Name: Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: Poznaj metodę kraniotomii i dwufotonowej mikroskopii in vivo do długoterminowego obrazowania neuronów w korze zaśledzinowej myszy. Technika umożliwia monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować M. Steczkowskiemu za nagrania głosowe, M. Borczykowi za rysunki, A. Trąbczyńskiej za produkcję wirusa, M. Ziókowskiej za genotypowanie i A. Mirgosowi za pomoc przy filmowaniu. K.R. dziękuje za dar rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) wykazującego ekspresję białka fluorescencyjnego mCherry pod kontrolą promotora CaMK z K. Deisseroth. Projekt został zrealizowany w obiektach Laboratorium Modeli Zwierzęcych oraz Laboratorium Struktury i Funkcji Tkanek Centrum Neurobiologii Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, z wykorzystaniem infrastruktury CePT finansowanej przez Unię Europejską – Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego "Innowacyjna Gospodarka" na lata 2007-2013. Praca została wsparta grantami Narodowego Centrum Nauki: Sonata Bis 2012/05/E/NZ4/02996, Harmonia 2013/08/M/NZ3/00861, Symfonia 2013/08/W/NZ24/00691 dla K.R. oraz Sonata Bis 2014/14/E/NZ4/00172 dla R.C.

Wszystkie procedury eksperymentalne opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Lokalną Komisję Etyczną w Instytucie Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego Polskiej Akademii Nauk.
Uwaga: Niektóre sceny w powiązanym filmie są przyspieszone. W tych scenach wskazywany jest współczynnik prędkości.
1. Przygotowanie do operacji
<ol>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia, szklane pojemniki na płyny i waciki w autoklawie. Używaj jednorazowych rękawiczek. Wyczyść stół chirurgiczny, ramę stereotaktyczną i całe otoczenie 70% etanolem. Użyj sterylnej podkładki chirurgicznej, aby stworzyć sterylną przestrzeń dla całego wysterylizowanego sprzętu. Pokrój piankę żelową na małe kawałki i namocz je w sterylnej soli fizjologicznej. 
	Uwaga: Zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich użytkowania, etanol nie jest ani środkiem sterylizującym, ani środkiem dezynfekującym wysokiego poziomu. Powinien być stosowany wyłącznie jako środek czyszczący/odtłuszczający na wcześniej wysterylizowanych powierzchniach.</li>
	<li>Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i ustaw poziom izofluranu na 5%, a przepływ tlenu na 2 l/min. Ta procedura powinna zająć około 3 minut.</li>
	<li>Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej. Użyj szczypania ogona lub palców u nóg, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni uspokojone.</li>
	<li>Za pomocą precyzyjnego trymera ogol włosy od tyłu głowy (między uszami) aż do oczu.</li>
	<li>Umieść zwierzę w ramie stereotaktycznej i ustabilizuj głowę za pomocą nauszników.</li>
	<li>Ustaw poziom znieczulenia na 1,5-2% izofluranu i 0,3 l/min tlenu.</li>
	<li>Nałóż maść na oczy.</li>
	<li>Zwierzę należy wstrzyknąć podskórnie tolfedynę (4 mg/kg), butomidor (2 mg/kg) i Baytril (5 mg/kg), aby zapobiec odpowiednio zapaleniu, bólowi i infekcji.</li>
	<li>Wstrzyknąć zwierzęciu domięśniowo deksametazon (0,2 mg/kg), aby zapobiec obrzękowi mózgu. 
	nuta: Możliwe jest wstrzyknięcie deksametazonu podskórnie lub dootrzewnowo w celu zapobieżenia uszkodzeniu mięśni.</li>
	<li>Oczyść skórę za pomocą sterylnych wacików bawełnianych z Betadine, a następnie 70% etanolem.</li>
	<li>Zmień rękawice i spryskaj je 70% etanolem. 
	nuta: Podczas używania rękawiczek jednorazowych nie należy dotykać sterylnego pola. Dotykaj zwierzęcia wyłącznie końcówkami sterylnych narzędzi chirurgicznych i sterylnymi wacikami.</li>
</ol>
2. Chirurgia okna czaszkowego
<ol>
	<li>Podnieś skórę kleszczami i za pomocą mikronożyczek nacinaj skórę poziomo wzdłuż podstawy głowy, a następnie ukośnie do przedniego punktu między oczami. Zdjąć płatek skóry.</li>
	<li>Nałóż maść lidokainową za pomocą sterylnego wacika na okostną, aby zapobiec nadmiernemu krwawieniu i bólowi.</li>
	<li>Użyj sterylnych wacików bawełnianych lub skalpela, aby usunąć okostną. Osusz czaszkę sterylnymi wacikami.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej igły nałóż gęsty klej cyjanoakrylowy na krawędzie skóry, aby je unieruchomić i zapobiec kontaktowi z cementem dentystycznym. Poczekaj, aż klej wyschnie.</li>
	<li>Połóż sterylne szkło nakrywkowe o średnicy 3 mm na czaszce z przodu szwu lambdoidalnego. Wyśrodkować szkiełko nakrywkowe na współrzędnych RSC: AP, bregma -2.8; ML, bregma 0. Zaznacz krawędzie szkiełka nakrywkowego, drapiąc powierzchnię czaszki sterylną igłą. Włóż szkło nakrywkowe z powrotem do sterylnego pojemnika z 70% etanolem.</li>
	<li>Użyj szybkoobrotowej wiertarki dentystycznej z zadziorem o małej średnicy, aby obrysować okrąg o średnicy 3 mm. Oczyść miejsce wiercenia z pyłu kostnego za pomocą sterylnych wacików nasączonych solą fizjologiczną. Użyj pianki żelowej i wacików, aby zatrzymać sporadyczne krwawienie i oczyścić kość.</li>
	<li>Pomiędzy wierceniem sprawdź grubość kości za pomocą cienkich kleszczy, delikatnie dotykając koła kości i sprawdzając jej ruchomość. Należy pamiętać, że kość jest grubsza w obszarze szwu. Przerwij wiercenie, gdy koło kostne jest ruchome, a na obwodzie pozostaje tylko równa, cienka warstwa kości. Oczyść pole operacyjne z całego pozostałego pyłu kostnego za pomocą wacików nasączonych solą fizjologiczną.</li>
	<li>Upuść sterylną sól fizjologiczną na obszar wiercenia, zakrywając wywiercony okrąg. Ostrożnie podważ krąg kostny cienkimi kleszczami, a następnie delikatnie, ale stanowczo usuń kość, podnosząc ją do góry. Uważaj, aby nie przekrzywić kręgu kostnego podczas jego podnoszenia, aby zapobiec możliwemu uszkodzeniu opony twardej.</li>
	<li>Delikatnie nałóż piankę żelową nasączoną sterylną solą fizjologiczną na oponę twardą, aby zatrzymać krwawienie. Poczekaj, aż krwawienie zostanie całkowicie zatrzymane. Ostrożnie usuń piankę żelową, aby nie zakłócać procesu krzepnięcia. 
	Uwaga: Obszar szwu jest silnie unaczyniony, więc krwawienie w tym momencie może okazać się głębokie. Konieczne jest odczekanie odpowiedniego czasu, aż krwawienie całkowicie się zatrzyma. Pomocne jest utrzymanie nasączonej solą pianki żelowej w stanie schłodzonym poprzez umieszczenie jej na lodzie.</li>
</ol>
3. Wstrzyknięcie wirusa
<ol>
	<li>Podłącz pompę infuzyjną do wieży stereotaktycznej i podłącz sterownik.</li>
	<li>Wprowadzić igłę 35G do strzykawki. Przepłukać strzykawkę 10 razy etanolem, aby ją wysterylizować i 10 razy sterylnym solem fizjologicznym, aby usunąć ślady etanolu. Usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki. Włożyć strzykawkę do pompy. 
	Uwaga: Rozważ użycie innych środków dezynfekujących.</li>
	<li>Rozmrozić pojedynczą dawkę preparatu rAAV2/1mCherry (zalecane 1012 pfu) i przechowywać na lodzie. Napełnić strzykawkę roztworem wirusa.</li>
	<li>Wyśrodkuj igłę na bregmie, a następnie delikatnie włóż do hipokampa, używając następujących współrzędnych: AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. Współrzędne te będą znajdować się w pobliżu krawędzi kraniotomii. Odczekaj 5 minut, aż tkanka się ustabilizuje.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,7 μl roztworu rAAV2/1 mCherry z szybkością 50 nl/min. Odczekać 10 minut, aż wirus w pełni się zaadsorbuje. Delikatnie wyjąć igłę. Osusz pianką żelową, jeśli wystąpi krwawienie. Powtórz z miejscem po stronie przeciwnej.</li>
</ol>
4. Implantacja okna czaszkowego
<ol>
	<li>Połóż sterylne, wysuszone szkło nakrywkowe na wierzchu opony twardej w wywierconej ramie okrągłej. Przytrzymaj szkło nakrywkowe kleszczami, aby delikatnie spłaszczyć oponę twardą i zbliżyć krawędzie szkła nakrywkowego do powierzchni czaszki. 
	nuta: Możliwe jest, że szkło nakrywkowe przerwie skrzep i krwawienie zostanie wznowione. W takim przypadku podnieś szklankę nakryciową, umieść ją w alkoholu, wysusz i wróć do kroku 2.9.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej igły nałóż gęsty klej cyjanoakrylowy na krawędzie szkła nakrywkowego, aby przymocować je do czaszki. Poczekaj, aż klej wyschnie.</li>
	<li>Umieść pręt mocujący (nakrętka M2 lub wykonany na zamówienie projekt) w przedniej części czaszki. Nałóż klej cyjanoakrylowy na krawędzie pręta. Poczekaj, aż klej wyschnie.
	<ol>
		<li>Umieść listwę stabilizującą w pozycji, która umożliwi poziome ustawienie okna czaszki podczas sesji obrazowania. Umieść go jak najdalej od okna. Jeśli zostanie umieszczony zbyt blisko okna, pręt i śruba łącząca go z wykonanym na zamówienie uchwytem mogą stanowić przeszkodę dla obiektywu podczas procesu obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj akryl dentystyczny i nałóż go na powierzchnię czaszki wokół szkła. Pomocne jest uformowanie wokół okna kształtu przypominającego krater. Stworzy to wgłębienie dla wody nałożonej później do obrazowania za pomocą obiektywu wodnego.</li>
	<li>Utwórz czapkę z akrylem dentystycznym, zakrywającą resztę obszaru operacyjnego, krawędzie skóry, listwę mocującą, wzmacniając krater wokół okna czaszki. Poczekaj, aż cement dentystyczny stwardnieje.</li>
	<li>Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i umieść je w komorze rekonwalescencji.</li>
	<li>Poczekaj, aż zwierzę dojdzie do siebie po operacji, obserwując funkcje fizjologiczne.</li>
	<li>Stosować analgezję pooperacyjną (karprofen, 10 mg/kg) i antybiotyki (baytril, 5 mg/kg) przez 48 godzin.</li>
</ol>
5. Obrazowanie
<ol>
	<li>Uruchom laser Ti:Sapphire, włącz mikroskop. System wykorzystany w tym eksperymencie wyposażony jest w laser dwufotonowy, system OPO oraz podwójny GaAsP PMT.</li>
	<li>Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i wywołaj znieczulenie.</li>
	<li>Wyjąć zwierzę z komory indukcyjnej i umieścić je w masce do znieczulenia gazowego pod mikroskopem. Zmniejsz przepływ tlenu do 0,3 l/min, a stężenie izofluranu do 1,5-2%.</li>
	<li>Przymocuj zwierzę do niestandardowej ramy mikroskopu za pomocą M2 (lub innego niestandardowego systemu). Wypoziomuj okno czaszki. 
	nuta: Możliwe jest zastosowanie systemu mocowania głowicy producenta mikroskopu, chociaż specyficzna niestandardowa rama daje lepsze wyniki (lepsza stabilność głowicy, stałe pozycjonowanie w wielu sesjach podczas przewlekłego eksperymentu).</li>
	<li>Korzystając z ustawień mikroskopu szerokokątnego i obiektywu o małym powiększeniu, wyśrodkuj widok na jednej ze stron kory zaśledziłowej i skoncentruj go na powierzchni szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Nałóż kroplę wody do akrylowej studzienki przypominającej krater. Przełącz się na długodystansowy obiektyw do zanurzenia w wodzie. Przesuń obiektyw w kierunku okna czaszki, aż łąkotka wodna połączy próbkę z obiektywem.</li>
	<li>Przełącz się na ustawienia dwufotonowe i rozpocznij skanowanie próbki od góry do dołu przy użyciu najmniejszego powiększenia. Przejście opony twardej będzie widoczne jako olśnienie silnego, niespecyficznego sygnału.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia akwizycji mikroskopu w obu kanałach (GFP i mCherry) zgodnie z siłą sygnału z ogniw fluorescencyjnych, aby pokryć cały zakres dynamiki.</li>
	<li>Po znalezieniu odpowiedniego neuronu (z drzewem dendrytycznym oddzielonym od innych komórek) wykonaj wstępne skanowanie, używając tylko zestawu filtrów GFP z najmniejszym powiększeniem i odległością z wynoszącą 5 mikronów.</li>
	<li>Uzyskaj maksymalny rzut zeskanowanego stosu i wydrukuj go w celu opatrzenia adnotacjami (używając odwróconych kolorów).</li>
	<li>Ustaw powiększenie na wartość, która pozwoli na zobrazowanie pożądanych szczegółów morfologicznych. Zobrazuj całe drzewo dendrytyczne w kanałach GFP i mCherry, używając maksymalnej projekcji jako przewodnika.</li>
</ol>

<ol><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li>
<li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li>
<li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li>
</ol>

Autorzy (K.L., M.R., K.R.) posiadają prawa do zgłoszonego do opatentowania (PL410001) na ramę Holder użytą w tym artykule.

W niniejszej pracy przedstawiono protokół jednoczesnego dwufotonowego obrazowania in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w RSC przez okno czaszkowe. Procedura implantacji składa się z kilku kluczowych etapów. Najpierw zwierzę jest głęboko znieczulane i mocowane w ramie stereotaktycznej, następnie czaszka nad RSC jest rozrzedzana wiertłem wzdłuż zaznaczonych okrągłych linii i usuwana jest okrągła kość. Po zatrzymaniu krwawienia rAAV2/1mCherry wstrzykuje się do hipokampa, a szkło nakrywko...

Mikroskopia dwufotonowa zrewolucjonizowała obserwację aktywności mózgu u żywych i zachowujących się zwierząt. Od czasu wprowadzenia na rynek w 1990 roku szybko zyskało popularność i jest obecnie wdrażane jako jedno z najciekawszych i najbardziej innowacyjnych podejść do badania wielu aspektów aktywności mózgu in vivo 1,2. Zastosowania te obejmują pomiary przepływu krwi, aktywację neuronów (np. za pomocą wskaźników poziomu wapnia lub natychmiastowej wczesnej ekspresji genów) oraz morfologię komórek neuronalnych. Coraz więcej laboratoriów korzysta z mikroskopów dwufotonowych, wdrażając tę technikę w całym świecie naukowym jako nowy standard obrazowania mózgu in vivo.
Standardowe podejście polega na wszczepieniu okna czaszkowego (okrągłego otworu w czaszce pokrytego szkłem nakrywkowym) nad lufą lub korą wzrokową mózgu myszy 3. Następnie, w zależności od protokołu eksperymentalnego, mysz przechodzi serię sesji wizualizacji i treningu behawioralnego, co pozwala monitorować zmiany w aktywności mózgu i morfologii neuronów w czasie 4,5. W obu przypadkach kraniotomia dotyczy tylko kości ciemieniowej, bez krzyżowania szwów. Powszechnie uważa się, że główną wadą tej techniki jest jej ograniczone zastosowanie do łatwo dostępnych kory mózgowej, takich jak beczka lub kora wzrokowa. Implantacja okna czaszki nad innymi obszarami stwarza wiele trudności ze względu na nadmierne krwawienie i/lub utrudnienia przestrzenne.
W tym artykule proponujemy wszczepienie okna czaszkowego powyżej kory zaśledziony (RSC) jako kolejny możliwy obszar zainteresowania dla mikroskopii dwufotonowej in vivo 6. RSC jest ważnym elementem obwodu mózgowego odpowiedzialnym za tworzenie pamięci przestrzennej. Anatomicznie RSC jest częścią sieci neuronalnej łączącej regiony korowe, hipokampowe i wzgórzowe 7. Jest silnie zaangażowany w szereg zachowań, takich jak uczenie się przestrzenne i wymieranie, a także nawigacja przestrzenna 6.
Aby zobrazować zmiany morfologiczne neuronów, używamy transgenicznej linii myszy wyrażającej zielone białko fluorescencyjne (GFP) pod promotorem thy1. U tych myszy GFP ulega ekspresji w około 10% neuronów w mózgu, co pozwala na wyraźną wizualizację aksonów korowych i dendrytów przy użyciu mikroskopii dwufotonowej 8. Kolejną innowacją, którą proponujemy, jest wstrzyknięcie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem serotypu 2/1 (rAAV2/1) kodującego białko czerwonej fluorescencji (mCherry) pod specyficznym dla neuronu promotorem camkii 9 do głębszych struktur mózgu rzutujących na RSC, takich jak hipokamp. Ekspresja rAAV2/1mCherry w hipokampie myszy Thy1-GFP pozwala na jednoczesną wizualizację elementów pre- i postsynaptycznych synaps hipokampowo-korowych 10. Ekspresja mCherry sterowana przez rAAV potrzebuje od dwóch do trzech tygodni, aby białko osiągnęło wystarczający poziom w końcach aksonalnych. Okres ten jest zgodny ze zwykłym czasem wymaganym do rekonwalescencji po kraniotomii.

<table><tbody><tr><td>Lek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>5-2% przedoperacyjne</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>1,5-2% podczas operacji</td></tr><tr><td>Dexametasone</td><td>Scan Vet</td><td>Dexasone 2mg/ml</td><td>0,2 mg/kg domięśniowo</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td>2,50%</td><td>5 mg/kg podskórnie</td></tr><tr><td>Tolfedine</td><td>Vetoquinol</td><td>4%</td><td>4 mg/kg podskórnie</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/ml</td><td>2 mg/kg podskórnie</td></tr><tr><td>Karprofen</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50mg/ml</td><td>10 mg/kg podskórnie</td></tr><tr><td>Lidokaina</td><td>Jelfa</td><td>Lignocainum</td><td>miejscowo</td></tr><tr><td>Lidokaina</td><td>Jelfa</td><td>20 mg/g</td><td>miejscowo</td></tr><tr><td>Surgery</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan dentystyczny; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>miejscowo</td></tr><tr><td>klej CA</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>Dental akryl</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Harvard Aparatura</td><td>HSE-64-0720</td><td>Średnica 3 mm</td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne</td><td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>Pręt mocujący</td> Można użyć <td>niestandardowych</td> nakrętek <td>śrubowych N/A</td><td>M2 lub M3</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ramka uchwytu</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>mikroskop dwufotonowy Zeiss</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>Jednostka laserowa: Koherent Chameleon 690-1040nm z optycznym oscylatorem parametrycznym 1050-1300nm. Obiektywy: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0,1 i LD Plan-APOCHROMAT 20x/1,0. Detekcja: Filtry pasmowoprzepustowe Zeiss BP 500-550 (GFP) i BP 570-610 (mCherry) oddzielone rozdzielaczem wiązki przy 560 nm i sprzężone z dwoma fotodetektorami GaAsP.</td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virus</td><td>prezent od K. Deisseroth</td><td></td><td>Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) wykazujący ekspresję białka fluorescencyjnego mCherry pod kontrolą promotora CaMK</td></tr></tbody></table>

jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledzinowej myszy myszy (RSC) przy użyciu mikroskopii dwufotonowej in vivo w transgenicznej linii myszy Thy1-GFP. Takie podejście stwarza możliwość zbadania korelacji manipulacji behawioralnych ze zmianami w morfologii neuronów in vivo.
Procedura implantacji okna czaszkowego była uważana za ograniczoną tylko do łatwo dostępnych obszarów kory mózgowej, takich jak pole beczkowe. Nasze podejście pozwala na wizualizację neuronów w silnie unaczynionym RSC. RSC jest ważnym elementem obwodu mózgowego odpowiedzialnego za pamięć przestrzenną, wcześniej uważanym za problematyczny w obrazowaniu dwufotonowym in vivo.
Implantacja okna czaszkowego nad RSC jest połączona z wstrzyknięciem rekombinowanego wirusa adeno-związanego z ekspresją mCherry (rAAVmCherry) do grzbietowego hipokampa. Ekspresja mCherry rozprzestrzenia się na projekcje aksonalne od hipokampa do RSC, umożliwiając wizualizację zmian zarówno w presynaptycznych boutonach aksonalnych, jak i postsynaptycznych kolcach dendrytycznych w korze. 
Ta technika pozwala na długoterminowe monitorowanie zależnej od doświadczenia plastyczności strukturalnej w RSC.

Ekspresja GFP w podzbiorze neuronów u myszy reporterowej Thy1-GFP umożliwia obrazowanie in vivo dendrytów korowych i lokalnych projekcji aksonalnych w RSC. Rysunek 1A przedstawia maksymalną projekcję stosu obrazów, na których widoczne są liczne dendryty GFP-dodatnie. Ciało komórki jest przesłonięte przez tętnicę. Rysunek 1B przedstawia powiększony obraz pojedynczej płaszczyzny (zoom cyfrowy 3x) gałązki dendrytycznej wskazanej na rysunku 1A. Wyraź...

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Wszystkie poniższe procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Lokalną Komisję Etyczną w Instytucie Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego Polskiej Akademii Nauk. Film ten przedstawia procedurę kraniotomii, która umożliwia chroniczne obrazowanie neuronów w korze retrosplenialnej myszy z wykorzystaniem dwufotonowej mikroskopii in vivo u myszy z linii transgenicznej thi one-G of feet. Podejście to jest połączone z iniekcją wirusa adeno-asocjowanego (AAV) ekspresującego mCherry do grzbietowej części hipokampa.Połączenie tych technik umożliwia długoterminowe monitorowanie rozwiniętej zależności oraz plastyczności strukturalnej w korze retrosplenialnej. W niniejszej pracy proponujemy implantację okna czaszkowego nad korą retrosplenialną jako możliwy obszar zainteresowania dla dwufotonowej mikroskopii in vivo. W celu wizualizacji zmian morfologicznych w strukturach neuronalnych wykorzystujemy myszy B z ekspresją fluorescencyjnego białka GFP w około 10 procentach neuronów w mózgu.Kolejną proponowaną przez nas innowacją jest wstrzyknięcie AAV wykazującego ekspresję białka fluorescencyjnego mCherry pod promotorem specyficznym dla neuronów do głębszych struktur mózgu, takich jak hipokamp, w celu wizualizacji projekcji tej struktury do kory retrosplenialnej. Sterylizować wszystkie narzędzia, szklane pojemniki na ciecze oraz patyczki bawełniane w autoklawie. Należy używać jednorazowych rękawiczek.Oczyścić stół operacyjny, ramę stereotaktyczną oraz cały obszar wokół nich 70% etanolem. Użyć sterylnej podkładki chirurgicznej, aby stworzyć sterylną przestrzeń dla całego wysterylizowanego sprzętu. Pokroić gąbkę żelową na małe kawałki i namoczyć je w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej, ustaw poziom izofluranu na 5% oraz przepływ tlenu na 2 l/min. Procedura ta powinna trwać około trzech minut. Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej.Wykonaj uciśnięcie ogona lub palców stopy, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone. Używając precyzyjnego trymera, ogól włosy z tyłu głowy, pomiędzy uszami, aż do oczu. Umieść zwierzę w aparacie stereotaktycznym i ustabilizuj głowę za pomocą prętów usznych.Ustaw poziom znieczulenia na 1,5 do 2% izofluranu oraz tlen w przepływie 0,3 litra na minutę. Nałóż maść do oczu. Wykonaj podskórny zastrzyk z tolfedyną w dawce 4 mg/kg, butomidorem w dawce 2 mg/kg oraz Baytrilem w dawce 5 mg/kg w celu odpowiednio zapobiegania zapaleniu, bólowi i infekcji.Wstrzyknij zwierzęciu domięśniowo deksametazon w dawce 0,2 mg/kg, aby zapobiec obrzękowi mózgu. Oczyść skórę za pomocą sterylnych patyczków bawełnianych nasączonych betadyną, a następnie 70% etanolem. Zmień rękawiczki i spryskaj je 70% etanolem.Unieś skórę pęsetą i za pomocą mikronożyczek wykonaj nacięcie skóry poziomo wzdłuż podstawy głowy, a następnie ukośnie do przedniego punktu między oczami. Usuń płat skóry. Za pomocą sterylnego tamponu nałóż maść z lidokainą na okostną, aby zapobiec nadmiernemu krwawieniu i bólowi.Użyć sterylnych patyczków bawełnianych lub skalpela, aby usunąć okostną. Osuszyć czaszkę sterylnymi patyczkami. Za pomocą sterylnej igły nanieść gęsty klej cyjanoakrylowy na brzegi skóry, aby je unieruchomić i zapobiec ich dalszemu kontaktowi z cementem dentystycznym.Należy odczekać do wyschnięcia kleju. Połóż sterylną szkiełko nakrywkę o grubości trzech milimetrów na czaszce, przed szwem jagodowym. Wycentruj szkiełko nakrywkowe zgodnie z współrzędnymi obszaru retrosplenialnego: przednio-tylne bregma -2,8, boczno-przyśrodkowe bregma 0.Zaznaczyć krawędzie szkiełka nakrywkowe, nacinając powierzchnię czaszki sterylną igłą. Umieścić szkiełko nakrywkowe z powrotem w sterylnym pojemniku z 70% etanolem. Używając wysokoobrotowego wiertła stomatologicznego z wiertłem o małej średnicy, wyciąć okrąg o średnicy 3 mm.Oczyść miejsce wiercenia z pyłu kostnego za pomocą sterylnych tamponów nasączonych solą fizjologiczną. Użyj gąbki żelowej i tamponów, aby zatamować ewentualne krwawienie i oczyścić kość. W przerwach między wierceniem sprawdzaj grubość kości za pomocą precyzyjnej pęsety, delikatnie dotykając okręgu kostnego i sprawdzając jego ruchomość.Należy pamiętać, że kość jest grubsza w obszarze szwów. Należy przerwać wiercenie, gdy okrąg kostny stanie się ruchomy, a na obwodzie pozostanie jedynie równomierna, cienka warstwa kości. Pole operacyjne należy oczyścić z resztek pyłu kostnego za pomocą tamponów zwilżonych solą fizjologiczną.Nanieś jałową sól fizjologiczną na obszar wiercenia, pokrywając wywiercony okrąg. Ostrożnie podważ okrąg kostny za pomocą precyzyjnej pęsety, a następnie delikatnie, lecz zdecydowanie usuń kość, unosząc ją do góry. Należy uważać, aby nie przekrzywić okręgu kostnego podczas jego unoszenia, aby uniknąć ewentualnego uszkodzenia opony twardej.Delikatnie nałóż gąbkę żelową nasączoną sterylną solą fizjologiczną na oponę twardą, aby pomóc zatamować krwawienie. Odczekaj, aż krwawienie całkowicie ustanie. Ostrożnie usuń gąbkę żelową, aby nie zakłócić procesu krzepnięcia.Należy pamiętać, że obszar szwu jest silnie unaczyniony, więc krwawienie w tym punkcie może być obfite. Niezbędne jest odczekanie odpowiedniego czasu do momentu ustąpienia krwawienia. Zamocuj pompę infuzyjną do wieży stereotaktycznej i podłącz sterownik.Wprowadź igłę o rozmiarze 35 G do strzykawki do napełniania. Przepłucz strzykawkę 10 razy etanolem w celu jej sterylizacji oraz 10 razy sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć pozostałości etanolu. Usuń pęcherzyki powietrza ze strzykawki.Włóż strzykawkę do pompy. Odmierz pojedynczą dawkę preparatu AV i przechowuj go w lodzie. Napełnij strzykawkę roztworem wirusa.Wycentruj igłę na bregmie, a następnie ostrożnie wprowadź ją do hipokampa, korzystając z następujących współrzędnych: przednio-tylna -2, przyśrodkowo-boczna ±1, grzbietowo-brzuszna -1. Współrzędne te znajdują się w pobliżu krawędzi obszaru czaszkowego. Odczekaj pięć minut, aż tkanka się ustabilizuje.Wstrzyknąć 0,7 µL roztworu AV z prędkością 50 nL/min. Odczekać 10 minut do pełnej absorpcji wirusa. Ostrożnie wyjąć igłę.W przypadku wystąpienia krwawienia osuszyć miejsce za pomocą gąbki żelowej. Powtórzyć procedurę po stronie przeciwległej. Położyć sterylną, suchą lamellkę na powierzchni opony twardej w obrębie wywierconej ramy otworu.Przytrzymaj szkiełko nakrywkę pęsetą, aby delikatnie spłaszczyć oponę twardą i zbliżyć krawędzie szkiełka do powierzchni czaszki. Za pomocą sterylnej igły nałóż gęsty klej cyjanoakrylowy na krawędzie szkiełka nakrywek, aby przymocować je do czaszki. Odczekaj, aż klej wyschnie.Umieść pręt mocujący, nakrętkę antona lub element wykonany na zamówienie w przedniej części czaszki. Należy pamiętać, aby pręt mocujący został umieszczony w pozycji umożliwiającej poziome ustawienie okna czaszkowego podczas sesji obrazowania. Nałóż klej na krawędzie pręta.Należy odczekać do wyschnięcia kleju. Uwaga: pręt mocujący powinien zostać umieszczony jak najdalej od okna. Jeśli zostanie umieszczony zbyt blisko okna, pręt oraz śruba łącząca go z wykonanym na zamówienie uchwytem mogą stanowić przeszkodę dla obiektywu podczas procesu obrazowania.Przygotować akryl dentystyczny i nałożyć go na powierzchnię czaszki wokół szkła. Wskazane jest uformowanie wokół okna kształtu przypominającego krater. Stworzy to wgłębienie na wodę, którą naniesie się później w celu obrazowania z wykorzystaniem obiektywu wodnego.Za pomocą akrylu dentystycznego należy utworzyć nasadkę, pokrywającą pozostałe brzegi skóry obszaru operacyjnego oraz pręt mocujący, wzmacniając w ten sposób zagłębienie wokół okna czaszkowego. Należy odczekać do stwardnienia cementu dentystycznego. Następnie zwierzę należy wyjąć z zestawu stereotaktycznego i umieścić w komorze rekonwalescencyjnej.Odczekać do czasu wybudzenia się zwierzęcia z narkozy, obserwując funkcje fizjologiczne. Przez 48 godzin stosować pooperacyjną anestezję cyroproferrinem w dawce 10 mg/kg oraz leczenie antybiotykiem Baytril w dawce 5 mg/kg. Uruchomić laser ti szafirowy, a następnie włączyć mikroskop.System wykorzystany w tym eksperymencie jest wyposażony w laser dwufotonowy, system OPO oraz podwójne fotopowielacze (PMT) z arsenkiem galu. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i wprowadź w stan znieczulenia. Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej i umieść je pod mikroskopem w masce do znieczulenia gazowego.Zmniejsz przepływ tlenu do 0,3 litrów na minutę, a stężenie izofluranu do 1,52%. Przymocuj zwierzę do specjalnie dostosowanej ramy mikroskopu za pomocą śruby MT lub innego dedykowanego systemu. Wypoziomuj okno czaszkowe. Należy pamiętać, że możliwe jest zastosowanie systemu unieruchamiania głowy producenta mikroskopu, choć specjalistyczna rama zapewnia lepsze wyniki, zwiększoną stabilność głowy oraz stałe pozycjonowanie podczas wielu sesji w trakcie eksperymentu chronicznego.Korzystając z ustawień mikroskopu w szerokim polu i obiektywu o niskim powiększeniu, wycentruj pole widzenia na jednej z krawędzi kory retrosplenialnej i ustaw ostrość na powierzchni szkiełka nakrywnego. Nanieś kroplę wody do akrylowego wgłębienia przypominającego krater. Przełącz na obiektyw imersyjny wodny o dużej odległości roboczej.Przesuń obiektyw w stronę okna czaszkowego, aż menisk wody połączy preparat z obiektywem. Przełącz urządzenie na ustawienia dwufotonowe i rozpocznij skanowanie preparatu od góry do dołu przy najniższym powiększeniu. Przecięcie twardej opony mózgowej będzie widoczne jako odblask o wysokim sygnale niespecyficznym.Dostosuj ustawienia akwizycji mikroskopu w obu kanałach, GFP i mCherry, zgodnie z siłą sygnału z komórek fluorescencyjnych, aby objąć cały zakres dynamiczny. Po znalezieniu odpowiedniego neuronu z drzewem dendrytycznym oddzielonym od innych komórek, wykonaj wstępny skan, używając wyłącznie filtrów GFP przy najniższym powiększeniu i odległości Z wynoszącej 5 µm. Uzyskaj projekcję maksymalną stosu skanów i wydrukuj ją w odwróconych kolorach w celu naniesienia adnotacji.Ustaw powiększenie na wartość, która pozwoli na obrazowanie pożądanych szczegółów morfologicznych. Obrazuj całe drzewo dendrytyczne w kanałach GFP i mCherry, wykorzystując projekcję maksymalną jako pomoc. Dzięki zastosowaniu tego protokołu możliwe będzie wielokrotne monitorowanie struktur przed- i postsynaptycznych w korze retrosplenialnej.Podejście to można wykorzystać w badaniach chronicznych, w których manipulacje behawioralne mają korelować ze zmianami w morfologii dendrytów, kolców synaptycznych lub neuronów presynaptycznych. Sesje obrazowania można przeprowadzać z dowolną częstotliwością, jednak preferowany jest 24-godzinny odstęp czasowy, aby umożliwić zwierzęciu odpowiednią regenerację i zminimalizować wpływ anestezji. Właściwie zastosowana technika ta pozwala na wykonanie wielu sesji obrazowania w ciągu kilku miesięcy.

simultaneous-two-photon-vivo-imaging-synaptic-inputs-postsynaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Wang, Z., et al. Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy.  J. Vis. Exp. (2021). Ten film przedstawia technikę obrazowania siatkówki in vivo przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Znieczulone myszy są przygotowywane do obrazowania poprzez zabezpieczenie głowy, nałożenie lubrykantu do oczu i umieszczenie szkiełka nakrywkowego na oku. Komórki zwojowe siatkówki (RGC) eksprymujące białka fluorescencyjne są najpierw wizualizowane za pomocą epifluorescencji w celu...

Dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Źródło: Kamei, R., et al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)Film przedstawia proces konfiguracji i obrazowania do mikroskopii dwufotonowej in vivo dynamiki mikrogleju w hipokampie CA1 (Cornu ammonis 1) i zakręcie zębatym, zapewniając optymalne wyrównanie optyczne i ocenę integralności strukturalnej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo dynamiki mikrogleju w hipokampie myszy

Opisano metodę znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi w określonych funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Po pierwsze, obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego służy do uzyskania mapy funkcjonalnej. Następnie mikroskopia dwufotonowa jest używana do oznaczania i obrazowania neuronów w mikrodomenie mapy.

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

Zależne od doświadczenia zmiany molekularne w neuronach są niezbędne dla zdolności mózgu do adaptacji w odpowiedzi na wyzwania behawioralne.  Opisano tutaj metodę obrazowania dwufotonowego in vivo, która umożliwia śledzenie takich zmian molekularnych w poszczególnych neuronach korowych za pomocą genetycznie kodowanych reporterów.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru aktywności neuronalnej za pomocą podwójnych okien optycznych nad obustronnymi głównymi korami somatosensorycznymi (S1) u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (2P) in vivo.

Obrazowanie aktywności neuronalnej w pierwotnej korze somatosensorycznej przy użyciu transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Poznaj metodę kraniotomii i dwufotonowej mikroskopii in vivo do długoterminowego obrazowania neuronów w korze zaśledzinowej myszy. Technika umożliwia monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Przeglądaj więcej filmów