Wideo: Bioinformatyczna analiza wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych
20 maja 2010
Bioinformatyka wideo to zautomatyzowane przetwarzanie, analiza, zrozumienie i eksploracja danych biologicznych przestrzenno-czasowych wydobytych z mikroskopijnych filmów. Celem artykułu jest przedstawienie metody pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą metody bioinformatyki wideo.
Protokół ten demonstruje metodę bioinformatyki wideo do pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez analizę filmów poklatkowych zebranych w inkubatorze CT stacji biologicznej icon, wyposażonym w kamerę do obrazowania wideo. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste lub kolonie HESC są hodowane do 70% płynności CO, ponownie powlekane i inkubowane przez 48 godzin, po czym kolonie HESC są filmowane przez dodatkowe 48 godzin w Biot ct. Tempo wzrostu jest określane za pomocą ulepszenia segmentacji i receptur pomiarowych opracowanych za pomocą oprogramowania CL quant
.Receptury są weryfikowane przez porównanie z Adobe Photoshop, narzędziem do analizy obrazu, które umożliwia precyzyjne ręczne dopasowanie maski do każdej kolonii. Rozwijająca się dziedzina bioinformatyki wideo może być wykorzystana do automatyzacji przetwarzania, analizy i eksploracji danych biologicznych z mikroskopijnych filmów wideo. Cześć, nazywam się Serena Lin i pracuję w laboratorium dr Prou Talbota na Wydziale Biologii Komórki i Neurologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside.
Cześć, nazywam się Sean Fino, również pracuję w Talbot Lab. Cześć, jestem TI Satish z Cell Molecular and Developmental Biology Graduate Program. Dzisiaj pokażemy Ci, jak mierzyć wzrost kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą narzędzi bioinformatycznych wideo.
Używamy tej procedury w naszym laboratorium do pomiaru wpływu toksyn środowiskowych na zachowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Zademonstrujemy tę procedurę w naszym nowym ośrodku komórek macierzystych. Więc zacznijmy.
Aby przygotować HESC do analizy wideo, hoduj HESC On na płytkach sześciodołkowych pokrytych matriżelem do uzyskania 70% zlewającego się podłoża aspiracyjnego z jednej studzienki zawierającej HESC i spłucz dwa razy jednym mililitrem PBS. Dodaj jeden mililitr Accutane i inkubuj przez minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Następnie dodaj 10 do 12 szklanych koralików do studzienki i delikatnie potrząśnij talerzem, aż kolonie całkowicie się oderwą.
Zneutralizuj Accutane za pomocą jednego mililitra ludzkiego embrionalnego utrzymania komórek macierzystych, pożywki lub pożywki kondycjonowanej mysimi fibroblastami embrionalnymi. Zebrać oderwane komórki bez kulek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwirować przy 200 G przez trzy minuty. Zdekantować natant SUP i rozbić osad za pomocą 500 mikrolitrów świeżej pożywki do konserwacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub płytki M-T-E-S-R, 100 mikrolitrów zawiesiny HESC kroplami do wielu dołków 12-dołkowej płytki pokrytej matryżelem.
Delikatnie kołysz płytką w przód iw tył i obserwuj kultury pod mikroskopem świetlnym, aby grudki komórek były równomiernie rozmieszczone w studzienkach. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni i 5% dwutlenku węgla na 48 godzin, aby upewnić się, że komórki są przymocowane płasko i wystarczająco duże, aby można je było łatwo uwidocznić. Po 48 godzinach odessać pożywkę i przemyć studzienki 500 mikrolitrami PBS w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek, a następnie dodać do każdej z nich 500 mikrolitrów pożywki M-T-E-S-R.
Cóż, natychmiast umieść płytkę w Biot CT i zacznij zbierać obrazy poklatkowe. Staraj się wybierać pola z dyskretnymi pojedynczymi koloniami, które prawdopodobnie nie wyrosną na inne kolonie. W tym protokole komórki są nagrywane wideo przez dodatkowe 48 godzin z klatkami w siedmiominutowych odstępach.
Aby najpierw utworzyć przepis na segmentację, ręcznie zeskanuj cały film, aby sprawdzić, czy zawiera on pojedynczą kolonię, która pozostaje skupiona przez cały okres nagrywania. Następnie otwórz kreatora segmentacji w oprogramowaniu CL quants i kliknij następny przycisk. Wybierz właściwy kanał obrazu i kliknij przycisk Dalej.
Wybierz dopasowanie miękkie i kliknij przycisk Dalej. Wybierz jeden lub dwa pożądane regiony, okrążając zewnętrzną krawędź do środkowego obszaru kolonii. Obszar ten powinien być jak najmniejszy, ale powinien być reprezentatywny dla całej kolonii.
Nie wybieraj zbyt wielu regionów, ponieważ może to spowodować niedokładną aplikację maski. Kliknij przycisk Dalej. Wybierz opcję Nie chcę regionów, zakreślając regiony, które nie są częścią kolonii i nie są częścią tła.
Regiony te mają wzorce, które należy stłumić, takie jak szczątki i martwe komórki. Kliknij Dalej. Wybierz tło, zakreślając obszary, które nie są koloniami, szczątkami ani martwymi komórkami.
Tło powinno być jednolite i z dużym prawdopodobieństwem pojawi się w każdej klatce. Zazwyczaj wybieramy szare tło wokół kolonii. Kliknij przycisk Dalej.
Kolorowa maska powinna być wyświetlana nad obszarem zainteresowania, jeśli maska nie zakrywa dokładnie obszaru zainteresowania. Zakres progu segmentacji w prawym dolnym rogu ekranu może zostać zwiększony lub zmniejszony, jeśli konieczna jest zmiana maski. Wybierz opcję aktualizuje nietrwale dopasowujące regiony.
Pozwala to na zmianę obszarów nie chcę lub tła. Jeśli maska jest zadowalająca, wybierz opcję zastosuj próg i zapisz moją maskę. Następnie kliknij następny przycisk.
Maska będzie wtedy wyświetlana w innym kolorze. Wybierz pozycję Zakończ. Receptura powinna być wyświetlana w prawym górnym rogu oprogramowania jako receptura segmentacji.
W razie potrzeby zmień nazwę przepisu, klikając prawym przyciskiem myszy i wprowadzając nową nazwę. Aby zastosować przepis. Kliknij prawym przyciskiem myszy i umieść kursor myszy.
Zastosuj przepis. Pojawi się menu umożliwiające wybór liczby ramek do użycia. Ustaw interwał klatek na co 20 klatek, aby zapewnić wierność maski.
Losowo ręcznie sprawdź wyrywkowo 10% ramek, na które nałożono maskę, aby stworzyć przepis wzmacniający, który eliminuje niechciane obszary w gruzach. Kliknij prawym przyciskiem myszy folder z przepisami ulepszającymi, a następnie kliknij przycisk Nowy. Nowa receptura ulepszenia powinna być wyświetlana z oryginalnego pola widzenia.
Najedź myszką na ikony na pasku narzędzi, aby zidentyfikować przycisk przełączania modułu ulepszania znajdujący się po prawej stronie obrazu i kliknij go. Wybierz menu rozwijane etykietowania. Wybierz etykietowanie dla połączonego, wybierz etykietowanie dla połączonych dwóch.
Powinien zostać wyświetlony nowy pasek zadań. Chwyć początkową maskę z przepisu segmentacji i przeciągnij ją do pola wprowadzania. Na pasku powinien teraz wyświetlać się numer maski wprowadzania.
Przeciągnij ikonę z numerem maski wprowadzania na ikonę maski zerowej. Znajdź minimalny rozmiar na pasku zadań i dostosuj liczbę, aż zostanie wyświetlony tylko obszar zainteresowania. Upewnij się, że kliknąłeś na wykonaj dla każdej próby dopasowania.
Gdy minimalna regulacja rozmiaru będzie zadowalająca, kliknij poprzedni przepis na ulepszenie u dołu ekranu, wybierz zapisz w przepisie. Oprogramowanie poprosi teraz o nadpisanie wybranej receptury i wybranie tak miejsca. Sprawdź recepturę ulepszenia, stosując tę samą procedurę, co w przypadku segmentacji kontroli wyrywkowej.
Jeśli są zadowoleni z przepisów na segmentację i ulepszenia, kontynuuj tworzenie szablonu pomiaru. Aby rozpocząć wybieranie, utwórz szablon pomiaru na pasku narzędzi po prawej stronie. W oknie pomiaru wybierz opcję przesuń kursor na figurę komórki clipart.
Przytrzymaj kontrolny i wybierz komórkę w sekcji morfologii, odznacz parametr domyślny i sprawdź parametr obszaru. Następnie zamknij okno szablonu. Wybierz ikonę.
Utwórz recepturę pomiaru. Zmień nazwę przepisu. Przejdź do zakładki szablonu i wybierz ją W prawym górnym rogu przeciągnij i upuść wcześniej utworzony szablon pomiaru na okno pomiaru.
Kliknij tak, aby kontynuować, w oknie receptury pomiaru wybierz mapowania kanałów. Następnie cała komórka zaznacza mapowania maski. Następnie wybierz opcję całej komórki Aby uzyskać ulepszoną maskę, wybierz przepis pomiaru pod zakładką przepisu.
W oknie głównym wybierz ikonę zapisu w oknie receptury pomiaru. Następnie zamknij okno Następnie zamknij i ponownie otwórz pole widzenia. Kliknij prawym przyciskiem myszy folder z listą przepisów, a następnie kliknij nowy przeciągnij przepisy w kolejności potrzebnej aplikacji na listę przepisów, wybierz zablokuj listę przepisów i uruchom przepisy sekwencyjnie na danych wideo za pomocą programu Adobe Photoshop.
Analizowano co 20 klatkę tych samych kolonii. Ręcznie otwórz klatkę obrazu kolonii w programie Adobe Photoshop. Kliknij narzędzie magicznej różdżki na pasku narzędzi.
Kliknij obszar wokół kolonii, aby pokryć całe pole z wyjątkiem regionu kolonii. Upewnij się, że przerywana linia wokół kolonii pasuje do jej obrzeża, a nie do jej wnętrza. Jeśli linia kropkowana nie znajduje się wokół obrzeża, zmień odpowiednio wartość tolerancji na górnym pasku narzędzi.
Kliknij edytuj w trybie szybkiej maski na pasku narzędzi i kliknij kolonię, aby kolonia została zaznaczona. Przejdź do okna, rozwiń menu i kliknij histogram. Pamięć podręczna powinna być ustawiona na jeden.
Jeśli pamięć podręczna składa się z dwóch, kliknij wykrzyknik znacznika wyrażenia, aby zmienić pamięć podręczną na jeden. Zapisz wartość pikseli w arkuszu kalkulacyjnym. Powtórz powyższy proces dla każdej 20 klatki.
Dane zebrane za pomocą programu Photoshop i oprogramowania CL quant można następnie wykreślić razem. Nasz protokół ilościowego określania wzrostu kolonii HESC demonstruje jedno zastosowanie bioinformatyki wideo do problemu biologicznego. Tutaj pokazujemy wykres porównujący wzrost wielkości kolonii w ciągu 48 godzin, określony za pomocą oprogramowania CL quant i Adobe Photoshop.
Wykres przedstawia pięć różnych kolonii, z których każda jest analizowana przez oba pakiety oprogramowania. Każda kolonia jest reprezentowana przez inny kolor. Linie ciągłe zostały wyprowadzone za pomocą oprogramowania do pomiaru wysokości żagli, podczas gdy linie przerywane zostały zebrane za pomocą Photoshopa.
Wykres surowych danych pokazuje, że obie metody pomiaru są zgodne z faktem, że kolonie mają różną wielkość początkową. Na tym rysunku przedstawiono dane ponownie wykreślone jako procentowy wzrost wielkości kolonii. Tempo wzrostu jest podobne niezależnie od początkowej wielkości kolonii i obie miary analizy dają podobne wyniki.
Poniższy wykres przedstawia średnie z poprzednich danych o zmianie procentowej wzrostu kolonii HESC. Ten wykres wyraźnie pokazuje dobrą zgodność między analizą wykonaną przy użyciu bioinformatyki wideo a Adobe Photoshop. Właśnie pokazaliśmy, jak mierzyć wzrost kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą narzędzi bioinformatycznych wideo.
Wykonując tę procedurę przy użyciu mikroskopii z kontrastem fazowym, pamiętaj o uwzględnieniu aureoli wokół kolonii w celu precyzyjnego wyboru kolonii przez oprogramowanie. Ważne jest również, aby pamiętać, że zamiast zademonstrowanego przez nas protokołu można zastosować inne metody hodowli, inkubacji i zbierania wideo. Po opracowaniu i walidacji receptur będą one przeprowadzać analizę znacznie szybciej i z mniejszą zmiennością eksperymentalną niż w przypadku analizy ręcznej.
Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł prezentuje metodę bioinformatyki wideo do pomiaru wzrostu kolonii ludzkich komórek macierzystych embrionalnych za pomocą analizy wideo time-lapse. Metoda automatyzuje przetwarzanie i analizę danych biologicznych wyodrębnianych z mikroskopicznych nagrań wideo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Bioinformatyka wideo
- Biologia komórek macierzystych
- Mikroskopowe obrazowanie
Tło
- Ludzkie komórki macierzyste embrionalne (HESC) są niezbędne w badaniach nad biologią rozwoju.
- Analiza wideo time-lapse zapewnia wgląd w dynamikę wzrostu komórek.
- Zautomatyzowane metody mogą poprawić efektywność przetwarzania danych.
- Techniki segmentacji i pomiaru są niezbędne dla dokładnej analizy.
Cel badania
- Zademonstrowanie metody pomiaru wzrostu kolonii HESC.
- Walidacji technik bioinformatyki wideo względem tradycyjnych narzędzi analizy obrazu.
- Wnęszenie do rozwoju dziedziny zautomatyzowanej analizy danych biologicznych.
Stosowane metody
- Nagranie time-lapse z inkubatora wyposażonego w kamerę.
- Ulepszone receptury segmentacji i pomiaru opracowane za pomocą oprogramowania CL quant.
- Porównanie zautomatyzowanych pomiarów z analizą manualną za pomocą Adobe Photoshop.
- Filmowanie kolonii HESC przez 48 godzin po inkubacji.
Główne wyniki
- Metoda bioinformatyki wideo skutecznie mierzyła tempo wzrostu kolonii.
- Zautomatyzowana analiza wykazała zgodność z pomiarami manualnymi.
- Techniki segmentacji poprawiły dokładność ocen wzrostu.
- Badanie podkreśla potencjał bioinformatyki wideo w badaniach biologicznych.
Wnioski
- Bioinformatyka wideo jest cennym narzędziem do analizy wzrostu komórek macierzystych.
- Metoda może usprawnić zbieranie i analizę danych w badaniach biologicznych.
- Dalszy rozwój zautomatyzowanych technik może poprawić efektywność badań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying stem cell colony growth dynamics is critical for assessing cellular responses to environmental factors and therapeutic candidates in early discovery. Automated video bioinformatics reduces variability and increases throughput compared to manual image analysis, supporting reliable phenotypic screening. This approach enables data-driven go/no-go decisions by providing quantitative, reproducible readouts of colony expansion kinetics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring colony growth as a functional readout of stem cell behavior under experimental conditions.
- Operational Value: Supports biological de-risking through objective, quantitative assessment of colony expansion rates across treatment groups.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing standardized, automated measurement of colony growth kinetics.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through software-based segmentation and measurement recipes that minimize user variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system continuity by enabling longitudinal monitoring of stem cell colony growth as a biomarker of cellular fitness and response.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by generating consistent, quantifiable growth data that correlate with cellular health and stability.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by delivering quantitative phenotypic data on stem cell colony dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking colony growth measurements to specific genetic or environmental perturbations.
- Screening: Enables assay readiness and reproducibility through automated, software-driven analysis that standardizes growth rate quantification across experiments.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (colony pixel area over time) that allow objective comparison of growth rates between conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by offering a translatable metric of stem cell behavior applicable to disease modeling.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across projects, as validated recipes can be applied to any time-lapse video data for consistent growth analysis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in stem cell behavior assessment through objective, automated quantification.
- Operational Value: Improves standardization and scalability by replacing manual frame-by-frame analysis with batch-processed video bioinformatics workflows.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency and reduces late-stage biological risk by enabling early, data-driven prioritization of stem cell lines or conditions based on growth performance.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing reproducible, quantitative growth metrics that support line selection and condition optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in image analysis software and video data handling to develop and validate segmentation, enhancement, and measurement recipes.
- Dependent on stable time-lapse imaging infrastructure, such as an incubator-integrated camera system capable of consistent frame capture over extended periods.
- Necessitates cross-team standardization of recipe parameters (e.g., frame interval, masking thresholds) to ensure reproducibility across users and labs.
- Involves adaptation considerations when applying recipes to different cell types, colony morphologies, or video formats, requiring recipe re-optimization.
- Practical limitations include dependency on video quality and focus stability; obscured or moving colonies may require manual intervention or recipe adjustment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:02
Introduction
1:40
Plating and Colony Formation of hESC for Video Data
6:40
Video Bioinformatics with CL-Quant Software -- Enhancement Recipe
3:48
Video Bioinformatics with CL -Quant Software -- Segmentation Recipe
8:19
Video Bioinformatics with CL -Quant Software -- Measurement Template
11:22
Comparison of CL-Quant and Adobe® Photoshop® for Video Analysis of hESC Colony Growth
10:08
Adobe® Photoshop® Measurement of hESC Video Data
12:27
Conclusion
