Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Wszystkie opisane poniżej procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Lokalną Komisję Etyczną w Instytucie Biologii Eksperymentalnej Polskiej Akademii Nauk. Ten film przedstawia procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej stóp o długości jednego G. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem wirusa AAV związanego z ekspresją mCherry do grzbietowego hipokampa.

Połączone razem, techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie doświadczanej zależności, plastyczności strukturalnej w korze zaśledzionowej. W niniejszej pracy proponujemy implantację okna czaszkowego powyżej kory zaśledziony jako niemożliwy obszar zainteresowania dla mikroskopii dwufotonowej in vivo. Aby zobrazować zmiany morfologiczne w strukturach neuronalnych, używamy jednego G myszy B z ekspresją fluorescencyjnego białka GFP w około 10 procentach neuronów w mózgu.

Kolejną innowacją, którą proponujemy, jest wstrzyknięcie AAV, ekspresji białka fluorescencyjnego mCherry pod specyficznym dla neuronu promotorem do głębszych struktur w mózgu, takich jak hipokamp, w celu wizualizacji projekcji struktury w korze zaśledzionowej. Wysterylizuj wszystkie narzędzia, szklane pojemniki na płyny i waciki w autoklawie. Ty zbędne rękawiczki.

Wyczyść stół chirurgiczny, ramę stereotaktyczną i całe otoczenie 70% etanolem. Użyj sterylnej podkładki chirurgicznej, aby stworzyć sterylną przestrzeń dla całego wysterylizowanego sprzętu. Pokrój piankę żelową na małe kawałki i namocz je w sterylnej soli fizjologicznej.

Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i ustaw poziom izofluranu na 5%, a przepływ tlenu na dwa litry na minutę. Ta procedura powinna zająć około trzech minut. Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej.

Użyj szczypania ogona lub palców u nóg, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni uspokojone. Za pomocą precyzyjnych trymerów ogol włosy od tyłu głowy, między uszami, aż do oczu. Umieść zwierzę w ramie stereotaktycznej i ustabilizuj głowę za pomocą nauszników.

Ustaw poziom znieczulenia na 1,5 do 2% izofluranu i punkt zerowy trzy litry tlenu na minutę. Nałóż maść na oczy. Wstrzyknąć zwierzęciu podskórnie tolfedynę w dawce cztery miligramy na kilogram, butomidor, w dawce dwa miligramy na kilogram i Baytril w dawce pięciu miligramów na kilogram, aby zapobiec odpowiednio stanowi zapalnemu, bólowi i infekcji.

Wstrzyknąć zwierzęciu domięśniowo deksametazon, punkt zerowy dwa miligramy na kilogram, aby zapobiec obrzękowi mózgu. Oczyść skórę za pomocą sterylnych wacików bawełnianych z betadyną, a następnie 70% etanolem. Zmień rękawice i spryskaj je 70% etanolem.

Podnieś skórę za pomocą kleszczy i za pomocą mikronożyczek nacinaj skórę poziomo wzdłuż podstawy głowy, a następnie ukośnie do przedniego punktu między oczami. Zdjąć płatek skóry. Nałóż maść lidokainową za pomocą sterylnego wacika na okostną, aby zapobiec nadmiernemu krwawieniu i bólowi.

Użyj sterylnych wacików bawełnianych lub skalpela, aby usunąć okostną. Osusz czaszkę sterylnymi wacikami. Za pomocą sterylnej igły nałóż gęsty klej cyjanoakrylowy na krawędzie skóry, aby je unieruchomić i zapobiec dalszemu kontaktowi z cementem dentystycznym.

Poczekaj, aż klej wyschnie. Połóż sterylne trzymilimetrowe szkło nakrywkowe na czaszce z przodu szwu lambdoidowego. Wyśrodkuj szkiełko nakrywkowe na współrzędnych retrosplenialnych, przednia, tylna bregma minus dwa punkt osiem, przyśrodkowa boczna bregma zero.

Zaznacz krawędzie szkiełka nakrywkowego, drapiąc powierzchnię czaszki sterylną igłą. Włóż szklankę nakrywkową z powrotem do sterylnego pojemnika z 70% etanolem. Użyj szybkoobrotowej wiertarki dentystycznej z wiertłem o małej średnicy, aby obrysować okrąg o średnicy trzech milimetrów.

Oczyść miejsce wiercenia z pyłu kostnego za pomocą sterylnych wacików z końcówką soli fizjologicznej. Użyj pianki żelowej i wacików, aby zatrzymać sporadyczne krwawienie i oczyścić kość. Pomiędzy wierceniem sprawdź grubość kości za pomocą cienkich kleszczy, delikatnie dotykając koła kości i sprawdzając jej ruchomość.

Należy pamiętać, że kość jest grubsza w obszarze szwów. Przerwij wiercenie, gdy koło kostne jest ruchome, a na obwodzie pozostaje tylko równa cienka warstwa kości. Oczyść pole operacyjne z całego pozostałego pyłu kostnego za pomocą wacików z solą fizjologiczną.

Upuść sterylną sól fizjologiczną na obszar wiercenia, zakrywając wywiercony okrąg. Ostrożnie podważ krąg kostny cienkimi kleszkami, a następnie delikatnie, ale stanowczo usuń kość, podnosząc ją do góry. Uważaj, aby nie przekrzywić kręgu kostnego podczas jego podnoszenia, aby zapobiec możliwemu uszkodzeniu opony twardej.

Delikatnie nałóż piankę żelową nasączoną sterylną solą fizjologiczną na oponę twardą, aby uzupełnić krwawienie. Poczekaj, aż krwawienie zostanie całkowicie zatrzymane. Ostrożnie usuń piankę żelową, aby nie zakłócać procesu krzepnięcia.

Należy pamiętać, że obszar szwu jest mocno unaczyniony, więc krwawienie w tym momencie może okazać się głębokie. Konieczne jest odczekanie odpowiedniego czasu do ustania krwawienia. Podłącz pompę infuzyjną do wieży stereotaktycznej i podłącz sterownik.

Wprowadzić igłę o rozmiarze 35 mm do strzykawki napełniającej. Przepłukać strzykawkę 10 razy etanolem, aby ją wysterylizować i 10 razy sterylnym solem fizjologicznym, aby usunąć ślady etanolu. Usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki.

Włożyć strzykawkę do pompy. Napełnij pojedynczą dawkę preparatu dopowietrznego i trzymaj go na lodzie. Napełnić strzykawkę roztworem wirusa.

Wyśrodkuj igłę na bregmie, a następnie delikatnie włóż do hipokampa, używając następujących współrzędnych: przednia, tylna minus-dwa, przyśrodkowa boczna plus minus-jeden, grzbietowa brzuszna minus-jeden. Współrzędne te będą znajdować się w pobliżu krawędzi domeny czaszki. Odczekaj pięć minut, aż tkanka się ustabilizuje.

Wstrzyknąć do punktu zerowego siedem mikrolitrów roztworu AV z szybkością 50 nanolitrów na minutę. Odczekaj 10 minut, aż wirus całkowicie się wchłonie. Delikatnie wyjąć igłę.

Osusz pianką żelową, jeśli wystąpi krwawienie. Powtórz z przeciwległą stroną. Połóż sterylne, suche szkło nakrywkowe na górze opony twardej w wywierconej ramie okrągłej.

Przytrzymaj szkło nakrywkowe za pomocą foreceps, aby delikatnie spłaszczyć oponę twardą i zbliżyć krawędzie szkła nakrywkowego do powierzchni czaszki. Za pomocą sterylnej igły nałóż gęsty klej cyjanoakrylowy na krawędzie szkła nakrywkowego, aby przymocować je do czaszki. Poczekaj, aż klej wyschnie.

Umieść pręt mocujący, nakrętkę anton lub wykonany na zamówienie wzór w przedniej części czaszki. Należy pamiętać, że listwa mocująca powinna być umieszczona w pozycji, która umożliwi poziome ustawienie okna czaszki podczas sesji obrazowania. Nałóż klej na krawędzie pręta.

Poczekaj, aż klej wyschnie. Uwaga, listwa mocująca powinna być umieszczona jak najdalej od okna. Jeśli zostanie umieszczony zbyt blisko okna, pręt i śruba łącząca go z wykonanym na zamówienie uchwytem mogą stanowić przeszkodę dla obiektywu podczas procesu obrazowania.

Przygotuj akryl dentystyczny i nałóż go na powierzchnię czaszki wokół szkła. Pomocne jest uformowanie wokół okna kształtu przypominającego krater. Stworzy to wgłębienie dla wody nałożonej później do obrazowania za pomocą obiektywu wodnego.

Stwórz czapkę z akrylu dentystycznego, zakrywającą resztę paska mocującego krawędzie skóry obszaru operacyjnego, wzmacniając krater wokół okna czaszki. Poczekaj, aż cement dentystyczny stwardnieje. Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i włóż je do komory rekonwalescencyjnej.

Poczekaj, aż zwierzę dojdzie do siebie po operacji, obserwując funkcje fizjologiczne. Zastosuj znieczulenie pooperacyjne cyroproferynę, 10 miligramów na kilogram i antybiotyki baytril, pięć miligramów na kilogram, przez 48 godzin. Uruchom laser szafirowy ti, włącz mikroskop.

System zastosowany w tym eksperymencie wyposażony jest w laser dwufotonowy, system OPO oraz PMT sfałszowany podwójnym arsenkiem galu. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i wywołaj znieczulenie. Wyjąć zwierzę z komory indukcyjnej i umieścić je w masce do znieczulenia gazowego pod mikroskopem.

Zmniejsz przepływ tlenu do punktu zerowego trzy litry na minutę, a stężenie izofluranu do 1,52%Przymocuj zwierzę do niestandardowej ramy mikroskopu za pomocą MT lub innego niestandardowego systemu. Wypoziomuj okno czaszki. Należy pamiętać, że możliwe jest użycie systemu mocowania głowicy producenta mikroskopu, chociaż specyficzna niestandardowa ramka daje lepsze wyniki, lepszą stabilność głowicy, stałe pozycjonowanie w wielu sesjach podczas przewlekłego eksperymentu.

Korzystając z ustawień mikroskopu szerokokątnego, obiektywu o małym powiększeniu, wyśrodkuj widok na jednej ze stron kory zaplesplenialnej i skoncentruj go na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Nałóż kroplę wody do akrylowej studzienki przypominającej krater. Przełącz się na długodystansowy obiektyw do zanurzenia w wodzie.

Przesuń obiektyw w kierunku okna czaszki, aż łąkotka wodna połączy próbkę z obiektywem. Przełącz się na ustawienia dwufotonowe i rozpocznij skanowanie próbki od góry do dołu przy użyciu najmniejszego powiększenia. Przejście materii opony twardej będzie widoczne jako blask silnego sygnału niespecyficznego.

Dostosuj ustawienia akwizycji mikroskopu w obu kanałach, GFP i mCherry, zgodnie z siłą sygnału z komórek fluorescencyjnych, aby pokryć cały zakres dynamiki. Po znalezieniu odpowiedniego neuronu z drzewem dendrytycznym oddzielonym od innych komórek, wykonaj wstępne skanowanie, używając tylko filtrów GFP ustawionych z najmniejszym powiększeniem i odległością Z wynoszącą pięć mikronów. Uzyskaj maksymalny rzut stosu skanów i wydrukuj go w celu dodania adnotacji przy użyciu odwróconych kolorów.

Ustaw powiększenie na wartość, która pozwoli na zobrazowanie pożądanych szczegółów morfologicznych. Zobrazuj całe drzewo dendrytyczne w kanale GFP i mCherry, używając maksymalnej projekcji jako przewodnika. Za pomocą tego protokołu możliwe będzie wielokrotne monitorowanie zarówno struktur pre-synaptycznych, jak i postsynaptycznych w korze zaśledzionowej.

Podejście to można wykorzystać w przewlekłym eksperymencie, w którym oczekuje się, że manipulacje behawioralne będą korelować, gdy zmiany w morfologii dendrytów, kolców synaptycznych lub neutronów presynaptycznych. Sesje obrazowania mogą być wykonywane z dowolną częstotliwością, ale preferowany jest 24-godzinny odstęp czasowy, aby umożliwić prawidłową rekonwalescencję zwierzęcia i zminimalizować efekt znieczulenia. Przy prawidłowym zastosowaniu technika ta pozwala na wykonanie wielu sesji obrazowania w ciągu kilku miesięcy.