Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Wszystkie poniższe procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Lokalną Komisję Etyczną w Instytucie Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego Polskiej Akademii Nauk. Film ten przedstawia procedurę kraniotomii, która umożliwia chroniczne obrazowanie neuronów w korze retrosplenialnej myszy z wykorzystaniem dwufotonowej mikroskopii in vivo u myszy z linii transgenicznej thi one-G of feet. Podejście to jest połączone z iniekcją wirusa adeno-asocjowanego (AAV) ekspresującego mCherry do grzbietowej części hipokampa.

Połączenie tych technik umożliwia długoterminowe monitorowanie rozwiniętej zależności oraz plastyczności strukturalnej w korze retrosplenialnej. W niniejszej pracy proponujemy implantację okna czaszkowego nad korą retrosplenialną jako możliwy obszar zainteresowania dla dwufotonowej mikroskopii in vivo. W celu wizualizacji zmian morfologicznych w strukturach neuronalnych wykorzystujemy myszy B z ekspresją fluorescencyjnego białka GFP w około 10 procentach neuronów w mózgu.

Kolejną proponowaną przez nas innowacją jest wstrzyknięcie AAV wykazującego ekspresję białka fluorescencyjnego mCherry pod promotorem specyficznym dla neuronów do głębszych struktur mózgu, takich jak hipokamp, w celu wizualizacji projekcji tej struktury do kory retrosplenialnej. Sterylizować wszystkie narzędzia, szklane pojemniki na ciecze oraz patyczki bawełniane w autoklawie. Należy używać jednorazowych rękawiczek.

Oczyścić stół operacyjny, ramę stereotaktyczną oraz cały obszar wokół nich 70% etanolem. Użyć sterylnej podkładki chirurgicznej, aby stworzyć sterylną przestrzeń dla całego wysterylizowanego sprzętu. Pokroić gąbkę żelową na małe kawałki i namoczyć je w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.

Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej, ustaw poziom izofluranu na 5% oraz przepływ tlenu na 2 l/min. Procedura ta powinna trwać około trzech minut. Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej.

Wykonaj uciśnięcie ogona lub palców stopy, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone. Używając precyzyjnego trymera, ogól włosy z tyłu głowy, pomiędzy uszami, aż do oczu. Umieść zwierzę w aparacie stereotaktycznym i ustabilizuj głowę za pomocą prętów usznych.

Ustaw poziom znieczulenia na 1,5 do 2% izofluranu oraz tlen w przepływie 0,3 litra na minutę. Nałóż maść do oczu. Wykonaj podskórny zastrzyk z tolfedyną w dawce 4 mg/kg, butomidorem w dawce 2 mg/kg oraz Baytrilem w dawce 5 mg/kg w celu odpowiednio zapobiegania zapaleniu, bólowi i infekcji.

Wstrzyknij zwierzęciu domięśniowo deksametazon w dawce 0,2 mg/kg, aby zapobiec obrzękowi mózgu. Oczyść skórę za pomocą sterylnych patyczków bawełnianych nasączonych betadyną, a następnie 70% etanolem. Zmień rękawiczki i spryskaj je 70% etanolem.

Unieś skórę pęsetą i za pomocą mikronożyczek wykonaj nacięcie skóry poziomo wzdłuż podstawy głowy, a następnie ukośnie do przedniego punktu między oczami. Usuń płat skóry. Za pomocą sterylnego tamponu nałóż maść z lidokainą na okostną, aby zapobiec nadmiernemu krwawieniu i bólowi.

Użyć sterylnych patyczków bawełnianych lub skalpela, aby usunąć okostną. Osuszyć czaszkę sterylnymi patyczkami. Za pomocą sterylnej igły nanieść gęsty klej cyjanoakrylowy na brzegi skóry, aby je unieruchomić i zapobiec ich dalszemu kontaktowi z cementem dentystycznym.

Należy odczekać do wyschnięcia kleju. Połóż sterylną szkiełko nakrywkę o grubości trzech milimetrów na czaszce, przed szwem jagodowym. Wycentruj szkiełko nakrywkowe zgodnie z współrzędnymi obszaru retrosplenialnego: przednio-tylne bregma -2,8, boczno-przyśrodkowe bregma 0.

Zaznaczyć krawędzie szkiełka nakrywkowe, nacinając powierzchnię czaszki sterylną igłą. Umieścić szkiełko nakrywkowe z powrotem w sterylnym pojemniku z 70% etanolem. Używając wysokoobrotowego wiertła stomatologicznego z wiertłem o małej średnicy, wyciąć okrąg o średnicy 3 mm.

Oczyść miejsce wiercenia z pyłu kostnego za pomocą sterylnych tamponów nasączonych solą fizjologiczną. Użyj gąbki żelowej i tamponów, aby zatamować ewentualne krwawienie i oczyścić kość. W przerwach między wierceniem sprawdzaj grubość kości za pomocą precyzyjnej pęsety, delikatnie dotykając okręgu kostnego i sprawdzając jego ruchomość.

Należy pamiętać, że kość jest grubsza w obszarze szwów. Należy przerwać wiercenie, gdy okrąg kostny stanie się ruchomy, a na obwodzie pozostanie jedynie równomierna, cienka warstwa kości. Pole operacyjne należy oczyścić z resztek pyłu kostnego za pomocą tamponów zwilżonych solą fizjologiczną.

Nanieś jałową sól fizjologiczną na obszar wiercenia, pokrywając wywiercony okrąg. Ostrożnie podważ okrąg kostny za pomocą precyzyjnej pęsety, a następnie delikatnie, lecz zdecydowanie usuń kość, unosząc ją do góry. Należy uważać, aby nie przekrzywić okręgu kostnego podczas jego unoszenia, aby uniknąć ewentualnego uszkodzenia opony twardej.

Delikatnie nałóż gąbkę żelową nasączoną sterylną solą fizjologiczną na oponę twardą, aby pomóc zatamować krwawienie. Odczekaj, aż krwawienie całkowicie ustanie. Ostrożnie usuń gąbkę żelową, aby nie zakłócić procesu krzepnięcia.

Należy pamiętać, że obszar szwu jest silnie unaczyniony, więc krwawienie w tym punkcie może być obfite. Niezbędne jest odczekanie odpowiedniego czasu do momentu ustąpienia krwawienia. Zamocuj pompę infuzyjną do wieży stereotaktycznej i podłącz sterownik.

Wprowadź igłę o rozmiarze 35 G do strzykawki do napełniania. Przepłucz strzykawkę 10 razy etanolem w celu jej sterylizacji oraz 10 razy sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć pozostałości etanolu. Usuń pęcherzyki powietrza ze strzykawki.

Włóż strzykawkę do pompy. Odmierz pojedynczą dawkę preparatu AV i przechowuj go w lodzie. Napełnij strzykawkę roztworem wirusa.

Wycentruj igłę na bregmie, a następnie ostrożnie wprowadź ją do hipokampa, korzystając z następujących współrzędnych: przednio-tylna -2, przyśrodkowo-boczna ±1, grzbietowo-brzuszna -1. Współrzędne te znajdują się w pobliżu krawędzi obszaru czaszkowego. Odczekaj pięć minut, aż tkanka się ustabilizuje.

Wstrzyknąć 0,7 µL roztworu AV z prędkością 50 nL/min. Odczekać 10 minut do pełnej absorpcji wirusa. Ostrożnie wyjąć igłę.

W przypadku wystąpienia krwawienia osuszyć miejsce za pomocą gąbki żelowej. Powtórzyć procedurę po stronie przeciwległej. Położyć sterylną, suchą lamellkę na powierzchni opony twardej w obrębie wywierconej ramy otworu.

Przytrzymaj szkiełko nakrywkę pęsetą, aby delikatnie spłaszczyć oponę twardą i zbliżyć krawędzie szkiełka do powierzchni czaszki. Za pomocą sterylnej igły nałóż gęsty klej cyjanoakrylowy na krawędzie szkiełka nakrywek, aby przymocować je do czaszki. Odczekaj, aż klej wyschnie.

Umieść pręt mocujący, nakrętkę antona lub element wykonany na zamówienie w przedniej części czaszki. Należy pamiętać, aby pręt mocujący został umieszczony w pozycji umożliwiającej poziome ustawienie okna czaszkowego podczas sesji obrazowania. Nałóż klej na krawędzie pręta.

Należy odczekać do wyschnięcia kleju. Uwaga: pręt mocujący powinien zostać umieszczony jak najdalej od okna. Jeśli zostanie umieszczony zbyt blisko okna, pręt oraz śruba łącząca go z wykonanym na zamówienie uchwytem mogą stanowić przeszkodę dla obiektywu podczas procesu obrazowania.

Przygotować akryl dentystyczny i nałożyć go na powierzchnię czaszki wokół szkła. Wskazane jest uformowanie wokół okna kształtu przypominającego krater. Stworzy to wgłębienie na wodę, którą naniesie się później w celu obrazowania z wykorzystaniem obiektywu wodnego.

Za pomocą akrylu dentystycznego należy utworzyć nasadkę, pokrywającą pozostałe brzegi skóry obszaru operacyjnego oraz pręt mocujący, wzmacniając w ten sposób zagłębienie wokół okna czaszkowego. Należy odczekać do stwardnienia cementu dentystycznego. Następnie zwierzę należy wyjąć z zestawu stereotaktycznego i umieścić w komorze rekonwalescencyjnej.

Odczekać do czasu wybudzenia się zwierzęcia z narkozy, obserwując funkcje fizjologiczne. Przez 48 godzin stosować pooperacyjną anestezję cyroproferrinem w dawce 10 mg/kg oraz leczenie antybiotykiem Baytril w dawce 5 mg/kg. Uruchomić laser ti szafirowy, a następnie włączyć mikroskop.

System wykorzystany w tym eksperymencie jest wyposażony w laser dwufotonowy, system OPO oraz podwójne fotopowielacze (PMT) z arsenkiem galu. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i wprowadź w stan znieczulenia. Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej i umieść je pod mikroskopem w masce do znieczulenia gazowego.

Zmniejsz przepływ tlenu do 0,3 litrów na minutę, a stężenie izofluranu do 1,52%. Przymocuj zwierzę do specjalnie dostosowanej ramy mikroskopu za pomocą śruby MT lub innego dedykowanego systemu. Wypoziomuj okno czaszkowe. Należy pamiętać, że możliwe jest zastosowanie systemu unieruchamiania głowy producenta mikroskopu, choć specjalistyczna rama zapewnia lepsze wyniki, zwiększoną stabilność głowy oraz stałe pozycjonowanie podczas wielu sesji w trakcie eksperymentu chronicznego.

Korzystając z ustawień mikroskopu w szerokim polu i obiektywu o niskim powiększeniu, wycentruj pole widzenia na jednej z krawędzi kory retrosplenialnej i ustaw ostrość na powierzchni szkiełka nakrywnego. Nanieś kroplę wody do akrylowego wgłębienia przypominającego krater. Przełącz na obiektyw imersyjny wodny o dużej odległości roboczej.

Przesuń obiektyw w stronę okna czaszkowego, aż menisk wody połączy preparat z obiektywem. Przełącz urządzenie na ustawienia dwufotonowe i rozpocznij skanowanie preparatu od góry do dołu przy najniższym powiększeniu. Przecięcie twardej opony mózgowej będzie widoczne jako odblask o wysokim sygnale niespecyficznym.

Dostosuj ustawienia akwizycji mikroskopu w obu kanałach, GFP i mCherry, zgodnie z siłą sygnału z komórek fluorescencyjnych, aby objąć cały zakres dynamiczny. Po znalezieniu odpowiedniego neuronu z drzewem dendrytycznym oddzielonym od innych komórek, wykonaj wstępny skan, używając wyłącznie filtrów GFP przy najniższym powiększeniu i odległości Z wynoszącej 5 µm. Uzyskaj projekcję maksymalną stosu skanów i wydrukuj ją w odwróconych kolorach w celu naniesienia adnotacji.

Ustaw powiększenie na wartość, która pozwoli na obrazowanie pożądanych szczegółów morfologicznych. Obrazuj całe drzewo dendrytyczne w kanałach GFP i mCherry, wykorzystując projekcję maksymalną jako pomoc. Dzięki zastosowaniu tego protokołu możliwe będzie wielokrotne monitorowanie struktur przed- i postsynaptycznych w korze retrosplenialnej.

Podejście to można wykorzystać w badaniach chronicznych, w których manipulacje behawioralne mają korelować ze zmianami w morfologii dendrytów, kolców synaptycznych lub neuronów presynaptycznych. Sesje obrazowania można przeprowadzać z dowolną częstotliwością, jednak preferowany jest 24-godzinny odstęp czasowy, aby umożliwić zwierzęciu odpowiednią regenerację i zminimalizować wpływ anestezji. Właściwie zastosowana technika ta pozwala na wykonanie wielu sesji obrazowania w ciągu kilku miesięcy.