Name: Wideo: Bioinformatyczna analiza wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Poznaj metodę bioinformatyczną do pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu analizy wideo poklatkowego. Automatyzacja przetwarzania danych biologicznych z mikroskopowych nagrań wideo usprawnia badania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opracowanie tej metody było możliwe dzięki finansowaniu z California Tobacco-Related Disease Research Program, California Institute for Regenerative Medicine oraz grantu NSF IGERT w zakresie Video Bioinformatics (#0903667) na UCR (<a href="http://www.cris.ucr.edu/IGERT/index.php">http://www.cris.ucr.edu/IGERT/index.php</a>). Sabrina Lin otrzymała wsparcie w ramach stypendium doktoranckiego Graduate Division, Shawn Forteno korzysta ze wsparcia stypendium NIH MARC, a Shruthi Satish ze wsparcia stypendium Graduate Division. Jesteśmy wdzięczni Annie Trtchounian za pomoc w przygotowaniu rycin. Dziękujemy również Samowi Alworthowi i Nedowi Jastrombowi za przeszkolenie nas w obsłudze oprogramowania CL-Quant.

Część 1: Procedura eksperymentalna
Dane wideo zawierają ogromną ilość informacji. Jednak informacje te są często trudne do wyodrębnienia, a ich manualna analiza przez ludzi może wymagać wielu godzin pracy personelu. Analiza manualna jest również podatna na błędy oraz różnice w interpretacji. Bioinformatyka wideo polega na wykorzystaniu oprogramowania komputerowego do wydobywania konkretnych danych z obrazów wideo. Ta metoda analizy jest szybka i pozwala wyeliminować błędy występujące podczas manualnej analizy przeprowadzanej przez ludzi. Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie metody ilościowego określania wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem metody bioinformatyki wideo.
W niniejszej pracy obrazy wideo time-lapse zostały zebrane przy użyciu jednostki inkubacyjnej Nikon BioStation CT, która umożliwia obrazowanie wielu pól komórek w czasie (Rys. 1). Metody opisane w tym raporcie mają zastosowanie do danych wideo zebranych za pomocą dowolnego zestawu do mikroskopii wideo.
W naszym projekcie eksperymentalnym wysialiśmy H9 hESC na 12-dołkowe płytki do hodowli tkanek na 48 godzin. W tym czasie kolonie mogły w pełni przytwierdzić się i rozprzestrzenić na Matrigelu. Następnie płytki z przytwierdzonymi koloniami hESC przeniesiono do BioStation CT i inkubowano przez kolejne 48 godzin. Podczas przebywania w BioStation obrazy kolonii były zbierane w odstępach 7-minutowych, a następnie wykorzystane do stworzenia sekwencji wideo time-lapse. Filmy dla każdej kolonii zostały poddane analizie w celu ilościowego określenia wzrostu kolonii przy użyciu receptur bioinformatyki wideo opracowanych w oprogramowaniu CL-Quant. Analizy wykonane za pomocą receptur stworzonych w oprogramowaniu CL-Quant zostały zweryfikowane pod kątem poprawności ręcznie w programie Adobe Photoshop.
Część 2: Przygotowanie przylegających kolonii hESC
<ol>
 <li>Hodować hESC na płytkach 6-dołkowych powlekanych Matrigel, a po osiągnięciu 70% konfluencji, przesianie zawartości jednego dołka płytki 6-dołkowej do 5 dołków powlekanej Matrigel płytki 12-dołkowej w następujący sposób.</li>
 <li>Odssać pożywkę z dołka zawierającego hESC.</li>
 <li>Przepłukać dołek 2x 1ml PBS.</li>
 <li>Dodać 1ml Accutase i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
 <li>Wprowadzić do dołka 10-12 szklanych kulek i delikatnie potrząsać płytką, aż kolonie całkowicie oddzielą się od dna dołka.</li>
 <li>Zneutralizować Accutase za pomocą 1ml pożywki mTeSR lub pożywki kondycjonowanej mEF.</li>
 <li>Odwirować zawiesinę komórkową w stożkowej probówce 15ml przy 200g przez 3 minuty.</li>
 <li>Odlać nadsącz i rozbić osad za pomocą 500μl świeżej pożywki mTeSR.</li>
 <li>Nakroplować 100μl zawiesiny hESC do każdego dołka w płytce 12-dołkowej.</li>
 <li>Delikatnie kołysać płytką w przód i w tył i obserwować hodowle pod mikroskopem świetlnym. Upewnić się, że skupiska komórek są równomiernie rozłożone na całej płytce.</li>
 <li>Umieścić płytkę 12-dołkową z powrotem w inkubatorze.</li>
 <li>Pozostawić hESC do przytwierdzenia i wzrostu na 48 godzin (można zastosować krótszy czas).</li>
 <li>Po 48 godzinach odlać pożywkę i przemyć dołki 500ul PBS, aby usunąć nieprzytwierdzone komórki.</li>
 <li>Dodać 1ml pożywki mTeSR do każdego dołka.</li>
 <li>Komentarz: Natychmiast umieścić płytkę w inkubatorze/mikroskopie w celu obrazowania wideo.</li>
 <li>Rozpocząć zbieranie obrazów time-lapse. Należy starać się wybierać pola z osobnymi, pojedynczymi koloniami, które nie będą miały tendencji do zrastania się z innymi koloniami.</li>
 <li>Zamiast powyższego protokołu można zastosować inne metody hodowli i przygotowania hESC.</li>
</ol>
Część 3: Bioinformatyka wideo
Oprogramowanie CL-Quant zostało wykorzystane do stworzenia trzech „przepisów”, które po uruchomieniu w sekwencji pozwolą określić liczbę pikseli lub powierzchnię w mikronach dla każdej kolonii w czasie. Trzy przepisy są zbudowane sekwencyjnie i w tym zastosowaniu obejmują segmentację, wzmocnienie obrazu oraz pomiar.
Analiza wzrostu kolonii hESC z wykorzystaniem oprogramowania CL-Quant/opracowywanie receptury:
<ol>
 <li>W pierwszej kolejności tworzy się recepturę segmentacji (segmentation recipe).</li>
 <li>Przeskanuj cały film, aby upewnić się, że materiał nadaje się do analizy. Sprawdź, czy cała kolonia pozostaje w polu widzenia i czy inne kolonie do niego nie wkraczają.</li>
 <li>Otwórz kreator segmentacji i kliknij przycisk „next”.</li>
 <li>Wybierz odpowiedni kanał obrazu (np. fazowy, zielony, czerwony itd.) i kliknij przycisk „next”.</li>
 <li>Z 3 dostępnych opcji wybierz „soft matching” i kliknij „next”.</li>
 <li>Zaznacz obszary pożądane („want”), obrysowując na obrazie regiony – zazwyczaj od zewnętrznej krawędzi kolonii do jej obszaru centralnego.
 <ul>
 <li>Obszar ten powinien być jak najmniejszy, ale reprezentatywny dla całej kolonii.</li>
 <li>Przy użyciu mikroskopii fazowej pamiętaj o uwzględnieniu halo wokół kolonii, aby oprogramowanie mogło precyzyjnie zaznaczyć kolonię.</li>
 <li>Wybierz 1 lub 2 obszary zainteresowania (ROI), które mogą wykazywać różne wzory pikseli w obrębie kolonii, ale nie wybieraj zbyt wielu obszarów „want”, co mogłoby doprowadzić do nieprawidłowego nałożenia maski.</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Kliknij przycisk „next”.</li>
 <li>Zaznacz obszary niepożądane („don't want”), obrysowując na obrazie regiony, które nie są częścią kolonii ani tła. Są to obszary o wzorach, które chcesz wyeliminować, zawierające piksele artefaktów, takich jak zanieczyszczenia i martwe komórki. Kliknij „next”.</li>
 <li>Zaznacz „tło” (background), obrysowując regiony, które chcesz wyeliminować.
 <ul>
 <li>Obszary „don't want” i „background” różnią się tym, że tło powinno być jednorodne i prawdopodobnie występować w każdej klatce.</li>
 <li>Zazwyczaj wybieramy szare tło wokół kolonii.</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Kliknij przycisk „next”.</li>
 <li>Nad obszarem zainteresowania powinna wyświetlić się kolorowa maska (Rys. 2A).</li>
 <li>Jeśli maska nie pokrywa dokładnie obszaru zainteresowania, można zwiększyć lub zmniejszyć zakres progu segmentacji (znajdujący się w prawym dolnym rogu ekranu oprogramowania).</li>
 <li>Kreator segmentacji może poprosić o dalsze doprecyzowanie obszaru maski, jeśli jest to konieczne.</li>
 <li>Jeśli chcesz zmienić maskę, wybierz „update soft matching regions”. Pozwala to na zmianę obszarów „want”, „don't want” lub „background”.</li>
 <li>Jeśli maska jest zadowalająca, wybierz „apply threshold and save my mask” i kliknij przycisk „next”.</li>
 <li>Maska zostanie wówczas wyświetlona w innym kolorze.</li>
 <li>Wybierz „finish”.</li>
 <li>Receptura powinna wyświetlić się w prawym górnym rogu oprogramowania pod nazwą „segmentation recipe”.</li>
 <li>Jeśli chcesz, zmień nazwę receptury, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając „rename”.</li>
 <li>Aby przeprowadzić kontrolną weryfikację, kliknij prawym przyciskiem myszy i najedź kursorem na „apply recipe”.</li>
 <li>Pojawi się menu umożliwiające wybranie liczby klatek, których chcesz użyć do weryfikacji receptury. Uruchom recepturę co 10 klatek, aby sprawdzić dokładność rozmieszczenia maski.</li>
 <li>Jeśli maska obejmuje fragmenty niewielkich niepożądanych obszarów lub zanieczyszczeń, możesz utworzyć „recepturę ulepszenia” (enhancement recipe), aby lepiej dopasować maskę do obszaru zainteresowania.</li>
 <li>Aby utworzyć recepturę ulepszenia, kliknij prawym przyciskiem myszy folder „enhancement recipe”, a następnie kliknij „new”. Powinna wyświetlić się nowa receptura ulepszenia.</li>
 <li>W oryginalnym polu widzenia (FOV) kliknij przycisk „toggles enhancement module” znajdujący się po prawej stronie obrazu. Najedź kursorem na ikony na pasku narzędzi, aby zidentyfikować właściwy przycisk.</li>
 <li>Otwórz menu rozwijane „labeling”.</li>
 <li>Wybierz „labeling 4 connected”.</li>
 <li>Wybierz „labeling 4 connected2”.</li>
 <li>Powinien wyświetlić się nowy pasek zadań.</li>
 <li>Pobierz początkową maskę (mask0) z receptury segmentacji i przeciągnij ją do pola „input”.</li>
 <li>Na pasku powinien teraz pojawić się napis „input mask #”.</li>
 <li>Przeciągnij ikonę z napisem „input mask #” na ikonę maski 0.</li>
 <li>Znajdź opcję „min size” na pasku zadań i reguluj wartość, aż wyświetli się tylko obszar zainteresowania. Pamiętaj, aby klikać „execute” po każdej próbie dopasowania.</li>
 <li>Gdy uznasz regulację minimalnego rozmiaru za zadowalającą, kliknij w utworzoną wcześniej „recepturę ulepszenia” (Rys. 2B).</li>
 <li>Na dole ekranu wybierz „save to recipe”.</li>
 <li>Oprogramowanie zapyta „overwrite selected recipe?”, wybierz „yes”.</li>
 <li>Przeprowadź kontrolną weryfikację receptury ulepszenia, stosując te same procedury, co w przypadku weryfikacji segmentacji.</li>
 <li>Jeśli jesteś zadowolony z receptur segmentacji i ulepszenia, wybierz „create measurement template” na prawym pasku narzędzi.</li>
 <li>Jeśli chcesz, zmień nazwę szablonu.</li>
 <li>W oknie szablonu pomiarowego najedź kursorem na grafikę komórki. Przytrzymaj klawisz Ctrl i zaznacz komórkę.</li>
 <li>Odznacz „default parameter” i zaznacz „area parameter” w sekcji „morphology”.</li>
 <li>Wyjdź z okna „template”.</li>
 <li>Wybierz ikonę utworzoną w recepturze pomiarowej.</li>
 <li>Zmień nazwę receptury.</li>
 <li>Przejdź do karty „template” w prawym górnym rogu i zaznacz ją.</li>
 <li>Przeciągnij wcześniej utworzony szablon pomiarowy do okna pomiarowego.</li>
 <li>Kliknij „Yes”, aby kontynuować.</li>
 <li>W oknie receptury pomiarowej wybierz „Channel mappings”, a następnie „Whole cell”.</li>
 <li>Wybierz „Mask mappings”.</li>
 <li>Następnie wybierz opcję „Whole cell” dla ulepszonej maski (enhanced mask).</li>
 <li>W oknie głównym, w karcie Recipe, wybierz „Measurement recipe”.</li>
 <li>W oknie receptury pomiarowej wybierz ikonę „Save”.</li>
 <li>Następnie zamknij okno.</li>
 <li>Teraz zamknij i ponownie otwórz „FOV”.</li>
 <li>Kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę „Recipe”, wybierz „Lock recipe list” i uruchom receptury sekwencyjnie na danych wideo.</li>
</ol>
Część 4: Sprawdzanie dokładności receptury przy użyciu oprogramowania Photoshop
Aby zwalidować recepturę stworzoną za pomocą (CL-Quant software), te same dane można przeanalizować ręcznie w programie Adobe Photoshop. W tej analizie analizowano co dziesiątą klatkę (każdy punkt czasowy co 70 min), aby zmierzyć wielkość kolonii w ciągu 48 godzin.
<ol>
 <li>Otwórz klatkę obrazu kolonii w programie Adobe Photoshop.</li>
 <li>W pasku narzędzi kliknij narzędzie Magic Wand (Różdżka).</li>
 <li>Kliknij obszar wokół kolonii, tak aby zaznaczone zostało całe pole z wyjątkiem regionu kolonii.</li>
 <li>W pasku narzędzi wybierz opcję „Edit in Quick Mask Mode” (Edytuj w trybie szybkiej maski) i kliknij kolonię, aby została zaznaczona.</li>
 <li>Upewnij się, że przerywana linia wokół kolonii ściśle przylega do jej obwodu, a nie znajduje się wewnątrz niej. Jeśli przerywana linia nie przebiega wzdłuż obwodu, odpowiednio zmień wartość tolerancji w górnym pasku narzędzi.</li>
 <li>Z rozwijanego menu „Window” (Okno) wybierz opcję „Histogram”.</li>
 <li>Zapisz wartość piksela dla cache=1. Jeśli cache wynosi 2, kliknij znak „!”, aby zmienić go na cache 1, a następnie zanotuj wartość piksela.</li>
 <li>Powtórz powyższy proces dla co dziesiątej klatki. W razie potrzeby można wykorzystać mniejszą liczbę klatek.</li>
 <li>Dane zebrane za pomocą programu Photoshop oraz oprogramowania CL-Quant można następnie nanieść na wspólny wykres. Jeśli receptury CL-Quant są prawidłowe, krzywe dla analizy w Photoshopie i CL-Quant powinny być bardzo zbliżone (Rys. 3-5).</li>
 <li>Jeśli receptury opracowane w programie CL-Quant są prawidłowe, można je niezawodnie zastosować do innych danych wideo.</li>
 <li>Wartością dodaną zastosowania bioinformatyki wideo w tej analizie jest fakt, że po opracowaniu i walidacji receptur segmentacji, wzmocnienia i pomiaru, analiza zostanie przeprowadzona znacznie szybciej i dokładniej niż przez człowieka korzystającego z programu Photoshop.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig1.jpg" alt="Mikroskopia timelapse, podział komórek, sekwencja 6 klatek, wizualizacja procesu biologicznego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1: Pas klatek z kolonii hESC przedstawiający obrazy z różnych momentów w ciągu 48 godzin wzrostu w systemie BioStation CT. Klatki były rejestrowane w odstępach 7 minut.
<img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig2.jpg" alt="Obrazy mikroskopowe, fluorescencyjne barwienie komórek, obraz A w kolorze niebieskim, obraz B w kolorze zielonym, identyfikacja komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2: (A) Obraz hESC z maską nałożoną na kolonię przez algorytm segmentacji. Obszary z zanieczyszczeniami i tło są również zamaskowane, co wskazuje na konieczność zastosowania algorytmu ulepszania obrazu w celu zwiększenia dokładności oceny. (B) Obraz tej samej kolonii co w punkcie „A” po przeprowadzeniu ulepszania. Maska zaznacza teraz wyłącznie kolonię, a szum został usunięty z zaznaczenia.
<img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig3.jpg" alt="Analiza powierzchni kolonii, CL-Quant vs Photoshop, wykres porównujący powierzchnię w pikselach w funkcji numerów klatek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3: Wykres przedstawiający wzrost wielkości kolonii (w pikselach) w ciągu 48 godzin, określony przy użyciu oprogramowania CL-Quant oraz programu Photoshop. Wykres ten przedstawia surowe dane i pokazuje, że kolonie startują z różnych wielkości. Wykazuje on również, że obie metody pomiaru są ze sobą zgodne.
<img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig4.jpg" alt="Wykres wzrostu powierzchni kolonii, CL-Quant w porównaniu z Photoshop, przedstawiający procentową zmianę w funkcji numeru klatki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4: Wykres przedstawiający te same dane co na Rysunku 3 po normalizacji, ukazujący procentowy wzrost wielkości kolonii w ciągu 48 godzin. Wykazuje to, że tempo wzrostu jest podobne niezależnie od początkowej wielkości kolonii i że obie metody analizy dają zbliżone wyniki.
<img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig5.jpg" alt="Wykres analizy powierzchni kolonii, CL-Quant vs. Photoshop, procentowa zmiana całkowitej powierzchni w czasie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> Rysunek 5: Wykres przedstawiający średnie dla znormalizowanych danych z Rysunku 4. Wykres ten wyraźnie pokazuje dobrą zgodność między analizami wykonanymi za pomocą bioinformatyki wideo (oprogramowanie CL-Quant) a programem Photoshop i potwierdza rzetelność metody. Lekki spadek powierzchni dla danych z programu Photoshop w klatce 325 wynika z pominięcia kilku filmów w analizie przeprowadzonej w Photoshopie.

Narzędzia bioinformatyki wideo są niezwykle skuteczne w szybkim wydobywaniu danych z obrazów wideo. Nasz protokół ilościowego oznaczania wzrostu kolonii hESC demonstruje jedno z zastosowań bioinformatyki wideo w problematyce biologicznej. Metoda ta jest ilościowa i posiada interesującą cechę polegającą na ujawnianiu danych z poszczególnych kolonii hESC. Procedury bioinformatyki wideo mogą zostać opracowane w celu monitorowania innych procesów komórkowych, takich jak proliferacja, migracja, apoptoza, przyleganie komórek d...

<table><tbody><tr><td>Pożywka podtrzymująca ludzkie embrionalne komórki macierzyste mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05850</td><td>lub dowolna inna odpowiednia pożywka do hodowli hESC.</td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>lub inny odpowiedni substrat.</td></tr><tr><td>Podstawowa pożywka DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny bez Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; i Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do odrywania komórek z enzymem Accutase</td><td>eBioscience</td><td>00-4555-56</td><td>lub inny odpowiedni enzym do odrywania.</td></tr><tr><td>Szklane kuleczki 3mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-312A</td><td>opcjonalnie.</td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki do hodowli tkanek</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td>lub dowolny inny format płytki.</td></tr><tr><td>Nikon BioStation CT/IM</td><td></td><td></td><td>lub inny inkubator/mikroskop odpowiedni do gromadzenia danych wideo.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CL-Quant (Nikon) i/lub Photoshop (Adobe).</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bioinformatyczna analiza wideo wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Ponieważ dane wideo są złożone i składają się z wielu obrazów, wydobywanie z nich informacji jest trudne bez wsparcia oprogramowania komputerowego. Bioinformatyka wideo stanowi potężne podejście ilościowe do ekstrakcji danych czasowo-przestrzennych z obrazów wideo, wykorzystujące oprogramowanie komputerowe do eksploracji i analizy danych. W niniejszym artykule przedstawiamy metodę bioinformatyki wideo służącą do ilościowego pomiaru wzrostu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) poprzez analizę filmów time-lapse zarejestrowanych w inkubatorze Nikon BioStation CT wyposażonym w kamerę do obrazowania wideo. W naszych eksperymentach kolonie hESC przyczepione do Matrigelu były filmowane przez 48 godzin w urządzeniu BioStation CT. W celu określenia tempa wzrostu tych kolonii opracowano procedury w oprogramowaniu CL-Quant, które umożliwia użytkownikom ekstrakcję różnych typów danych z obrazów wideo. Aby precyzyjnie ocenić wzrost kolonii, stworzono trzy procedury. Pierwsza segmentowała obraz na kolonię i tło, druga poprawiała obraz w celu dokładnego zdefiniowania kolonii w całej sekwencji wideo, a trzecia mierzyła liczbę pikseli w kolonii w czasie. Trzy procedury były uruchamiane sekwencyjnie na danych wideo zebranych w BioStation CT, aby przeanalizować tempo wzrostu poszczególnych kolonii hESC w ciągu 48 godzin. W celu weryfikacji rzetelności procedur CL-Quant te same dane analizowano ręcznie przy użyciu oprogramowania Adobe Photoshop. Po porównaniu danych uzyskanych za pomocą procedur CL-Quant i programu Photoshop wyniki okazały się niemal identyczne, co wskazuje na rzetelność procedur CL-Quant. Opisana tutaj metoda może być zastosowana do dowolnych danych wideo w celu pomiaru tempa wzrostu hESC lub innych komórek rosnących w koloniach. Ponadto w przyszłości można opracować inne procedury bioinformatyki wideo dla pozostałych procesów komórkowych, takich jak migracja, apoptoza i adhezja komórkowa.

Bioinformatyka wideo to zautomatyzowane przetwarzanie, analiza, interpretacja i eksploracja danych biologicznych czasowo-przestrzennych wyekstrahowanych z filmów mikroskopowych. Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie metody pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem metody bioinformatyki wideo.

Bioinformatyczna analiza wideo wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ponieważ dane wideo są złożone i składają się z wielu obrazów, wydobywanie informacji z materiałów wideo jest trudne do zrealizowania bez pomocy komputera...

Niniejszy protokół przedstawia bioinformatyczną metodę wideo do pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez analizę filmów time-lapse zarejestrowanych w inkubatorze icon bio station CT, wyposażonym w kamerę do obrazowania wideo. Kolonie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HESC) są hodowane do 70% konfluencji, przesiewane i inkubowane przez 48 godzin, po czym kolonie HESC są filmowane przez kolejne 48 godzin w urządzeniu Biot ct. Szybkość wzrostu jest określana przy użyciu ulepszonej segmentacji i procedur pomiarowych opracowanych w oprogramowaniu CL quant.Procedury zostały zwalidowane poprzez porównanie z programem Adobe Photoshop, narzędziem do analizy obrazu, które umożliwia precyzyjne ręczne dopasowanie masek do każdej kolonii. Rozwijająca się dziedzina bioinformatyki wideo może być wykorzystana do automatyzacji przetwarzania, analizy i wydobywania danych biologicznych z filmów mikroskopowych. Cześć, nazywam się Serena Lin i pochodzę z laboratorium dr. Prou Talbota w Katedrze Biologii Komórki i Neuronauki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside.Cześć, jestem Sean Fino, również z laboratorium Talbot. Cześć, jestem TI Satish z program

video-bioinformatics-analysis-human-embryonic-stem-cell-colony

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza bioinformatyczna wideo wzrostu kolonii ludzkich komórek macierzystych zarodkowych

W związku z rosnącym zainteresowaniem terapiami komórkami macierzystymi, techniki obrazowania molekularnego są idealne do monitorowania zachowania tych komórek po transplantacji. Geny reporterowe lucyferazy umożliwiły nieinwazyjną, powtarzalną ocenę przeżywalności, lokalizacji i proliferacji komórek in vivo. W niniejszym filmie zaprezentrowano sposób śledzenia proliferacji hESC w żywej myszy.

Obrazowanie genem reporterowym bioluminescencyjnym ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vitro i in vivo

Niniejszy protokół demonstruje sposób hodowli zdrowych, niezróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Hodowla i utrzymanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Pomimo podejmowanych wysiłków w celu przejścia na warunki hodowli bez komórek podporowych, izolacja i hodowla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) pozostają w dużej mierze zależne od kokultur z embrionalnymi fibroblastami mysimi (MEFs). W niniejszej pracy przedstawiamy nową metodologię szybkiego usuwania komórek podporowych z kultur hESC przed przystąpieniem do eksperymentów.

Szybkie usuwanie fibroblastów z gęstych kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

To badanie opisuje eksperymentalną platformę do szybkiego charakteryzowania zmodyfikowanych komórek macierzystych i ich zachowań przed ich zastosowaniem w długoterminowych badaniach nad przeszczepami in vivo w celu ratowania i naprawy układu nerwowego.

Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Protokół przedstawiony w tym badaniu opisuje metody monitorowania postępu przeprogramowania w czasie rzeczywistym poprzez pomiar kinetyczny dodatnich i ujemnych markerów pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Protokół obejmuje również obrazową ocenę morfologii oraz ekspresję markera lub reportera podczas generowania iPSC.

Pomiar kinetyczny i wizualizacja przeprogramowania somatycznego w czasie rzeczywistym

Pierwotne komórki rozrodcze (PGC) są powszechnymi prekursorami zarówno plemników, jak i jaj. Ludzkie embrionalne PGC są określane z pluripotencjalnych komórek epiblastów poprzez interakcje cytokin. Tutaj opisujemy 13-dniowy protokół indukcji komórek ludzkich transkryptomalnie przypominających PGC na powierzchni ciał zarodkowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją.

Wytwarzanie ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych podobnych do komórek rozrodczych na powierzchni ciał embrionalnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją

Ligandy macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na podatnych podłożach. Metodę tę można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami biochemicznymi w celu zbadania wzajemnych zależności między geometrią tkanki, siłami generowanymi przez komórkę i specyfikacją losu.

Modelowanie geometrii kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podatnych podłożach w celu kontrolowania mechaniki na poziomie tkankowym

Fenotypy wzrostu drożdży są precyzyjnie mierzone za pomocą wysoce równoległego obrazowania poklatkowego unieruchomionych komórek rosnących w mikrokolonie. Jednocześnie można monitorować tolerancję na stres, ekspresję białek i lokalizację białek, generując zintegrowane zestawy danych w celu zbadania, w jaki sposób różnice środowiskowe i genetyczne, a także niejednorodność ekspresji genów wśród komórek izogenicznych, modulują wzrost.

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

Przedstawiamy tutaj metodę analizy obrazowania żywych komórek, którą można wykorzystać do ręcznego śledzenia linii keratynocytów przejścia 0 oraz umożliwia zbieranie metryk proliferacji, w tym losów podziału komórkowego i czasu trwania cyklu komórkowego.

Obrazowanie żywych komórek z użyciem fotografii poklatkowej do badania kinetyki proliferacji keratynocytów naskórka

Poznaj metodę bioinformatyczną do pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu analizy wideo poklatkowego. Automatyzacja przetwarzania danych biologicznych z mikroskopowych nagrań wideo usprawnia badania.

Bioinformatyczna analiza wideo wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów