Wspomagany komputerowo wieloelektrodowy system krosówek

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie nagrań typu patch clamp do 12 komórek w trybie całej komórki. W tym celu należy najpierw zaznaczyć pozycję każdej interesującej komórki i przypisać do każdej komórki pipetę. Drugim krokiem jest zlokalizowanie końcówki każdej pipety i automatyczne przesunięcie pipet obok przypisanych im komórek.

Następnie podchodź do każdej komórki z jedną pipetą na raz. Aby ustanowić szczelne uszczelnienia z błoną komórkową, ostatnim krokiem jest pęknięcie błony komórek i wykonanie nagrań całych komórek. Ostatecznie, wspomagane komputerowo nagrywanie wieloelektrodowych krosówek służy do pokazania właściwości sieciowych małych obwodów neuronalnych z wysoką rozdzielczością.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ręczny zacisk krosowy, jest to, że liczba połączeń, które można zaobserwować w sieci, rośnie wraz z kwadratem liczby rejestrowanych neuronów. Wizualna demonstracja tej techniki jest ważna, ponieważ kroki zacisku krosowego mogą być trudne do nauczenia się ze względu na złożoność i szybkość, z jaką należy je wykonać. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia wycinka mózgu z obszarem zainteresowania w środku zakresu przemieszczenia mikroskopu.

Następnie zidentyfikuj interesujące Cię komórki. Następnie zapisz położenie komórek w oparciu o układ współrzędnych mikroskopu. Interfejs graficzny wyświetli wybrane komórki, a także mikropipety w celu uzyskania globalnego przeglądu, a oprogramowanie doda znacznik pozycji komórki, który zostanie nałożony na obrazy.

Dodatkowo przechwytywany jest obraz komórki do wykorzystania w przyszłości. Po wybraniu interesujących Cię komórek przypisz pipety, które będą używane do rejestrowania poszczególnych komórek, ustawiając elementy sterujące przypisania w interfejsie graficznym. Wizualizuj podgląd końcowej konfiguracji, zaznaczając pole wyboru pokaż końcowe pozycje.

Teraz przygotuj pipety z roztworem wewnątrzkomórkowym i umieść je na uchwytach. Umieść stopnie głowy w ich mocowaniach, ale nie przesuwaj ich do przodu. Aby uniknąć dotykania wanny końcówką pipety, włącz kontrolę nadciśnienia i wybierz wszystkie pipety.

Aby upewnić się, że końcówki pozostaną czyste, delikatnie wsuń każdą głowicę stage na miejsce. Następnie ustaw mikroskop w pozycji środkowej z ostrością dwa milimetry nad plasterkiem, naciskając przycisk R dwa, przytrzymując przycisk A. Użyj odpowiedniej pozycji dla każdego manipulatora, tak jak jest to zapisane w poprzednim eksperymencie, naciskając przycisk L dwa przytrzymując przycisk A.At tym momencie, w polu widzenia powinien znajdować się wyraźny cień pipety lub powinien wystarczyć niewielki ruch wzdłuż osi pipet aby go obserwować. Kompensacja niewielkich różnic w kształcie pipety musi być wykonywana ręcznie.

Następnie ustaw ostrość końcówki pipety. Następnie umieść końcówkę na czerwonej centralnej kropce wyświetlacza wideo. Nie poruszając mikroskopem, poinformuj oprogramowanie, że pipeta znajduje się na środku wyświetlacza, naciskając przycisk Z i przytrzymując przycisk C na sterowniku.

Po umieszczeniu pojedynczej końcówki pipety przesuń ją do tyłu, aby można było zlokalizować następną, naciskając przycisk L jeden i przytrzymując przycisk a. Po dokładnym zlokalizowaniu wszystkich końcówek pipet i przypisaniu każdej pipety do komórki. Pipety można automatycznie ustawić blisko odpowiednich komórek, klikając prawym przyciskiem myszy środek grupy komórek w oknie reprezentacji graficznej i wybierając klaster opcji z menu podręcznego.

W oknie opcji klastra zaznacz wszystkie pipety, które chcesz w tej chwili ustawić, a następnie kliknij przycisk Idź z zaznaczonymi pipetami. Powtórz tę procedurę dla każdego klastra komórek będących przedmiotem zainteresowania. Aby wykonać końcowe podejście, określ położenie pipet względem komórek jako 200 mikronów od celi w osi pipety i 200 mikronów nad nią w kierunku pionowym, co wystarczy, aby końcówka pipety znajdowała się na zewnątrz tkanki.

Następnie poczekaj, aż ustawienie pipet zostanie zakończone. Następnie przesuń mikroskop w kierunku pipety, naciskając jeden przycisk R, przytrzymując przycisk C. Ponownie skalibruj pozycję każdej pipety, ustawiając ostrość mikroskopu na jej końcówce w dowolnym miejscu na wyświetlaczu wideo i naciskając przycisk B, przytrzymując przycisk C.Na chwilę powinna pojawić się kwadratowa siatka wskazująca zidentyfikowane położenie pipety. Jeśli pozycja nie jest prawidłowa, umieść końcówkę na środkowej kropce wyświetlacza wideo i naciśnij przycisk Z, przytrzymując przycisk C kontrolera.

Teraz upewnij się, że komórka zainteresowania dla bieżącej pipety jest prawidłowo oznaczona, aktywnie oznaczona. W przeciwnym razie przesuń mikroskop, aby dopasować interesującą Cię komórkę do centralnej czerwonej kropki, zaznaczając komórkę, naciskając przycisk Y, przytrzymując przycisk C. Następnie naciśnij przycisk L dwa, przytrzymując przycisk, C.To ustawić pipetę w odległości 200 mikronów od przypisanej komórki, mikroskop automatycznie przesunie się do odpowiedniej pozycji. Dostosuj położenie pipety tak, aby pasowała do czerwonej kropki.

Następnie wyreguluj przesunięcie pipety, naciskając przycisk R one. Przytrzymując przycisk x. Aktywuj impuls testowy, naciskając przycisk L jeden i przytrzymując przycisk x.

Następnie powoli przenieś pipetę do przypisanej jej komórki. Po zaobserwowaniu tworzenia się wgłębienia na powierzchni błony komórki, zastosuj krótki impuls podciśnienia, naciskając przycisk Y, przytrzymując przycisk Z, aby przyłożone ciśnienie dotarło do komórki. W tym momencie należy ustalić potencjał podtrzymania około minus 65 miliwoltów, naciskając przycisk L two i przytrzymując przycisk x.

Gdy dla każdej komórki utworzy się giga uszczelnienie, zacznij rozrywać błony, stosując podciśnienie. Następnie użyj systemu akwizycji stymulacji, aby wykonać nagranie. Zastosuj impulsy lub ciągi impulsów do poszczególnych komórek pojedynczo i obserwuj reakcje pozostałych komórek, aby zmapować łączność między tymi zarejestrowanymi komórkami.

Po zakończeniu nagrań powoli odsuń pipety od tkanki, klikając prawym przyciskiem myszy przycisk radiowy tabeli. Wybierz pipety cofnięte o 500 mikronów, aby pipety cofnęły się na niewielką odległość wzdłuż swoich osi. Następnie obserwuj dryf w potencjale komórek do cofania pipet.

Ustaw szybkość pozycjonowania na szybką i powtórz tę samą operację, ale wybierz opcję wszystko. Wyjmij zużyte pipety, delikatnie wysuwając stopnie głowicy i odkręcając pipety od uchwytów. Oto przykład sieci bezpośrednich połączeń synaptycznych zmapowanych w poszczególnych eksperymentach.

Te trzy diagramy połączeń są zestawami 12 komórek parametalicznych zarejestrowanych w warstwie piątej z odpowiednimi odległościami somatycznymi. A oto diagram połączeń nałożony na barwienie morfologiczne zarejestrowanych komórek parametalicznych. Na rysunku przedstawiono efekt wspólnego sąsiada.

Niebieskie kolumny wskazują pary neuronów, które są jednocześnie połączone z co najmniej jednym innym neuronem w próbkowanej sieci. Dowód Znacznie zwiększone prawdopodobieństwo wzajemnego połączenia. Pokazane tutaj jest, że pary neuronów mających wielu wspólnych sąsiadów występują częściej niż oczekiwano przypadkowo w próbkowanych sieciach, prawdopodobieństwo połączenia w parach neuronów wzrasta w funkcji liczby wspólnych sąsiadów współdzielonych przez płatnika.

Te właściwości z kolei powodują powstawanie małych światowych sieci klastrowych. Rysunek ten przedstawia kwantyfikację rekrutacji komórek Martina nty. Jest to graficzna reprezentacja komórki parametalicznej w kolorze czerwonym, która tworzy synapsy na komórce Martina w kolorze niebieskim, która z kolei tworzy synapsę na drugiej komórce parametalicznej.

W czarnym progu nadkońcowym stymulacja komórki parametalicznej prowadzi do rekrutacji komórki Martina nty. Poprzez integrację ułatwiających pobudzanie potencjałów postsynaptycznych, rekrutowana komórka Martina Nty hamuje następnie drugą komórkę parametaliczną. Diagram ten przedstawia stymulację rosnącej liczby komórek parametalicznych z zaciskiem łatowym oraz wpływ na inne ogniwo parametaliczne.

Oto uśrednione hamujące potencjały postsynaptyczne zarejestrowane z komórki parametalowej w funkcji liczby innych pobliskich komórek parametalicznych, które są stymulowane. Amplituda hamowania synaptycznego DYS w obwodzie lokalnym ma tendencję do nasycania się, gdy stymulowanych jest dziewięć lub więcej komórek parametalicznych, a frakcja komórek otrzymujących hamowanie synaptyczne DYS szybko wzrasta do jednej w miarę stymulacji rosnącej liczby komórek parametalicznych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby końcówki pipet były czyste i minimalizować zniekształcenia tkanek, unikając naczyń krwionośnych i innych komórek w fazie zbliżania się.

Po tej procedurze można zastosować dodatkowe metody, takie jak fotostymulacja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak innowacyjność łatanych komórek zaciskowych przez inny typ komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przyspieszyć i wykonać procedurę zaciskania łaty dla wielu neuronów.