Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie wymiernych obserwacji czasowego i przestrzennego występowania neuronalnych pęcherzyków egzocytarnych fushion i rozgałęzień aksonów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak to, kiedy i gdzie fuzja pęcherzyków wprowadza materiał błonowy do rozszerzającej się błony plazmatycznej podczas rozwoju neuronów. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy ona obrazowanie żywych komórek w celu uzyskania zarówno wysokiej rozdzielczości przestrzennej, jak i czasowej w pojedynczych komórkach oraz podejścia biochemiczne w celu uzyskania informacji populacyjnych.

Po hodowli i symulacji neuronów korowych za pomocą Netrin-1 lub kontroli zgodnie z tekstem protokołu. Odessać PBS z pierwszego dołka stanu i zastąpić 250 mikrolitrami buforu homogenizacyjnego. Inkubować na lodzie przez pięć minut, a następnie za pomocą podnośnika komórkowego homogenizować komórki na lodzie.

Odessać PBS z następnego dołka o tym samym stanie i dodać do dołka niedawno zhomogenizowaną mieszaninę, która zwiększy stężenie białka. Następnie przenieś homogenizowany roztwór do wstępnie schłodzonej 1,6 mililitrowej rurki do mikrofuge na lodzie i dodaj 20% Triton X-100, aby osiągnąć końcowe stężenie 1%, Następnie za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów rozcier mieszaninę dziesięć razy, minimalizując pęcherzyki. Inkubuj probówki na lodzie przez dwie minuty, aby rozpuścić białka.

Następnie odwirować w temperaturze 6 010 RCF w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby osadzać nierozpuszczony materiał. Przenieść supernatant w stanie leżenia do nowej schłodzonej probówki o pojemności 1,6 mililitra na lodzie. Następnie użyj testu Bradforda, aby określić stężenie białka.

Następnie użyj buforu homogenizacyjnego z 1% Triton X-100 i 5-krotnym buforem próbki uzupełnionym BME, aby rozcieńczyć próbki do końcowego stężenia 3-5 miligramów na mililitr. Podzielić każdą próbkę doświadczalną równomiernie na dwie probówki. Następnie inkubować jedną próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, a drugą w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Odwróć probówki z przerwami, aby utrzymać próbki w roztworze. Następnie wykonaj stronę SDS i Western blotting zgodnie z protokołem tekstowym. Po ustawieniu mikroskopu TIRF i próbki oraz znalezieniu neuronalnej płaszczyzny ogniskowej zgodnie z protokołem tekstowym.

Uruchom oprogramowanie lasera i połącz się z oprogramowaniem sterującym laserem. Ustaw oświetlenie na szerokie pole i wybierz obiektyw. Następnie ustaw współczynnik załamania światła próbki i dostosuj intensywność lasera, odznaczając TTL dla lasera 491.

Optymalizacja parametrów obrazowania jest ważna podczas obrazowania nienaruszonych pęcherzyków egzocytarnych dna, aby uniknąć dryftu ostrości i fototoksyczności, jednocześnie tworząc obrazy o wysokim stosunku sygnału do szumu, wystarczającym do analizy. Ustaw suwak w pozycji 100, a następnie zmniejsz go z powrotem do wartości z zakresu od 20 do 40. Następnie ponownie sprawdź czas wygaśnięcia.

Następnie ponownie skoncentruj się na próbce w oświetleniu światłem przechodzącym. Następnie w oprogramowaniu do obrazowania wybierz oświetlenie laserowe 491 i otwórz migawkę. Umieść kondensator do góry nogami na stole optycznym, aby nie porysować obiektywu.

Dokładnie wyreguluj ogniskową lasera na suficie, a po wyjęciu kondensatora wyśrodkuj punkt do środka przysłony o zamkniętym polu. Następnie wymień kondensator i w oprogramowaniu TIRF wyślij głębokość penetracji do 110 nanometrów. Następnie przełącz się z oświetlenia szerokokątnego na tryb oświetlenia TIRF w celu obrazowania.

Teraz, używając epifluorescencji szerokiego pola, znajdź komórki wyrażające fluorent VAMP2 przez okulary. Następnie, aby zmniejszyć fotowybielanie i fototoksyczność, dostosuj parametry obrazowania, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu i zakres dynamiczny przy minimalnym czasie ekspozycji i intensywności lasera. Ustaw ciągły autofokus na komórkę.

Następnie utwórz zestaw zdjęć poklatkowych, w którym akwizycja odbywa się co 0,5 sekundy przez pięć minut. W przypadku stanu stymulowanego Netrin-1 w okapie z przepływem laminarnym, dodać do końcowego stężenia 500 nanogramów na mililitr Netrin-1 do szalki z komórkami i zwrócić szalkę do inkubatora na godzinę przed obrazowaniem. Aby określić ilościowo częstotliwość zdarzeń egzocytarnych znormalizowanych na obszar komórki i czas.

W ImageJ otwórz stosy obrazów, przeciągając plik do okna lub wybierając Plik, Otwórz, nazwa pliku. Aby usunąć stabilne sygnały fluorescencyjne, które nie reprezentują zdarzeń fuzji pęcherzyków, użyj opcji Obraz, Stos, Projekt Z, Średnia intensywność typu projekcji. Aby utworzyć średnie odwzorowanie Z całego stosu.

Odejmij wynikowy średni obraz od każdego obrazu w timelapse za pomocą Procesu, Kalkulatora obrazów, Obrazu 1 swojego stosu, Operacji Odejmij obraz drugi. W wyniku tego powstaje nowo utworzone odwzorowanie Z. To podkreśli wydarzenia egzocytarne.

Teraz na oko policz egzocytarne zdarzenia fushionowe, które można zidentyfikować jako punkty dyfrakcyjnych ograniczonych sygnałów fluorescencyjnych, które szybko dyfundują, gdy fluoren VAMP2 dyfunduje w błonie plazmatycznej. Podświetl pierwszy obraz za pomocą opcji Obraz, Dostosuj, Próg i dostosuj suwak, aż cała komórka zostanie podświetlona jako próg. Następnie w obszarze Analizuj wybierz pozycję Ustaw pomiary i sprawdź obszar oraz wyświetlaną etykietę.

Za pomocą narzędzia do śledzenia różdżki ustaw progowy obszar komórkowy i naciśnij M, aby zmierzyć. Przenieś zebrane dane do arkusza kalkulacyjnego zgodnie z protokołem tekstowym. Po dwóch dniach in-vitro umieścić naczynie do obrazowania ze szklanym dnem zawierające nietransfekowane neurony we wstępnie podgrzanej, wilgotnej komorze środowiskowej.

Wykorzystaj mikroskop wyposażony w sześcioplanarną apochromatyczną soczewkę obiektywową 1,4 NA DIC z sześcioma planami DX i kondensor o dużej aperturze numerycznej, aby uzyskać najlepszą jakość i rozdzielczość obrazu. Następnie, przy oświetleniu światłem przechodzącym, dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aby znaleźć neurony przez okulary. W przypadku obrazowania DIC rozgałęzień aksonów właściwa konfiguracja chłodniejszego oświetlenia będzie integralną częścią optymalizacji obrazu i ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wyników możliwych do analizy.

Następnie, gdy interesujące Cię neurony znajdują się w polu widzenia, użyj funkcji akwizycji wielu obszarów w oprogramowaniu do obrazowania, aby znaleźć i zapisać lokalizacje XYZ co najmniej sześciu komórek. Teraz dodaj do końcowego stężenia 250 nanogramów na mililitr Netrin-1 lub innego czynnika zainteresowania, aby zasymulować komórki i naciśnij przycisk rozpocznij akwizycję wieloobszarową. Sekwencyjne pobieranie obrazów w każdej pozycji co 20 sekund przez 24 godziny.

Wstrzymywanie pobierania i ponowne ustawianie ostrości w razie potrzeby. W oprogramowaniu do obrazowania przejrzyj obrazy, wybierając Aplikacje, Przejrzyj dane wielowymiarowe i otwórz żądany plik. Zidentyfikuj stabilne gałęzie aksonów, które utworzyły się podczas sesji obrazowania.

Użyj narzędzia do śledzenia regionu, aby zmierzyć stabilną gałąź aksonu od podstawy aksonu do końcówki. Po potraktowaniu neuronów Netriną i toksyną botulinową oraz utrwaleniu i barwieniu immunologicznym oraz barwieniu immunologicznym dla beta-3 tuboliny i aktyny zgodnie z protokołem tekstowym. Użyj odwróconego mikroskopu, aby uzyskać obrazy epifluorescencji o szerokim polu.

Otwórz stos obrazów w ImageJ i aby ręcznie przeanalizować rozgałęzienie, użyj linii, linii segmentowanej i prześledź akson, który jest zdefiniowany jako najdłuższy neuryt wystający z somy. Dzięki narzędziom Analizuj, Narzędzia, Menedżer zwrotu z inwestycji zapisz śledzenie aksonów jako obszar zainteresowania. Następnie śledź i zapisz każdą gałąź aksonu, która jest zdefiniowana jako neuryt o długości większej lub równej 20 mikrometrów.

Uwzględnij w analizie tylko gałęzie podstawowe. Pokazano tutaj Western blot po zakończeniu testu kompleksu SNARE opornego na SDS. Sonda dla SNAP25, składni 1A i VAMP2.

Białka SNARE w złożonych, możliwych do zidentyfikowania monomerach są pokazane tutaj. Przedstawiono tutaj przykład zdarzenia egzocytarnego, w którym pośredniczy fluroen VAMP2, zachodzącego z czasem w neuronie korowym. Powiększone wstawki oznaczają somę, gałąź aksonu i aksonalny stożek wzrostu, co pokazuje przestrzenną użyteczność tego testu.

Kręgi detonują pojedyncze zdarzenia fuzji egzocytarnej, które można zobaczyć za pomocą mikroskopii TIRF. To poklatkowe obrazowanie DIC pokazuje stymulowane przez Netrin tworzenie gałęzi aksonu w czasie rzeczywistym. Te lokalizacje oznaczają początkowy występ z oddziału oddziału.

Reprezentują one w pełni uformowane, stabilne gałęzie o długości co najmniej 20 mikrometrów, mierzone od głównego aksonu do końca gałęzi. W tym eksperymencie neurony korowe w 3 DIV były albo traktowane Netrin-1, który stymuluje rozgałęzienia, albo toksyną botulinową A, która rozszczepia SNAP25, składnik kompleksu SNARE i blokuje egzocytozę. Wyniki pokazują, że egzocytoza za pośrednictwem SNARE jest niezbędna do rozgałęziania zależnego od netryny.

Po opanowaniu, obrazowanie DIC można wykonać w ciągu jednej nocnej sesji obrazowania. Obrazowanie TIRF poszczególnych zdarzeń egzocytarnych można przeprowadzić w ciągu 4-5 godzin. Protokół biochemii tworzenia kompleksu SNARE można wykonać w ciągu dwóch godzin.

Próbując wykonać te procedury, ważne jest, aby pamiętać o odpowiednim tempie i nie spieszyć się z żadnym pojedynczym krokiem. Każdy zabieg wymaga uwagi i cierpliwości, aby uzyskać najlepsze rezultaty. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak kotransfekcja oznakowanych składników pęcherzyków z oznakowanymi ładunkami kandydującymi, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania.

Na przykład, jaki jest ładunek pęcherzyków egzocytarnych? Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do badania neurytogenezy, rozgałęziania aksonów i innych etapów morfogenizacji w dowolnej zdysocjowanej kulturze neuronalnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obserwować i określać ilościowo przestrzenną i czasową naturę neuronalnych fuzji pęcherzyków egzocytarnych odpowiadających zmianom w morfogenizacji neuronów.

Nie zapominaj, że praca z toksyną botulinową lub laserami o dużej mocy może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniej odzieży ochronnej i korzystanie z mechanizmu blokady bezpieczeństwa mikroskopu.