Name: Wspomagany komputerowo wieloelektrodowy system krosówek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę patch-clamp z wieloma elektrodami do badania małych obwodów neuronalnych. Technika umożliwia jednoczesny zapis do 12 komórek w trybie całokomórkowym, zwiększając efektywność i jakość danych elektrofizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Giladowi Silberbergowi, Michele Pignatelli, Thomasowi K. Bergerowi, Luce Gambazzi i Sonii Garcii za cenne rady dotyczące ulepszeń automatyzacji procedury zaciskania krosowego. Dziękujemy Rajnishowi Ranjanowi za cenne rady i pomoc we wdrożeniu oprogramowania. Prace te zostały częściowo sfinansowane przez unijny projekt Synapse, a częściowo przez program naukowy Human Frontiers.

1. Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>Sterowanie manipulatorami z komputera
	<ol>
		<li>Podłącz każdą skrzynkę sterownika mikromanipulatora do komputera przez porty szeregowe (RS-232).</li>
		<li>Zaimplementuj polecenia dotyczące pozycjonowania, odpytywania i dostosowywania ustawień, które mają być wysyłane przez port szeregowy. Biorąc pod uwagę problemy z szybkością i kompatybilnością sprzętową, C/C++ jest zalecany jako język programowania.</li>
		<li>Ustandaryzuj układ odniesienia manipulatorów tak, aby zero było najbliższym możliwym położeniem w stosunku do silników, a ruch dodatni był skierowany z dala od silników.</li>
		<li>Ustawić mikroskop w jego centralnym położeniu 2 mm powyżej płaszczyzny ogniskowej próbki (współrzędne [0, 0, 2000]).</li>
		<li>Dla każdego manipulatora należy zapisać współrzędne lokalne, które umożliwiają obserwację końcówki pipety w środku pola widzenia mikroskopu. Jest to początkowy punkt odniesienia dla każdej elektrody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja pozycji elektrod. Bardzo przydatna jest możliwość śledzenia pozycji każdej elektrody podczas eksperymentu. Reprezentacja graficzna jest najbardziej intuicyjnym sposobem osiągnięcia tego celu. W tym celu należy dopasować układy odniesienia każdej elektrody i mikroskopu. Prostym sposobem na osiągnięcie tego jest:
	<ol>
		<li>Przesuń końcówkę elektrody do środka pola view.</li>
		<li>Zapisz pozycję na każdej osi manipulatora i każdej osi mikroskopu.</li>
		<li>Wykonać osią x manipulatora stosunkowo duży ruch (1 mm).</li>
		<li>Zlokalizuj końcówkę jeszcze raz, poruszając tylko mikroskopem.</li>
		<li>Oblicz różnicę w położeniu mikroskopu od czasu ostatniego pomiaru. Są to rzuty ruchu osi elektrody na osie mikroskopu.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.3 - 2.5 dla osi Y i Z manipulatora elektrod. Pozwala to na wyznaczenie macierzy rzutów na osie mikroskopu (rysunek 2), zwanej również macierzą cosinusową: 
		<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq1.jpg"></li>
		<li>Odwróć tę matrycę, aby umożliwić obliczenie ruchów, w trzech wymiarach, wymaganych przez manipulator elektrody do osiągnięcia danej pozycji w układzie współrzędnych mikroskopu: 
		<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq2.jpg"></li>
		<li>Korzystając z początkowego punktu odniesienia i matrycy cosinusowej, określ położenie każdej elektrody we współrzędnych mikroskopu.</li>
		<li>Wyświetlaj graficznie, na podstawie współrzędnych mikroskopu, położenie każdej elektrody w regularnych odstępach czasu. Zdecydowaliśmy się użyć bibliotek rysunkowych C/C++ (GDI+) do rysowania pozycji elektrod co 40 ms.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.2.1 - 1.2.7 za każdym razem, gdy zmieniane są kąty manipulatora lub jeśli potrzebna jest zmiana położenia o kilka milimetrów, na przykład, gdy zmienia się typ elektrody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umożliwiają zapamiętywanie pozycji istotnych cech w tkance, takich jak komórki lub anatomiczne punkty odniesienia, we współrzędnych mikroskopu.</li>
	<li>Uzyskaj odpowiednie informacje wideo i nałóż je.
	<ol>
		<li>Mechanicznie wyrównaj oś ruchu x mikroskopu z osią poziomą kamery mikroskopu.</li>
		<li>Zainstaluj na komputerze framegrabber z funkcją wideo na żywo i nakładką oraz zestaw narzędzi do tworzenia oprogramowania (SDK).</li>
		<li>Zaimplementuj operację wyświetlania wideo na żywo za pomocą zestawu SDK.</li>
		<li>Przekształć układ współrzędnych mikroskopu w układ odniesienia kamery poprzez odpowiednią translację i skalowanie.</li>
		<li>Narysuj odpowiednie cechy we współrzędnych kamery i nałóż na obraz na żywo uzyskany obraz w regularnych odstępach czasu około 40 ms (rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzmacniacze sterujące.
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania wzmacniacza, aby sterować ustawieniami wzmacniacza z interfejsu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oscyloskopy kontrolne.
	<ol>
		<li>Podłącz oscyloskopy do komputera za pomocą portów szeregowych.</li>
		<li>Określ skalę oscyloskopu, sprzężenie i rozdzielczość czasową dla różnych etapów procedury zacisku krosowego w zacisku napięciowym (np. elektroda w kąpieli, tworzenie uszczelnienia, konfiguracja całego ogniwa) i cęgach prądowych.</li>
		<li>Wysyłaj odpowiednie polecenia ustawień oscyloskopu za każdym razem, gdy polecenia wzmacniacza są wydawane z interfejsu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontroluj ciśnienie w pipetach.
	<ol>
		<li>Zamontować system kontroli ciśnienia zgodnie z rysunkiem 4.
		<ol>
			<li>Użyj zasilacza 12 V/5 V, aby odpowiednio zasilić każdy element elektroniczny.</li>
			<li>Podłączyć wyjście jednej pompy membranowej do bufora nadciśnieniowego (pojemnik o pojemności 100 ml).</li>
			<li>Podłączyć wejście jednej pompy membranowej do bufora podciśnienia (pojemnik o pojemności 100 ml).</li>
			<li>Podłącz rurkę uchwytu pipety do czujnika ciśnienia w układzie kontroli ciśnienia i zaworu pneumatycznego, który łączy się z główną komorą ciśnieniową.</li>
			<li>Podłącz każdy z ciśnieniowych do zaworu podłączonego do głównej komory ciśnieniowej.</li>
			<li>Podłączyć zawór między główną komorą ciśnieniową a atmosferą.</li>
			<li>Podłącz czujnik ciśnienia do głównej komory ciśnieniowej.</li>
			<li>Podłącz czujnik ciśnienia do każdego bufora.</li>
			<li>Podłącz system kontroli ciśnienia do karty akwizycji danych.</li>
			<li>Podłącz każdy czujnik ciśnienia do jednego wejścia analogowego.</li>
			<li>Podłącz każdy zawór do wyjścia cyfrowego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usuń przesunięcie ciśnienia atmosferycznego ze wszystkich czujników, otwierając wszystkie zawory z wyjątkiem tych, które łączą się z pompami membranowymi i odejmując zmierzone ciśnienie.</li>
		<li>Sterowanie ciśnieniem osprzętu roboczego
		<ol>
			<li>Zdefiniuj w interfejsie element sterujący, aby aktywować lub dezaktywować sterowanie nadciśnieniem dla każdej pipety.</li>
			<li>Określ minimalne nadciśnienie dla pipet na poziomie około 70 mbar.</li>
			<li>Okresowo (co 0,5 sekundy) wykrywaj, kiedy ciśnienie w pipetach pod aktywną kontrolą ciśnienia spadnie poniżej ustawionego progu.</li>
			<li>Po przekroczeniu progu należy otworzyć bufor nadciśnienia do głównego przedziału ciśnieniowego, a następnie w kierunku danej pipety przez krótki czas (20 ms), aż ciśnienie w pipetach przekroczy próg. Zamknij wszystkie inne zawory.</li>
			<li>Wyłącz dalszą kontrolę ciśnienia, gdy inicjowane jest ostateczne podejście do komórki będącej przedmiotem zainteresowania.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zastosuj podciśnienie do formowania uszczelnienia
		<ol>
			<li>Zamknąć wszystkie zawory i otworzyć podciśnieniowy zawór buforowy w kierunku głównej komory ciśnieniowej, a tę komorę w kierunku danej pipety na czas wymagany przez eksperymentatora, przytrzymując wciśnięty przycisk.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Centralizacja poleceń na urządzeniu interfejsu użytkownika.
	<ol>
		<li>Podłącz dostępny w handlu bezprzewodowy gamepad do komputera.</li>
		<li>Zaimplementuj odczyt stanu joysticka. Na przykład użyj bibliotek DirectX dla C/C++, aby wykonywać odczyty co 5 ms.</li>
		<li>Porównaj bieżący stan z poprzednim stanem, aby wykryć, które przyciski zostały naciśnięte, zwolnione lub przytrzymane od ostatniego kroku czasowego.</li>
		<li>Przypisz funkcje do każdego przycisku w padzie. Przykład takiego odwzorowania pokazano na rysunku 5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Procedura zacisku krosowego
<ol>
	<li>Przygotuj wycinki mózgu w obszarze zainteresowania.</li>
	<li>Umieść interesujący Cię wycinek mózgu, tak aby obszar zainteresowania znajdował się w środku zakresu przemieszczenia mikroskopu.</li>
	<li>Zaznaczanie komórek
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj interesujące Cię komórki, przeglądając za pomocą mikroskopu. Zapisz pozycję komórek w oparciu o układ współrzędnych mikroskopu, klikając prawym przyciskiem myszy na ekranie wideo na żywo nad interesującą komórką.</li>
		<li>Interfejs graficzny wyświetli wybrane komórki, a także mikropipety w celu uzyskania globalnego przeglądu, a oprogramowanie doda znacznik pozycji komórki, który zostanie nałożony na obrazy. Dodatkowo obraz komórki jest przechwytywany do wykorzystania w przyszłości w pliku "Cell#.jpg".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przypisanie komórek do pipet
	<ol>
		<li>Po wybraniu interesujących Cię komórek przypisz, która pipeta będzie rejestrować każdą komórkę. Interfejs graficzny zawiera elementy sterujące przypisaniem, które należy ustawić. Wizualizuj podgląd końcowej konfiguracji, zaznaczając pole wyboru "Pokaż pozycje końcowe".</li>
		<li>Wybierz każdą pipetę, dla której pożądany jest podgląd końcowej pozycji, lub zaznacz pole wyboru "Zaznacz wszystko". W razie potrzeby wyłącz wyświetlanie bieżącej pozycji, aby uzyskać lepszą wizualizację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie pipet
	<ol>
		<li>Napełnij pipety (6 - 8 MΩ są zwykle najlepsze, jeśli używa się wielu pipet) roztworem wewnątrzkomórkowym i załaduj je do uchwytów. Umieść stopnie czołowe w ich mocowaniach, ale nie przesuwaj ich do przodu, aby uniknąć dotykania wanny końcówką pipety.</li>
		<li>Włącz kontrolę nadciśnienia i wybierz wszystkie pipety, aby upewnić się, że końcówki pozostaną czyste. Delikatnie wsuń każdy stopień głowy na miejsce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lokalizowanie końcówek do pipet
	<ol>
		<li>Ustaw mikroskop w pozycji środkowej z ostrością 3 mm nad plasterkiem, naciskając przycisk R2, przytrzymując przycisk "A". Użyj odpowiedniej pozycji dla każdego manipulatora, zapisanej z poprzedniego eksperymentu, naciskając przycisk L2 i przytrzymując przycisk A. 
		Uwaga: W tym momencie w polu widzenia powinien być albo charakterystyczny cień pipety, albo niewielki ruch wzdłuż osi pipety powinien wystarczyć, aby go zaobserwować w większości przypadków. Kompensacja niewielkich różnic w kształcie pipety musi być wykonywana ręcznie.</li>
		<li>Ustaw ostrość końcówki pipety. Umieść końcówkę na czerwonej centralnej kropce wyświetlacza wideo, nie przesuwając mikroskopu (powinna nadal znajdować się w pozycji [0, 0, 2000]).</li>
		<li>Poinformuj oprogramowanie, że pipeta znajduje się na środku wyświetlacza, naciskając przycisk Z, przytrzymując jednocześnie przycisk C. Po zlokalizowaniu każdej końcówki pipety należy ją odesłać do tyłu, aby można było zlokalizować następną, naciskając przycisk L1 i przytrzymując przycisk A.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbliżanie się do cel
	<ol>
		<li>Po dokładnym zlokalizowaniu wszystkich końcówek pipet i przypisaniu każdej pipety do komórki, automatycznie umieść pipety w pobliżu odpowiednich komórek. Po prostu kliknij prawym przyciskiem myszy środek grupy komórek i wybierz opcję "Klaster" z menu podręcznego. W wyświetlonym oknie opcji klastra wybierz wszystkie pipety, które chcesz w tej chwili ustawić, a następnie kliknij opcję "Idź ze wszystkimi zaznaczonymi pipetami". Powtórz tę operację dla każdego klastra komórek, który Cię interesuje.</li>
		<li>Wykonaj ostatnie podejście ręcznie. Położenie pipet względem komórek może być określone w różny sposób, ale zwykle wynosi po prostu 200 μm od celi w osi pipety i 200 μm nad nią w kierunku pionowym, co wystarczy, aby końcówka pipety znajdowała się na zewnątrz tkanki. Poczekaj, aż ustawienie pipet zostanie zakończone i przesuń mikroskop w kierunku pipety, naciskając przycisk R1, przytrzymując przycisk C.</li>
		<li>Ponownie skalibruj każdą pozycję pipety, ustawiając ostrość mikroskopu na jej końcówce w dowolnym miejscu na wyświetlaczu wideo i naciskając przycisk B, przytrzymując przycisk C. Na chwilę powinna pojawić się kwadratowa siatka wskazująca zidentyfikowane położenie pipety. Jeśli pozycja nie jest prawidłowa, umieść końcówkę na środkowej kropce wyświetlacza wideo i naciśnij przycisk Z, przytrzymując przycisk C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustanawianie konfiguracji dołączonej do komórki
	<ol>
		<li>Upewnij się, że komórka zainteresowania bieżącej pipety jest prawidłowo oznaczona. W przeciwnym razie przesuń mikroskop, aby dopasować interesującą komórkę do centralnej czerwonej kropki. Zaznacz celę, naciskając przycisk Y, przytrzymując przycisk C. Naciśnij przycisk L2, przytrzymując przycisk C, aby ustawić pipetę w odległości 200 μm od przypisanej celi, mikroskop automatycznie przesunie się do odpowiedniej pozycji.</li>
		<li>Dostosuj położenie pipety tak, aby pasowała do czerwonej kropki. Wyreguluj przesunięcie pipety, naciskając przycisk R1 i przytrzymując przycisk X.</li>
		<li>Aktywuj impuls testowy, naciskając przycisk L1 i przytrzymując przycisk X. Powoli zbliż pipetę do przypisanej jej celi.</li>
		<li>Obserwując tworzenie się wgłębienia na powierzchni błony komórki, zastosuj krótki impuls podciśnienia, naciskając przycisk Y, przytrzymując przycisk Z, aby przyłożone ciśnienie dotarło do komórki. Potencjał podtrzymania około -65mV powinien zostać ustalony w tym momencie poprzez naciśnięcie przycisku L2 przy jednoczesnym przytrzymaniu przycisku X.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja całej komórki
	<ol>
		<li>Po utworzeniu giga-uszczelki dla każdej komórki, zacznij rozrywać membrany, stosując podciśnienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonywanie nagrań
	<ol>
		<li>Użyj systemu stymulacji/akwizycji, aby wykonać swoje nagrania. Zastosuj impulsy lub ciągi impulsów do jednej pojedynczej komórki na raz i obserwuj odpowiedzi na pozostałe komórki, aby zmapować łączność między zarejestrowanymi komórkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pipety cofające
	<ol>
		<li>Po zakończeniu nagrań powoli odsuń pipety od tkanki, klikając prawym przyciskiem myszy przycisk radiowy Tabela. Wybierz opcję "Recede-&gt;Pipety 500 μm", aby pipety cofnęły się na niewielką odległość wzdłuż swoich osi. Obserwuj dryf potencjału komórek (pomocne może być oczyszczenie końcówek poprzez zastosowanie dodatniego ciśnienia).</li>
		<li>Aby całkowicie cofnąć pipety, ustaw prędkość pozycjonowania na "Szybka" i powtórz tę samą operację, ale wybierz opcję "Wszystkie". Wyjmij zużyte pipety, delikatnie wysuwając głowice i odkręcając pipety od uchwytów. Zaleca się unikanie skręcania uchwytów w gniazdach, ponieważ może to znacznie zakłócić położenie końcówki pipety.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li>
<li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473(2010).</li>
<li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense%2C+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons%3A+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li>
<li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network%3A+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition%2C+excitation+and+bistable+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li>
<li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li>
<li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li>
<li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single%2C+Genetically+Targeted+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003(2011).</li>
<li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLM+Microscopy%3A+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zwykle od razu nasuwa się pytanie o stopień powodzenia opisanej przez nas procedury. Aby uzyskać wysokie wskaźniki sukcesu, niezbędne jest przygotowanie. Pipety muszą mieć otwory na końcówki, które są odpowiednie dla rejestrowanych komórek. Ważne jest również filtrowanie roztworu wewnątrzkomórkowego, aby uniknąć zatkania pipet. Kolejnym wymogiem są wyjątkowo czyste, świeżo wyciągnięte pipety. Rozkład dwumianowy jest najprostszym modelem, który można wykorzystać do zrozumienia, w jaki sposób te kwestie wpływają na ostatec...

Zdolność do rejestrowania i stymulowania wielu miejsc z mikrometrową precyzją jest niezwykle przydatna do eksperymentalnego osiągnięcia lepszego zrozumienia systemów neuronalnych. W tym celu opracowano wiele technik, ale żadna z nich nie pozwala na uzyskanie rozdzielczości submiliwoltowej osiągniętej za pomocą techniki patch-clamp, niezbędnej do badania aktywności podprogowej i indywidualnych potencjałów postsynaptycznych. W tym miejscu zajmiemy się opracowaniem dwunastoelektrodowego, wspomaganego komputerowo systemu patch-clamp, którego celem jest jednoczesne rejestrowanie i stymulowanie dużej liczby pojedynczych komórek z wystarczającą precyzją do badania połączeń neuronalnych. Chociaż można wyobrazić sobie wiele innych zastosowań dla takiego systemu, szczególnie dobrze nadaje się on do badania połączeń synaptycznych, biorąc pod uwagę, że liczba możliwych połączeń w grupie neuronów rośnie proporcjonalnie do kwadratu liczby neuronów, o których mowa. O ile więc system z trzema elektrodami pozwala na badanie występowania do sześciu połączeń i najczęściej rejestrację pojedynczego, o tyle rejestracja dwunastu neuronów pozwala na testowanie występowania do 132 połączeń i często obserwowanie kilkunastu połączeń (ryc. 1). Obserwacja dziesiątek połączeń jednocześnie umożliwia analizę organizacji małych sieci i wnioskowanie o statystycznych właściwościach struktury sieci, których nie można zbadaćw inny sposób1. Co więcej, precyzyjna stymulacja wielu komórek pozwala również na ilościowe określenie rekrutacji komórek postsynaptycznych2.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>40X Immersyjne</td></tr><tr><td>manipulatory obiektywowe</td><td>Luigs Neumann</td><td>SM-5</td><td>Używany protokół szeregowy</td></tr><tr><td>Wzmacniacze</td><td>Axon Instruments</td><td>MultiClamp 700B</td><td>SDK</td></tr><tr><td>używany Kamera</td><td>Till Photonics</td><td>VS 55</td><td>BNC Wyjście analogowe</td></tr><tr><td>Framegrabber</td><td>Translacja danych</td><td>DT3120</td><td>SDK używany</td></tr><tr><td>Oscyloskopy</td><td>Tektronix</td><td>TDS 2014</td><td>Komunikacja szeregowa</td></tr><tr><td>Akwizycja danych</td><td>InstruTECH</td><td>ITC 1600</td><td></td></tr><tr><td>Akwizycja danych</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6221</td><td>Używana biblioteka (.dll)</td></tr><tr><td>Zawór ciśnieniowy</td><td>SMC</td><td>SMC070C-6BG-32</td><td></td></tr><tr><td>Czujnik ciśnienia</td><td>Honeywell</td><td>24PCDFA6G</td><td></td></tr><tr><td>Membrana pompa</td><td>Schego</td><td>Optimal</td><td></td></tr></tbody></table>

wspomagany komputerowo wieloelektrodowy system krosówek

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Technika patch-clamp jest dziś najbardziej znaną metodą rejestrowania aktywności elektrycznej z pojedynczych neuronów lub ich subkomórkowych przedziałów. Niemniej jednak uzyskanie stabilnych zapisów, nawet z pojedynczych komórek, pozostaje czasochłonną procedurą o znacznym stopniu złożoności. Automatyzacja wielu kroków w połączeniu z wydajnym wyświetlaniem informacji może znacznie pomóc eksperymentatorom w wykonywaniu większej liczby nagrań z większą niezawodnością i w krótszym czasie. Doszliśmy do wniosku, że aby uzyskać nagrania na dużą skalę, najbardziej efektywnym podejściem nie jest pełna automatyzacja procesu, ale uproszczenie etapów eksperymentu i zmniejszenie ryzyka błędu ludzkiego, przy jednoczesnym efektywnym uwzględnieniu doświadczenia eksperymentatora i wizualnej informacji zwrotnej. Mając na uwadze te cele, opracowaliśmy wspomagany komputerowo system, który centralizuje wszystkie elementy sterujące niezbędne do eksperymentu z wieloelektrodowym zaciskiem krosowym w jednym interfejsie, dostępnym na rynku bezprzewodowym padzie do gier, jednocześnie wyświetlając informacje związane z eksperymentem i wskazówki na ekranie komputera. W tym miejscu opisujemy różne elementy systemu, które pozwoliły nam skrócić czas potrzebny na osiągnięcie konfiguracji nagrywania i znacznie zwiększyć szanse na pomyślne nagrywanie dużej liczby neuronów jednocześnie.

Stosując metody opisane powyżej, udało nam się przeprowadzić rejestrację całych komórek do dwunastu neuronów jednocześnie, prawie podwajając największą liczbę neuronów jednocześnie zaciśniętych do tej pory. Przykłady sieci bezpośrednich połączeń synaptycznych między neuronami piramidowymi zarejestrowanych w warstwie V kory somatosensorycznej szczurów pokazano na rycinie 6.
Określenie profili prawdopodobieństwa połączenia jako funkcji odległości międzysomatycznej dla danego typ...

Wieloelektrodowe nagrania patch-clamp stanowią skomplikowane zadanie. Pokazujemy tutaj, w jaki sposób, poprzez automatyzację wielu etapów eksperymentu, można przyspieszyć proces prowadzący do jakościowej poprawy wydajności i liczby nagrań.

Wspomagany komputerowo wieloelektrodowy system krosówek

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie nagrań typu patch clamp do 12 komórek w trybie całej komórki. W tym celu należy najpierw zaznaczyć pozycję każdej interesującej komórki i przypisać do każdej komórki pipetę. Drugim krokiem jest zlokalizowanie końcówki każdej pipety i automatyczne przesunięcie pipet obok przypisanych im komórek.Następnie podchodź do każdej komórki z jedną pipetą na raz. Aby ustanowić szczelne uszczelnienia z błoną komórkową, ostatnim krokiem jest pęknięcie błony komórek i wykonanie nagrań całych komórek. Ostatecznie, wspomagane komputerowo nagrywanie wieloelektrodowych krosówek służy do pokazania właściwości sieciowych małych obwodów neuronalnych z wysoką rozdzielczością.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ręczny zacisk krosowy, jest to, że liczba połączeń, które można zaobserwować w sieci, rośnie wraz z kwadratem liczby rejestrowanych neuronów. Wizualna demonstracja tej techniki jest ważna, ponieważ kroki zacisku krosowego mogą być trudne do nauczenia się ze względu na złożoność i szybkość, z jaką należy je wykonać. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia wycinka mózgu z obszarem zainteresowania w środku zakresu przemieszczenia mikroskopu.Następnie zidentyfikuj interesujące Cię komórki. Następnie zapisz położenie komórek w oparciu o układ współrzędnych mikroskopu. Interfejs graficzny wyświetli wybrane komórki, a także mikropipety w celu uzyskania globalnego przeglądu, a oprogramowanie doda znacznik pozycji komórki, który zostanie nałożony na obrazy.Dodatkowo przechwytywany jest obraz komórki do wykorzystania w przyszłości. Po wybraniu interesujących Cię komórek przypisz pipety, które będą używane do rejestrowania poszczególnych komórek, ustawiając elementy sterujące przypisania w interfejsie graficznym. Wizualizuj podgląd końcowej konfiguracji, zaznaczając pole wyboru pokaż końcowe pozycje.Teraz przygotuj pipety z roztworem wewnątrzkomórkowym i umieść je na uchwytach. Umieść stopnie głowy w ich mocowaniach, ale nie przesuwaj ich do przodu. Aby uniknąć dotykania wanny końcówką pipety, włącz kontrolę nadciśnienia i wybierz wszystkie pipety.Aby upewnić się, że końcówki pozostaną czyste, delikatnie wsuń każdą głowicę stage na miejsce. Następnie ustaw mikroskop w pozycji środkowej z ostrością dwa milimetry nad plasterkiem, naciskając przycisk R dwa, przytrzymując przycisk A. Użyj odpowiedniej pozycji dla każdego manipulatora, tak jak jest to zapisane w poprzednim eksperymencie, naciskając przycisk L dwa przytrzymując przycisk A.At tym momencie, w polu widzenia powinien znajdować się wyraźny cień pipety lub powinien wystarczyć niewielki ruch wzdłuż osi pipet aby go obserwować. Kompensacja niewielkich różnic w kształcie pipety musi być wykonywana ręcznie.Następnie ustaw ostrość końcówki pipety. Następnie umieść końcówkę na czerwonej centralnej kropce wyświetlacza wideo. Nie poruszając mikroskopem, poinformuj oprogramowanie, że pipeta znajduje się na środku wyświetlacza, naciskając przycisk Z i przytrzymując przycisk C na sterowniku.Po umieszczeniu pojedynczej końcówki pipety przesuń ją do tyłu, aby można było zlokalizować następną, naciskając przycisk L jeden i przytrzymując przycisk a. Po dokładnym zlokalizowaniu wszystkich końcówek pipet i przypisaniu każdej pipety do komórki. Pipety można automatycznie ustawić blisko odpowiednich komórek, klikając prawym przyciskiem myszy środek grupy komórek w oknie reprezentacji graficznej i wybierając klaster opcji z menu podręcznego.W oknie opcji klastra zaznacz wszystkie pipety, które chcesz w tej chwili ustawić, a następnie kliknij przycisk Idź z zaznaczonymi pipetami. Powtórz tę procedurę dla każdego klastra komórek będących przedmiotem zainteresowania. Aby wykonać końcowe podejście, określ położenie pipet względem komórek jako 200 mikronów od celi w osi pipety i 200 mikronów nad nią w kierunku pionowym, co wystarczy, aby końcówka pipety znajdowała się na zewnątrz tkanki.Następnie poczekaj, aż ustawienie pipet zostanie zakończone. Następnie przesuń mikroskop w kierunku pipety, naciskając jeden przycisk R, przytrzymując przycisk C. Ponownie skalibruj pozycję każdej pipety, ustawiając ostrość mikroskopu na jej końcówce w dowolnym miejscu na wyświetlaczu wideo i naciskając przycisk B, przytrzymując przycisk C.Na chwilę powinna pojawić się kwadratowa siatka wskazująca zidentyfikowane położenie pipety. Jeśli pozycja nie jest prawidłowa, umieść końcówkę na środkowej kropce wyświetlacza wideo i naciśnij przycisk Z, przytrzymując przycisk C kontrolera.Teraz upewnij się, że komórka zainteresowania dla bieżącej pipety jest prawidłowo oznaczona, aktywnie oznaczona. W przeciwnym razie przesuń mikroskop, aby dopasować interesującą Cię komórkę do centralnej czerwonej kropki, zaznaczając komórkę, naciskając przycisk Y, przytrzymując przycisk C. Następnie naciśnij przycisk L dwa, przytrzymując przycisk, C.To ustawić pipetę w odległości 200 mikronów od przypisanej komórki, mikroskop automatycznie przesunie się do odpowiedniej pozycji. Dostosuj położenie pipety tak, aby pasowała do czerwonej kropki.Następnie wyreguluj przesunięcie pipety, naciskając przycisk R one. Przytrzymując przycisk x. Aktywuj impuls testowy, naciskając przycisk L jeden i przytrzymując przycisk x.Następnie powoli przenieś pipetę do przypisanej jej komórki. Po zaobserwowaniu tworzenia się wgłębienia na powierzchni błony komórki, zastosuj krótki impuls podciśnienia, naciskając przycisk Y, przytrzymując przycisk Z, aby przyłożone ciśnienie dotarło do komórki. W tym momencie należy ustalić potencjał podtrzymania około minus 65 miliwoltów, naciskając przycisk L two i przytrzymując przycisk x.Gdy dla każdej komórki utworzy się giga uszczelnienie, zacznij rozrywać błony, stosując podciśnienie. Następnie użyj systemu akwizycji stymulacji, aby wykonać nagranie. Zastosuj impulsy lub ciągi impulsów do poszczególnych komórek pojedynczo i obserwuj reakcje pozostałych komórek, aby zmapować łączność między tymi zarejestrowanymi komórkami.Po zakończeniu nagrań powoli odsuń pipety od tkanki, klikając prawym przyciskiem myszy przycisk radiowy tabeli. Wybierz pipety cofnięte o 500 mikronów, aby pipety cofnęły się na niewielką odległość wzdłuż swoich osi. Następnie obserwuj dryf w potencjale komórek do cofania pipet.Ustaw szybkość pozycjonowania na szybką i powtórz tę samą operację, ale wybierz opcję wszystko. Wyjmij zużyte pipety, delikatnie wysuwając stopnie głowicy i odkręcając pipety od uchwytów. Oto przykład sieci bezpośrednich połączeń synaptycznych zmapowanych w poszczególnych eksperymentach.Te trzy diagramy połączeń są zestawami 12 komórek parametalicznych zarejestrowanych w warstwie piątej z odpowiednimi odległościami somatycznymi. A oto diagram połączeń nałożony na barwienie morfologiczne zarejestrowanych komórek parametalicznych. Na rysunku przedstawiono efekt wspólnego sąsiada.Niebieskie kolumny wskazują pary neuronów, które są jednocześnie połączone z co najmniej jednym innym neuronem w próbkowanej sieci. Dowód Znacznie zwiększone prawdopodobieństwo wzajemnego połączenia. Pokazane tutaj jest, że pary neuronów mających wielu wspólnych sąsiadów występują częściej niż oczekiwano przypadkowo w próbkowanych sieciach, prawdopodobieństwo połączenia w parach neuronów wzrasta w funkcji liczby wspólnych sąsiadów współdzielonych przez płatnika.Te właściwości z kolei powodują powstawanie małych światowych sieci klastrowych. Rysunek ten przedstawia kwantyfikację rekrutacji komórek Martina nty. Jest to graficzna reprezentacja komórki parametalicznej w kolorze czerwonym, która tworzy synapsy na komórce Martina w kolorze niebieskim, która z kolei tworzy synapsę na drugiej komórce parametalicznej.W czarnym progu nadkońcowym stymulacja komórki parametalicznej prowadzi do rekrutacji komórki Martina nty. Poprzez integrację ułatwiających pobudzanie potencjałów postsynaptycznych, rekrutowana komórka Martina Nty hamuje następnie drugą komórkę parametaliczną. Diagram ten przedstawia stymulację rosnącej liczby komórek parametalicznych z zaciskiem łatowym oraz wpływ na inne ogniwo parametaliczne.Oto uśrednione hamujące potencjały postsynaptyczne zarejestrowane z komórki parametalowej w funkcji liczby innych pobliskich komórek parametalicznych, które są stymulowane. Amplituda hamowania synaptycznego DYS w obwodzie lokalnym ma tendencję do nasycania się, gdy stymulowanych jest dziewięć lub więcej komórek parametalicznych, a frakcja komórek otrzymujących hamowanie synaptyczne DYS szybko wzrasta do jednej w miarę stymulacji rosnącej liczby komórek parametalicznych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby końcówki pipet były czyste i minimalizować zniekształcenia tkanek, unikając naczyń krwionośnych i innych komórek w fazie zbliżania się.Po tej procedurze można zastosować dodatkowe metody, takie jak fotostymulacja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak innowacyjność łatanych komórek zaciskowych przez inny typ komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przyspieszyć i wykonać procedurę zaciskania łaty dla wielu neuronów.

a-computer-assisted-multi-electrode-patch-clamp-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy materiał stanowi wprowadzenie do rejestracji metodą patch clamp z oocytów Xenopus laevis. Obejmuje on usuwanie błony witelinowej, tworzenie uszczelnienia gigaomowego (gigaseal) oraz opcjonalną konwersję patcha do topologii outside-out.

Rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

Ten film demonstruje charakterystykę prądów kationowych z kanałów jonowych melastatyny typu 4 (TRPM4) o potencjale przejściowym w komórkach mięśni gładkich detruzja za pośrednictwem amfoterycyny-B. Technika ta pomaga ocenić właściwości biofizyczne i farmakologiczne kanałów jonowych.

Analiza perforowanego zacisku krosowego za pośrednictwem amfoterycyny-B: elektrofizjologiczna technika badania prądów jonowych w komórkach pęcherza moczowego

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać automatyczne eksperymenty z zaciskami krosowymi sterowanymi obrazem przy użyciu niedawno opracowanego systemu dla standardowego sprzętu do elektrofizjologii in vitro.

Zastosowanie zautomatyzowanego zacisku krosowego sterowanego obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu

Ten manuskrypt opisuje zastosowania elektrod selektywnych protonów i metod zaciskania krostek do pomiaru aktywności systemów transportu protonów. Metody te przezwyciężają pewne ograniczenia technik powszechnie stosowanych do badania aktywności transportu protonów, takie jak umiarkowana czułość, rozdzielczość czasowa i niewystarczająca kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego.

Zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych

Zapis jednowłóknisty to skuteczna technika elektrofizjologiczna, która ma zastosowanie do ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Wraz z przygotowaniem nienaruszonego DRG z przyczepionym nerwem kulszowym badany jest mechanizm niewydolności przewodzenia. Oba protokoły poprawiają zrozumienie związku obwodowego układu nerwowego z bólem.

Zastosowanie zapisu pojedynczego włókna in vivo i nienaruszonego zwoju korzenia grzbietowego z przyczepionym nerwem kulszowym w celu zbadania mechanizmu uszkodzenia przewodzenia

W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowywania adaptowanych do ciemności skrawków siatkówki mysiej do pomiarów elektrofizjologicznych.

Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Poznaj zautomatyzowaną metodę patch-clamp z wieloma elektrodami do badania małych obwodów neuronalnych. Technika umożliwia jednoczesny zapis do 12 komórek w trybie całokomórkowym, zwiększając efektywność i jakość danych elektrofizjologicznych.

Wspomagany komputerowo wieloelektrodowy system krosówek

Przeglądaj więcej filmów