepturze pomiarowej.</li>
 <li>Zmień nazwę receptury.</li>
 <li>Przejdź do karty „template” w prawym górnym rogu i zaznacz ją.</li>
 <li>Przeciągnij wcześniej utworzony szablon pomiarowy do okna pomiarowego.</li>
 <li>Kliknij „Yes”, aby kontynuować.</li>
 <li>W oknie receptury pomiarowej wybierz „Channel mappings”, a następnie „Whole cell”.</li>
 <li>Wybierz „Mask mappings”.</li>
 <li>Następnie wybierz opcję „Whole cell” dla ulepszonej maski (enhanced mask).</li>
 <li>W oknie głównym, w karcie Recipe, wybierz „Measurement recipe”.</li>
 <li>W oknie receptury pomiarowej wybierz ikonę „Save”.</li>
 <li>Następnie zamknij okno.</li>
 <li>Teraz zamknij i ponownie otwórz „FOV”.</li>
 <li>Kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę „Recipe”, wybierz „Lock recipe list” i uruchom receptury sekwencyjnie na danych wideo.</li>
</ol>
Część 4: Sprawdzanie dokładności receptury przy użyciu oprogramowania Photoshop
Aby zwalidować recepturę stworzoną za pomocą (CL-Quant software), te same dane można przeanalizować ręcznie w programie Adobe Photoshop. W tej analizie analizowano co dziesiątą klatkę (każdy punkt czasowy co 70 min), aby zmierzyć wielkość kolonii w ciągu 48 godzin.
<ol>
 <li>Otwórz klatkę obrazu kolonii w programie Adobe Photoshop.</li>
 <li>W pasku narzędzi kliknij narzędzie Magic Wand (Różdżka).</li>
 <li>Kliknij obszar wokół kolonii, tak aby zaznaczone zostało całe pole z wyjątkiem regionu kolonii.</li>
 <li>W pasku narzędzi wybierz opcję „Edit in Quick Mask Mode” (Edytuj w trybie szybkiej maski) i kliknij kolonię, aby została zaznaczona.</li>
 <li>Upewnij się, że przerywana linia wokół kolonii ściśle przylega do jej obwodu, a nie znajduje się wewnątrz niej. Jeśli przerywana linia nie przebiega wzdłuż obwodu, odpowiednio zmień wartość tolerancji w górnym pasku narzędzi.</li>
 <li>Z rozwijanego menu „Window” (Okno) wybierz opcję „Histogram”.</li>
 <li>Zapisz wartość piksela dla cache=1. Jeśli cache wynosi 2, kliknij znak „!”, aby zmienić go na cache 1, a następnie zanotuj wartość piksela.</li>
 <li>Powtórz powyższy proces dla co dziesiątej klatki. W razie potrzeby można wykorzystać mniejszą liczbę klatek.</li>
 <li>Dane zebrane za pomocą programu Photoshop oraz oprogramowania CL-Quant można następnie nanieść na wspólny wykres. Jeśli receptury CL-Quant są prawidłowe, krzywe dla analizy w Photoshopie i CL-Quant powinny być bardzo zbliżone (Rys. 3-5).</li>
 <li>Jeśli receptury opracowane w programie CL-Quant są prawidłowe, można je niezawodnie zastosować do innych danych wideo.</li>
 <li>Wartością dodaną zastosowania bioinformatyki wideo w tej analizie jest fakt, że po opracowaniu i walidacji receptur segmentacji, wzmocnienia i pomiaru, analiza zostanie przeprowadzona znacznie szybciej i dokładniej niż przez człowieka korzystającego z programu Photoshop.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig1.jpg" alt="Mikroskopia timelapse, podział komórek, sekwencja 6 klatek, wizualizacja procesu biologicznego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1: Pas klatek z kolonii hESC przedstawiający obrazy z różnych momentów w ciągu 48 godzin wzrostu w systemie BioStation CT. Klatki były rejestrowane w odstępach 7 minut.
<img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig2.jpg" alt="Obrazy mikroskopowe, fluorescencyjne barwienie komórek, obraz A w kolorze niebieskim, obraz B w kolorze zielonym, identyfikacja komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2: (A) Obraz hESC z maską nałożoną na kolonię przez algorytm segmentacji. Obszary z zanieczyszczeniami i tło są również zamaskowane, co wskazuje na konieczność zastosowania algorytmu ulepszania obrazu w celu zwiększenia dokładności oceny. (B) Obraz tej samej kolonii co w punkcie „A” po przeprowadzeniu ulepszania. Maska zaznacza teraz wyłącznie kolonię, a szum został usunięty z zaznaczenia.
<img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig3.jpg" alt="Analiza powierzchni kolonii, CL-Quant vs Photoshop, wykres porównujący powierzchnię w pikselach w funkcji numerów klatek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3: Wykres przedstawiający wzrost wielkości kolonii (w pikselach) w ciągu 48 godzin, określony przy użyciu oprogramowania CL-Quant oraz programu Photoshop. Wykres ten przedstawia surowe dane i pokazuje, że kolonie startują z różnych wielkości. Wykazuje on również, że obie metody pomiaru są ze sobą zgodne.
<img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig4.jpg" alt="Wykres wzrostu powierzchni kolonii, CL-Quant w porównaniu z Photoshop, przedstawiający procentową zmianę w funkcji numeru klatki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4: Wykres przedstawiający te same dane co na Rysunku 3 po normalizacji, ukazujący procentowy wzrost wielkości kolonii w ciągu 48 godzin. Wykazuje to, że tempo wzrostu jest podobne niezależnie od początkowej wielkości kolonii i że obie metody analizy dają zbliżone wyniki.
<img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig5.jpg" alt="Wykres analizy powierzchni kolonii, CL-Quant vs. Photoshop, procentowa zmiana całkowitej powierzchni w czasie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> Rysunek 5: Wykres przedstawiający średnie dla znormalizowanych danych z Rysunku 4. Wykres ten wyraźnie pokazuje dobrą zgodność między analizami wykonanymi za pomocą bioinformatyki wideo (oprogramowanie CL-Quant) a programem Photoshop i potwierdza rzetelność metody. Lekki spadek powierzchni dla danych z programu Photoshop w klatce 325 wynika z pominięcia kilku filmów w analizie przeprowadzonej w Photoshopie.

Narzędzia bioinformatyki wideo są niezwykle skuteczne w szybkim wydobywaniu danych z obrazów wideo. Nasz protokół ilościowego oznaczania wzrostu kolonii hESC demonstruje jedno z zastosowań bioinformatyki wideo w problematyce biologicznej. Metoda ta jest ilościowa i posiada interesującą cechę polegającą na ujawnianiu danych z poszczególnych kolonii hESC. Procedury bioinformatyki wideo mogą zostać opracowane w celu monitorowania innych procesów komórkowych, takich jak proliferacja, migracja, apoptoza, przyleganie komórek d...

<table><tbody><tr><td>Pożywka podtrzymująca ludzkie embrionalne komórki macierzyste mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05850</td><td>lub dowolna inna odpowiednia pożywka do hodowli hESC.</td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>lub inny odpowiedni substrat.</td></tr><tr><td>Podstawowa pożywka DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny bez Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; i Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do odrywania komórek z enzymem Accutase</td><td>eBioscience</td><td>00-4555-56</td><td>lub inny odpowiedni enzym do odrywania.</td></tr><tr><td>Szklane kuleczki 3mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-312A</td><td>opcjonalnie.</td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki do hodowli tkanek</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td>lub dowolny inny format płytki.</td></tr><tr><td>Nikon BioStation CT/IM</td><td></td><td></td><td>lub inny inkubator/mikroskop odpowiedni do gromadzenia danych wideo.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CL-Quant (Nikon) i/lub Photoshop (Adobe).</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bioinformatyczna analiza wideo wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Ponieważ dane wideo są złożone i składają się z wielu obrazów, wydobywanie z nich informacji jest trudne bez wsparcia oprogramowania komputerowego. Bioinformatyka wideo stanowi potężne podejście ilościowe do ekstrakcji danych czasowo-przestrzennych z obrazów wideo, wykorzystujące oprogramowanie komputerowe do eksploracji i analizy danych. W niniejszym artykule przedstawiamy metodę bioinformatyki wideo służącą do ilościowego pomiaru wzrostu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) poprzez analizę filmów time-lapse zarejestrowanych w inkubatorze Nikon BioStation CT wyposażonym w kamerę do obrazowania wideo. W naszych eksperymentach kolonie hESC przyczepione do Matrigelu były filmowane przez 48 godzin w urządzeniu BioStation CT. W celu określenia tempa wzrostu tych kolonii opracowano procedury w oprogramowaniu CL-Quant, które umożliwia użytkownikom ekstrakcję różnych typów danych z obrazów wideo. Aby precyzyjnie ocenić wzrost kolonii, stworzono trzy procedury. Pierwsza segmentowała obraz na kolonię i tło, druga poprawiała obraz w celu dokładnego zdefiniowania kolonii w całej sekwencji wideo, a trzecia mierzyła liczbę pikseli w kolonii w czasie. Trzy procedury były uruchamiane sekwencyjnie na danych wideo zebranych w BioStation CT, aby przeanalizować tempo wzrostu poszczególnych kolonii hESC w ciągu 48 godzin. W celu weryfikacji rzetelności procedur CL-Quant te same dane analizowano ręcznie przy użyciu oprogramowania Adobe Photoshop. Po porównaniu danych uzyskanych za pomocą procedur CL-Quant i programu Photoshop wyniki okazały się niemal identyczne, co wskazuje na rzetelność procedur CL-Quant. Opisana tutaj metoda może być zastosowana do dowolnych danych wideo w celu pomiaru tempa wzrostu hESC lub innych komórek rosnących w koloniach. Ponadto w przyszłości można opracować inne procedury bioinformatyki wideo dla pozostałych procesów komórkowych, takich jak migracja, apoptoza i adhezja komórkowa.

Bioinformatyka wideo to zautomatyzowane przetwarzanie, analiza, interpretacja i eksploracja danych biologicznych czasowo-przestrzennych wyekstrahowanych z filmów mikroskopowych. Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie metody pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem metody bioinformatyki wideo.

Bioinformatyczna analiza wideo wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ponieważ dane wideo są złożone i składają się z wielu obrazów, wydobywanie informacji z materiałów wideo jest trudne do zrealizowania bez pomocy komputera...

Niniejszy protokół przedstawia bioinformatyczną metodę wideo do pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez analizę filmów time-lapse zarejestrowanych w inkubatorze icon bio station CT, wyposażonym w kamerę do obrazowania wideo. Kolonie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HESC) są hodowane do 70% konfluencji, przesiewane i inkubowane przez 48 godzin, po czym kolonie HESC są filmowane przez kolejne 48 godzin w urządzeniu Biot ct. Szybkość wzrostu jest określana przy użyciu ulepszonej segmentacji i procedur pomiarowych opracowanych w oprogramowaniu CL quant.Procedury zostały zwalidowane poprzez porównanie z programem Adobe Photoshop, narzędziem do analizy obrazu, które umożliwia precyzyjne ręczne dopasowanie masek do każdej kolonii. Rozwijająca się dziedzina bioinformatyki wideo może być wykorzystana do automatyzacji przetwarzania, analizy i wydobywania danych biologicznych z filmów mikroskopowych. Cześć, nazywam się Serena Lin i pochodzę z laboratorium dr. Prou Talbota w Katedrze Biologii Komórki i Neuronauki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside.Cześć, jestem Sean Fino, również z laboratorium Talbot. Cześć, jestem TI Satish z programu studiów doktoranckich w zakresie biologii komórkowej, molekularnej i rozwojowej. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak mierzyć wzrost kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu narzędzi bioinformatyki wideo.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu pomiaru wpływu toksyn środowiskowych na zachowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Zademonstrujemy tę procedurę w naszym nowym centrum zasobów komórek macierzystych. Zatem zacznijmy.Aby przygotować HESC do analizy wideo, należy hodować HESC na płytkach sześciodołkowych pokrytych matrigelem do uzyskania 70% konfluencji, odessać medium z jednego dołka zawierającego HESC i przepłukać go dwukrotnie 1 mL PBS. Następnie dodać 1 mL Accutane i inkubować przez jedną minutę w temperaturze 37°C w 5% CO2. Następnie do dołka należy dodać od 10 do 12 szklanych kulek i delikatnie potrząsać płytką, aż kolonie całkowicie się odłączą.Zneutralizuj Accutane, używając jednego mililitra pożywki do utrzymania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub pożywki warunkowanej fibroblastami embrionalnymi myszy. Zbierz oddzielone komórki bez kulek do probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów i wiruj przy 200 G przez trzy minuty. Odlej nadsącz i rozbij osad 500 mikrolitrami świeżej pożywki do utrzymania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub M-T-E-S-R. Nalej po 100 mikrolitrów zawiesiny HESC kroplami do wielu studzienek płytki 12-studzienkowej powlekanej Matrigelem.Delikatnie kołysz płytkę w przód i w tył, a następnie obserwuj hodowle pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że agregaty komórkowe są równomiernie rozłożone w dołkach. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide na 48 godzin, aby zapewnić płaskie przytwierdzenie komórek i ich odpowiedni wzrost umożliwiający łatwą wizualizację. Po 48 godzinach odessać pożywkę i przemyć dołki 500 µL PBS w celu usunięcia nieprzytwierdzonych komórek, a następnie dodać do każdego dołka 500 µL pożywki M-T-E-S-R.Natychmiast umieść płytkę w urządzeniu Biot CT i rozpocznij zbieranie obrazów time-lapse. Staraj się wybierać pola z pojedynczymi, odizolowanymi koloniami, które prawdopodobnie nie zrosną się z innymi koloniami. W niniejszym protokole komórki są rejestrowane wideo przez dodatkowe 48 godzin z odstępami siedmiominutowymi między klatkami.Aby najpierw stworzyć recepturę segmentacji, należy ręcznie przejrzeć cały film, aby upewnić się, że zawiera on pojedynczą kolonię, która pozostaje w ostrości przez cały okres nagrywania. Następnie należy otworzyć kreator segmentacji w oprogramowaniu CL quants i kliknąć przycisk „next”. Należy wybrać odpowiedni kanał obrazu i kliknąć przycisk „next”.Wybierz opcję soft matching i kliknij Next. Zaznacz jeden lub dwa interesujące obszary, obrysowując krawędź zewnętrzną aż do centralnej części kolonii. Obszar ten powinien być jak najmniejszy, ale reprezentatywny dla całej kolonii.Nie wybieraj zbyt wielu obszarów, ponieważ może to doprowadzić do niedokładnego nałożenia maski. Kliknij przycisk „Dalej”. Wybierz opcję „Nie chcę obszarów”, obrysowując fragmenty, które nie stanowią części kolonii ani tła.Obszary te zawierają wzorce, które należy wyeliminować, takie jak zanieczyszczenia i martwe komórki. Kliknij Dalej. Wybierz tło, zaznaczając okręgiem obszary, które nie są koloniami, zanieczyszczeniami ani martwymi komórkami.Tło powinno być jednolite i prawdopodobnie występować w każdej klatce. Zazwyczaj wybieramy szare tło wokół kolonii. Kliknij przycisk „Dalej”.Jeśli maska nie pokrywa dokładnie obszaru zainteresowania, nad obszarem tym powinna wyświetlić się kolorowa maska. Zakres progu segmentacji w prawym dolnym rogu ekranu można zwiększyć lub zmniejszyć, jeśli wymagana jest zmiana maski. Wybierz opcję aktualizacji obszarów dopasowania miękkiego.Pozwala to na zmianę obszarów pożądanych, niepożądanych lub tła. Jeśli maska jest satysfakcjonująca, wybierz opcję zastosuj próg (apply threshold) oraz zapisz moją maskę (save my mask). Następnie kliknij przycisk dalej.Maska zostanie następnie wyświetlona w innym kolorze. Wybierz opcję finish. Przepis powinien zostać wyświetlony w prawym górnym rogu oprogramowania jako segmentation recipe.W razie potrzeby zmień nazwę przepisu, klikając prawym przyciskiem myszy i wprowadzając nową nazwę. Aby zastosować przepis, kliknij prawym przyciskiem myszy i najedź kursorem.Zastosuj recepturę. Pojawi się menu umożliwiające wybór liczby klatek do wykorzystania. Ustaw interwał klatek na co 20 klatek, aby zapewnić wierność maski.Przeprowadź losową, ręczną kontrolę 10% klatek, do których zastosowano maskę, aby stworzyć przepis wzmocnienia (enhancement recipe) eliminujący niepożądane obszary w pozostałościach. Kliknij prawym przyciskiem myszy folder z przepisami wzmocnienia, a następnie wybierz opcję „Nowy”. Nowy przepis wzmocnienia powinien zostać wyświetlony na podstawie oryginalnego pola widzenia.Najedź kursorem myszy na ikony na pasku narzędzi, aby zidentyfikować przycisk przełączania modułu ulepszeń znajdujący się po prawej stronie obrazu, a następnie kliknij go. Wybierz rozwijane menu etykietowania. Wybierz etykietowanie dla połączonych, wybierz etykietowanie dla połączonych dwóch.Powinien pojawić się nowy pasek zadań. Pobierz początkową maskę z przepisu segmentacji i przeciągnij ją do pola wejściowego. Pasek powinien teraz wyświetlać numer maski wejściowej.Przeciągnij ikonę z numerem maski wejściowej do ikony maski zero. Znajdź opcję min size w pasku zadań i dostosuj liczbę, aż zostanie wyświetlony tylko obszar zainteresowania. Pamiętaj, aby klikać przycisk execute przy każdej próbie dopasowania.Gdy regulacja minimalnego rozmiaru będzie satysfakcjonująca, kliknij poprzedni przepis wzmacniania u dołu ekranu i wybierz opcję zapisz w przepisie. Oprogramowanie wyświetli teraz monit o nadpisanie wybranego przepisu; wybierz tak. Sprawdź przepis wzmacniania, stosując tę samą procedurę, co w przypadku weryfikacji segmentacji plamek.Jeśli wyniki segmentacji i ulepszania obrazu są satysfakcjonujące, przejdź do tworzenia szablonu pomiarowego. Aby rozpocząć, wybierz opcję create measurement template na prawym pasku narzędzi. W oknie pomiarów przesuń kursor nad grafikę komórki.Przytrzymaj klawisz Ctrl i zaznacz komórkę w sekcji morfologii, odznacz parametr domyślny i zaznacz parametr pola. Następnie wyjdź z okna szablonu. Wybierz ikonę.Utwórz recepturę pomiarową. Zmień nazwę receptury. Przejdź do karty szablonów i wybierz ją. W prawym górnym rogu przeciągnij i upuść wcześniej utworzony szablon pomiarowy do okna pomiarowego.Kliknij tak, aby kontynuować w oknie receptury pomiarowej, a następnie wybierz mapowanie kanałów. Następnie wybierz mapowanie masek dla całych komórek. Następnie wybierz opcję całych komórek. Aby uzyskać ulepszoną maskę, wybierz recepturę pomiarową w karcie receptury.W głównym oknie wybierz ikonę zapisu w oknie przepisu pomiarowego. Następnie zamknij okno. Potem zamknij i ponownie otwórz pole widzenia. Kliknij prawym przyciskiem myszy folder listy przepisów, a następnie kliknij „nowy” i przeciągnij przepisy w kolejności ich wymagania do listy przepisów, wybierz opcję blokowania listy przepisów i uruchom przepisy sekwencyjnie na danych wideo przy użyciu programu Adobe Photoshop.Przeanalizowano co dwudziestą klatkę obrazu tych samych kolonii. Ręcznie otwórz klatkę obrazu kolonii w programie Adobe Photoshop. Kliknij narzędzie różdżka w pasku narzędzi.Kliknij obszar wokół kolonii, tak aby cały obszar był zaznaczony z wyjątkiem regionu kolonii. Upewnij się, że przerywana linia wokół kolonii ściśle przylega do jej obwodu, a nie znajduje się wewnątrz niej. Jeśli przerywana linia nie pokrywa się z obwodem, odpowiednio zmień wartość tolerancji w górnym pasku narzędzi.Kliknij przycisk edycji w trybie szybkiej maski na pasku narzędzi, a następnie kliknij kolonię, aby została zaznaczona. Przejdź do menu rozwijanego w oknie i wybierz histogram. Pamięć podręczna powinna być ustawiona na wartość jeden.Jeśli wartość cache wynosi dwa, kliknij znak wykrzyknika przy wyrażeniu, aby zmienić wartość cache na jeden. Zapisz wartość piksela w arkuszu kalkulacyjnym. Powtórz powyższy proces dla każdej 20. klatki.Dane zebrane przy użyciu oprogramowania Photoshop i CL quant można następnie nanieść na wspólny wykres. Nasz protokół ilościowego oznaczania wzrostu kolonii HESC demonstruje jedno z zastosowań bioinformatyki wideo w problematyce biologicznej. Poniżej przedstawiamy wykres porównujący przyrost wielkości kolonii w ciągu 48 godzin, wyznaczony przy użyciu oprogramowania CL quant oraz programu Adobe Photoshop.Wykres przedstawia pięć różnych kolonii, z których każda została przeanalizowana za pomocą obu pakietów oprogramowania. Każda kolonia jest reprezentowana przez inny kolor. Linie ciągłe zostały wyznaczone przy użyciu oprogramowania sail quant, natomiast linie przerywane zostały wyznaczone przy użyciu programu Photoshop.Wykres surowych danych pokazuje, że obie metody pomiaru są ze sobą zgodne, biorąc pod uwagę fakt, że kolonie mają różną wielkość początkową. Na niniejszej rycinie dane przedstawiono ponownie jako procentowy wzrost wielkości kolonii. Szybkości wzrostu są zbliżone niezależnie od początkowej wielkości kolonii, a obie metody analizy dają podobne wyniki.Poniższy wykres przedstawia wartości średnie z poprzednich danych dotyczących procentowej zmiany wzrostu kolonii HESC. Wykres ten wyraźnie wskazuje na dobrą zgodność między analizą przeprowadzoną przy użyciu bioinformatyki wideo a programem Adobe Photoshop. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem narzędzi bioinformatyki wideo.Podczas wykonywania tej procedury z użyciem mikroskopii kontrastowej należy upewnić się, że w obrazie znajduje się halo wokół kolonii, co umożliwi precyzyjną selekcję kolonii przez oprogramowanie. Należy również pamiętać, że zamiast zaprezentowanego protokołu można zastosować inne metody hodowli, inkubacji i rejestracji wideo. Po opracowaniu i walidacji skryptów analiza będzie przebiegać znacznie szybciej i z mniejszą zmiennością doświadczalną niż w przypadku analizy manualnej.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

video-bioinformatics-analysis-human-embryonic-stem-cell-colony

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza bioinformatyczna wideo wzrostu kolonii ludzkich komórek macierzystych zarodkowych

Niniejszy protokół wideo demonstruje sposób rozróżniania i zliczania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego w mieszanej populacji komórek prekursorowych układu nerwowego z wykorzystaniem testu tworzenia kolonii neuronalnych.

Test tworzenia kolonii neuronalnych: metoda różnicowania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego od komórek progenitorowych układu nerwowego

Pomimo podejmowanych wysiłków w celu przejścia na warunki hodowli bez komórek podporowych, izolacja i hodowla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) pozostają w dużej mierze zależne od kokultur z embrionalnymi fibroblastami mysimi (MEFs). W niniejszej pracy przedstawiamy nową metodologię szybkiego usuwania komórek podporowych z kultur hESC przed przystąpieniem do eksperymentów.

Szybkie usuwanie fibroblastów z gęstych kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

To badanie opisuje eksperymentalną platformę do szybkiego charakteryzowania zmodyfikowanych komórek macierzystych i ich zachowań przed ich zastosowaniem w długoterminowych badaniach nad przeszczepami in vivo w celu ratowania i naprawy układu nerwowego.

Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Protokół przedstawiony w tym badaniu opisuje metody monitorowania postępu przeprogramowania w czasie rzeczywistym poprzez pomiar kinetyczny dodatnich i ujemnych markerów pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Protokół obejmuje również obrazową ocenę morfologii oraz ekspresję markera lub reportera podczas generowania iPSC.

Pomiar kinetyczny i wizualizacja przeprogramowania somatycznego w czasie rzeczywistym

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Pierwotne komórki rozrodcze (PGC) są powszechnymi prekursorami zarówno plemników, jak i jaj. Ludzkie embrionalne PGC są określane z pluripotencjalnych komórek epiblastów poprzez interakcje cytokin. Tutaj opisujemy 13-dniowy protokół indukcji komórek ludzkich transkryptomalnie przypominających PGC na powierzchni ciał zarodkowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją.

Wytwarzanie ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych podobnych do komórek rozrodczych na powierzchni ciał embrionalnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją

Ligandy macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na podatnych podłożach. Metodę tę można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami biochemicznymi w celu zbadania wzajemnych zależności między geometrią tkanki, siłami generowanymi przez komórkę i specyfikacją losu.

Modelowanie geometrii kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podatnych podłożach w celu kontrolowania mechaniki na poziomie tkankowym

Fenotypy wzrostu drożdży są precyzyjnie mierzone za pomocą wysoce równoległego obrazowania poklatkowego unieruchomionych komórek rosnących w mikrokolonie. Jednocześnie można monitorować tolerancję na stres, ekspresję białek i lokalizację białek, generując zintegrowane zestawy danych w celu zbadania, w jaki sposób różnice środowiskowe i genetyczne, a także niejednorodność ekspresji genów wśród komórek izogenicznych, modulują wzrost.

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

Przedstawiamy tutaj metodę analizy obrazowania żywych komórek, którą można wykorzystać do ręcznego śledzenia linii keratynocytów przejścia 0 oraz umożliwia zbieranie metryk proliferacji, w tym losów podziału komórkowego i czasu trwania cyklu komórkowego.

Obrazowanie żywych komórek z użyciem fotografii poklatkowej do badania kinetyki proliferacji keratynocytów naskórka

Poznaj metodę bioinformatyczną do pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu analizy wideo poklatkowego. Automatyzacja przetwarzania danych biologicznych z mikroskopowych nagrań wideo usprawnia badania.

Bioinformatyczna analiza wideo wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów