Name: Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: Odkryj metodę obserwacji egzocytozy zależnej od SNARE w rozgałęzianiu aksonów neuronów kory mózgowej stymulowanych Netrin-1. Technika łączy obrazowanie komórkowe z biochemią.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health: RO1-GM108970 (SLG) i F31-NS087837 (CW).

Oświadczenie o etyce badawczej: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane tutaj podlegają zasadom i przepisom Komitetu UNC ds. Opieki nad Zwierzętami oraz standardom NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie i posiewanie zdysocjowanych neuronów korowych
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji samice w ciąży w czasie przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Usuń całe mózgi z czaszek myszy w dniu embrionalnym 15.5 (E15.5) i przeprowadź mikrosekcję kory mózgowej z każdej półkuli. Szczegółowe instrukcje dotyczące mikrodysekcji embrionalnej kory myszy znajdują się w Viesselmann i wsp. 8.</li>
	<li>Umieścić nie więcej niż 4 kory w 1 ml pożywki preparacyjnej w sterylnej mikroprobówce o pojemności 1,6 ml. Dodaj 120 μl 10x trypsyny i odwróć probówkę 3 - 5 razy, aby wymieszać.</li>
	<li>Za pomocą hemocytometru policz komórki na szalkach z hodowlą komórek nasiennych. Uwaga: 1 półkula korowa dostarcza około trzech milionów komórek.
	<ol>
		<li>W przypadku odpornego na SDS złożonego testu biochemicznego SNARE należy ułożyć sześć milionów komórek na szalce o średnicy 35 mm i wykorzystać dwie szalki na warunek. Uwaga: Jest to uproszczone dzięki użyciu płytek 6-dołkowych podczas porównywania wielu warunków.</li>
		<li>Do testów rozgałęzień, neurony płytkowe na kwasie azotowym płukały okrągłe szkiełka nakrywkowe o gęstości 250 000 komórek na 35 mm szalkę, do obrazowania DIC płytki rozgałęziającej aksony o gęstości 150 000. Dzięki tym gęstościom pozwala uniknąć przeludnienia i upraszcza analizę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku mikroskopii TIRF z żywymi komórkami ponownie zawieś dwa miliony neuronów na transfekcję w roztworze nukleofekcji w RT.
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do mikroprobówki zawierającej 10 μg plazmidu ekspresyjnego VAMP2-pHlourin i elektroporować nukleofektorem zgodnie z protokołemproducenta 9.</li>
		<li>Po transfekcji natychmiast dodać 500 μl pożywki hartowniczej trypsyny, usunąć zawiesinę z kuwet i komórek płytki o gęstości 400 000 komórek na 35 mm szklane dno pokryte PDL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść wszystkie neurony korowe w 2 ml pożywki wolnej od surowicy.</li>
</ol>
2. Test tworzenia kompleksu SNARE
Uwaga: Odporne na SDS kompleksy SNARE zostały przetworzone i przeanalizowane zgodnie z pierwotnym opisem10 z modyfikacjami opisanymi poniżej. Aby zapoznać się z zwalidowanymi przeciwciałami alternatywnymi do zastosowanych tutaj, patrz sekcja dotycząca materiałów.
<ol>
	<li>Stymulować neurony korowe E15,5 przez 2 dni in vitro (DIV) za pomocą 250 ng / ml netrin-1 lub kontroli pozorowanej przez 1 godzinę przed lizą.</li>
	<li>Przed przetworzeniem próbek schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C i ustawić temperaturę łaźni wodnej na 37 °C, a podgrzewać blok na 100 °C.</li>
	<li>Wyjmij szalki z komórkami z inkubatora i umieść je na lodzie.
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę z komórek, zastąpić ~ 2 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) delikatnie 2 razy przez 1 - 2 minuty na płukanie.</li>
		<li>Do tego testu użyj 2 studzienek na warunek.</li>
		<li>Odessać PBS z pierwszego dołka stanu i zastąpić buforem homogenizacyjnym o pojemności 250 μl. Pozostaw na lodzie na 5 minut, a następnie za pomocą podnośnika komórkowego homogenizuj komórki na lodzie.</li>
		<li>Odessać PBS z następnego dołka o tym samym stanie i dodać do dołka niedawno zhomogenizowaną mieszaninę. Spowoduje to zwiększenie stężenia białka. Powtórz dla wszystkich warunków.</li>
		<li>Po zakończeniu pipetować homogenizowany roztwór do wstępnie schłodzonej mikroprobówki o pojemności 1,6 ml na lodzie i dodać 20% TritonX-100, aby osiągnąć końcowe stężenie 1% TritonX-100. Rozetrzyj 10 razy za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, minimalizując pęcherzyki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubuj probówki na lodzie przez 2 minuty, aby rozpuścić białka. Po inkubacji odwirować przez 10 minut w temperaturze 6,010 rcf w temperaturze 4 °C w celu osadzenia nierozpuszczonego materiału. Przenieść supernatant lizatu do nowej schłodzonej probówki o pojemności 1,6 ml na lodzie.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę stężenia białka przy użyciu testu Bradforda11 i rozcieńczyć próbki do końcowego stężenia białka 3 - 5 mg / ml z pozostałym buforem homogenizacyjnym uzupełnionym 1% TritonX-100 i 5-krotnym buforem próbki uzupełnionym B-merkapteetanolem (BME).</li>
	<li>Podziel każdą próbkę doświadczalną równomiernie na 2 probówki. Inkubować jedną próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut (kompleksy SNARE), a drugą w temperaturze 100 °C przez 30 minut (monomery SNARE). Odwracaj probówki z przerwami, aby utrzymać próbki w roztworze.</li>
	<li>Próbki należy zamrażać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą gotowe do rozdzielenia za pomocą SDS-PAGE. Przed poddaniem próbek elektroforezie przy użyciu standardowych technik, należy ponownie zaolejić wcześniej gotowane próbki przez 5 minut w temperaturze 100 °C, a następnie rozmrozić próbki w temperaturze 37 °C w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Uruchom duplikaty próbek (30 - 40 μg białka na próbkę) zarówno na 8%, jak i 15% żelu; 8% zapewnia idealne oddzielenie kompleksu, podczas gdy 15% służy do ilościowego oznaczania monomerów białkowych SNARE (SNAP-25 ~ 25 kDa, VAMP2 ~ 18 kDa, syntaksyna-1 ~ 35 kDa). Utrzymuj źródło zasilania na poziomie 70 V, aż linia barwnika przejdzie przez żel do układania w stosy i zwiększ napięcie do 90 V. Uruchom żele, aż barwnik spłynie.</li>
	<li>Aby zachować monomery, przenieś białka do membrany nitrocelulozowej 0,2 μm na lodzie za pomocą buforu do zimnego transferu z dodatkiem 20% metanolu (MeOH) pod napięciem 70 V przez 45 minut.</li>
	<li>Suszyć membranę w przykrytym naczyniu przez 2 godziny do O/N przy temperaturze pokojowej (O/N zapewnia najlepsze wyniki).</li>
	<li>Zablokuj błony kompleksu SNARE w 10% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe (rozpoznające specyficzne składniki kompleksu SNARE) w rozcieńczeniu 1:1 000 i sondować O/N w temperaturze 4 °C na wytrząsarce obrotowej.
	<ol>
		<li>Opłucz bloty w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Tris plus 0,1% Tween-20 (TBS-T) 3 razy przez 5 minut każdy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować fluorescencyjne roztwory przeciwciał drugorzędowych w rozcieńczeniu 1:20 000 w 1% BSA w TBS-T i sondować przez 1 godzinę, pod przykryciem w temperaturze RT. Powtórzyć krok 2.12.1 po 1 godzinie.</li>
	<li>Obrazowanie na fluorescencyjnym urządzeniu skanującym wyposażonym w pakiet oprogramowania i ilościowe określenie zarówno kompleksu białkowego SNARE (prążki immunoreaktywne powyżej 40 kDa), jak i prążków monomerów (prążki immunoreaktywne przy 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa odpowiednio dla SNAP-25, VAMP2 i syntaksyny-1) przy użyciu instrukcji producenta dotyczących rysowania prostokątnych ROI.</li>
</ol>
3. Obrazowanie zdarzeń egzocytarnych za pomocą mikroskopii TIRF
Uwaga: Ten protokół wymaga specjalistycznego sprzętu do mikroskopii, w tym komory środowiskowej do utrzymywania temperatury, wilgotności i CO2, odwróconego mikroskopu TIRF wyposażonego w oświetlenie epifluorescencyjne, obiektywu TIRF o dużym powiększeniu/dużej aperturze numerycznej (NA), zautomatyzowanego stolika XYZ i czułego detektora CCD (Charge Coupled Device). Protokół ten wykorzystuje w pełni zautomatyzowany mikroskop odwrócony wyposażony w obiektyw TIRF 100x 1,49NA, laser półprzewodnikowy 491 nm i przetwornik CCD zwielokrotniający elektrony (EM-CCD). Wszystkie urządzenia są sterowane za pomocą oprogramowania do obrazowania i sterowania laserem. Przed rozpoczęciem protokół obrazowania włącza komorę środowiskową, scenę, lampę, komputer i kamerę.
<ol>
	<li>Wybierz obiektyw w oprogramowaniu do obrazowania. Po umieszczeniu obiektywu na miejscu przymocuj grzałkę obiektywu do kołnierza.</li>
	<li>Upewnij się, że obiektyw jest całkowicie opuszczony przed zamocowaniem inkubatora etapowego w gnieździe stopnia. Wlej równomiernie wodę destylowaną do wlotów inkubatora stopniowego, aby zapobiec rozlaniu.</li>
	<li>Włącz system inkubacji. Otwórz zawór do zbiornika CO2 i upewnij się, że ciśnienie jest odpowiednie dla systemu zgodnie z instrukcjami producenta. Odczekać, aż komora osiągnie 5% CO2 i 37 °C. Przed dodaniem naczynia do obrazowania umieść pustą miskę w inkubatorze, aby uniknąć kondensacji wody na obiektywie.</li>
	<li>Włącz źródło lasera.</li>
	<li>Inkubator na etapie otwartym i dodaj olejek immersyjny do soczewki. Umieścić próbkę w inkubatorze i ustabilizować za pomocą ramion stabilizujących lub obciążnika szalkowego. Podnieś obiektyw do momentu, aż olej zetknie się z dnem próbki. Przełącz się na oświetlenie światłem przechodzącym i znajdź neuronalną płaszczyznę ogniskową przez okulary.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie lasera i połącz się z oprogramowaniem sterującym laserem. Ustaw oświetlenie na szerokie pole i wybierz używany obiektyw (zalecane jest 100X 1.49 NA TIRF). Ustaw współczynnik załamania światła próbki (komórki ~1,38). Dostosuj intensywność lasera, odznaczając "TTL" dla lasera 491 nm. Ustaw suwak w pozycji 100, a następnie zmniejsz go z powrotem do wartości z zakresu od 20 do 40%. Ponownie sprawdź "TTL".</li>
	<li>Ponownie skoncentruj się na próbce w oświetleniu światłem przechodzącym. Przejdź do oprogramowania do obrazowania i wybierz oświetlenie laserowe 491 nm i otwórz migawkę. Dokładnie wyreguluj ogniskową lasera na suficie i wyśrodkuj punkt do środka membrany zamkniętego pola z usuniętym kondensatorem. Umieść kondensator do góry nogami na ławce optycznej, aby nie zarysować soczewki.</li>
	<li>Wymień kondensator i przejdź do oprogramowania TIRF i ustaw głębokość penetracji (PD) na 110 nm. Przełącz się z oświetlenia szerokokątnego na tryb oświetlenia TIRF w celu obrazowania.</li>
	<li>Znajdź komórki eksprymujące VAMP2-phluorin przez okulary za pomocą epifluorescencji szerokokątnej ze źródłem światła epifluorescencyjnego.
	<ol>
		<li>Dostosuj parametry obrazowania (czas ekspozycji, wzmocnienie i moc lasera), aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu i zakres dynamiczny, wykorzystując minimalny czas ekspozycji i intensywność lasera, aby zmniejszyć fotowybielanie i fototoksyczność (na przykład: ekspozycja między 50 a 100 ms, z wzmocnieniem 15 - 30 przy 30% maksymalnej mocy lasera).</li>
		<li>Ustaw ciągły autofokus na komórkę. Uzyskaj zestaw zdjęć poklatkowych z akwizycją odbywającą się co 0,5 sekundy przez 5 minut. W przypadku stanu stymulowanego netryną-1 dodać 500 ng/ml netryny-1 do naczynia z komórkami w okapie z przepływem laminarnym i umieścić naczynie z powrotem w inkubatorze na 1 godzinę przed obrazowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby określić ilościowo częstotliwość zdarzeń egzocytarnych znormalizowanych dla obszaru komórki i czasu, otwórz stosy obrazów w ImageJ, przeciągając plik do okna lub przechodząc do Plik> Otwórz> Nazwa pliku (Rysunek 2A Wstawka 1).
	<ol>
		<li>Aby usunąć stabilne sygnały fluorescencyjne, które nie reprezentują zdarzeń fuzji pęcherzyków, utwórz średnią projekcję z całego stosu za pomocą Image>Stack>Z-Project>Projection type: Average Intensity (Średnia intensywność). Odejmij ten średni obraz od każdego obrazu w timelapse za pomocą Process> Image Calculator> Image1: your stack Operacja: Odejmij Image2 nowo utworzoną średnią projekcji z. Podkreśla to zdarzenia egzocytarne (ryc. 2A, wstawka 2-3).</li>
		<li>Policz zdarzenia fuzji egzocytarnej na oko. Zdarzenia egzocytarne definiuje się jako pojawienie się ograniczonego dyfrakcją sygnału fluorescencji, który szybko dyfunduje, gdy VAMP2-phluorin dyfunduje w błonie plazmatycznej (figura 2A Inset 6).</li>
		<li>Użyj polecenia Próg, aby podświetlić pierwszy obraz za pomocą suwaka Image>Adjust>Threshold> aż cała komórka zostanie podświetlona jako próg (Rysunek 2A Wstawka 7 - 8).</li>
		<li>W obszarze Analizuj wybierz pozycję SetMeasurements i zaznacz obszar oraz wyświetl etykietę. Wybierz progowy obszar komórkowy za pomocą narzędzia do śledzenia różdżki i naciśnij "m", aby zmierzyć (Rysunek 2A, wstawka 7 - 8).</li>
		<li>Przenieś zarówno liczbę zdarzeń fuzji egzocytarnej, pomiary powierzchni komórki, jak i czas, który upłynął od obrazowania, do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć liczbę zdarzeń egzocytarnych / mm2 / czas (Figura 2A Wstawka 9).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kontrast interferencyjny różnicowy (DIC) Mikroskopia poklatkowa rozgałęzień aksonów
Uwaga: Dostępny jest kompletny protokół i demonstracja ogólnego podejścia do obrazowania DIC12. Chociaż protokół ten wykorzystuje DIC, inne metody mikroskopii światła przechodzącego mogą być używane do tych samych celów (na przykład: kontrast fazowy).
<ol>
	<li>Przy 2 DIV umieść naczynie do obrazowania ze szklanym dnem zawierające nietransfekowane neurony we wstępnie ogrzanej komorze środowiskowej, aby utrzymać wilgotne środowisko z 5% CO2 i 37 °C. Wykorzystaj mikroskop wyposażony w 60-krotny planapochromat, soczewkę obiektywową 1,4 NA DIC i kondensor o wysokiej NA, aby uzyskać najlepszą jakość i rozdzielczość obrazu.</li>
	<li>Dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aby znaleźć neurony przez okulary za pomocą oświetlenia światłem przechodzącym.</li>
	<li>Korzystając z funkcji akwizycji wielu obszarów w oprogramowaniu do obrazowania, znajdź i zapisz lokalizacje XYZ co najmniej 6 komórek. Ustaw stolik tak, aby interesujące go neurony mieściły się w polu widzenia, aby uzyskać najlepsze wyniki.
	<ol>
		<li>Stymulować 250 ng/ml netrin-1 i nacisnąć przycisk "rozpocznij akwizycję wieloobszarową". Sekwencyjnie rejestruj obrazy w każdej pozycji co 20 sekund przez 24 godziny, zatrzymując akwizycję i ponownie ustawiając ostrość w razie potrzeby.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeglądanie obrazów w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu za pomocą opcji Apps>Review Multi Dimensional Data>open file name. Zidentyfikuj stabilne gałęzie aksonów (o długości 20 μm), które tworzą się podczas sesji obrazowania. Użyj narzędzia do rysowania linii, aby zmierzyć gałąź stableaxon od podstawy przy aksonie do końcówki, aby upewnić się, że spełnione są wymagania dotyczące długości 20 μm.
	<ol>
		<li>W arkuszu kalkulacyjnym zapisz numer klatki po stymulacji netryny, gdy wypukłości błony inicjują się w obszarach, w których później tworzą się gałęzie, a także numer klatki po stymulacji netryny, gdy powstające gałęzie osiągają 20 μm długości.</li>
		<li>Pomnóż liczbę ramek między występem a formacją gałęzi przez 20 sekund, aby obliczyć czas formowania na gałąź.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Manipulacje toksynami i immunofluorescencja komórek stałych
<ol>
	<li>W 2 DIV potraktuj neurony w warunkach eksperymentalnych 250 ng / ml netrin-1 i / lub 10 nM toksyny botulinowej A (BoNTA), która rozszczepia białko SNARE SNAP25 i skutecznie hamuje egzocytozę za pośrednictwem SNARE13, plus 250 ng / ml netryny-1. Pozostaw jeden zestaw nieleczonych neuronów jako warunek kontrolny. 
	UWAGA: BoNTA wymaga stosowania środków ochrony oczu i dróg oddechowych podczas przygotowywania i stosowania roztworów. Utrzymuj wszystkie skażone materiały jako materiał niebezpieczny biologicznie i jak najszybciej przeprowadź autoklaw.</li>
	<li>W 3 DIV (24 godziny po poddaniu działaniu substancji) odessać pożywkę i natychmiast zastąpić co najmniej 1 ml utrwalacza PHEM (szczegóły patrz Tabela 1) ogrzanej do temperatury 37 °C. Inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Spłukać 3x PBS (do wykorzystania w przyszłości uszczelnić parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C).</li>
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe w ciemnej, wilgotnej komorze barwienia i przepuszczaj błony komórkowe przez 10 minut w świeżo rozcieńczonym 0,2% TritonX-100 w PBS (wykonanym z 10% bulionu TritonX-100).</li>
	<li>Usunąć roztwór przepuszczalny i spłukać 50 μl 1x z PBS. Blokuj przez 30 minut w ~ 50 μl 10% albuminy surowicy bydlęcej w PBS (BSA-PBS) lub 10% gotowanej surowicy osła w PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie spłucz 1x PBS. Inkubować szkiełka nakrywkowe w 50 μl pierwszorzędowego przeciwciała (tubulina 1:1,000 βIII, w celu potwierdzenia tożsamości neuronalnej) w 1% BSA-PBS przez 1 godzinę w RT, w ciemności.</li>
	<li>Wykonaj 3 prania po 5 minut w PBS. Inkubować szkiełka nakrywkowe w 50 μl spektralnie odrębnego przeciwciała drugorzędowego dla tubuliny (1:400) i fluorescencyjnej falloidyny (różni się w zależności od wzbudzenia: 488 falloidyny w 1:400, 647 falloidyny w 1:100) w 1% BSA-PBS przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyć 3x 5 min w 1x PBS i zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach w mediach montażowych.</li>
	<li>Odkurz nadmiar mediów montażowych z krawędzi szkiełka nakrywkowego i uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci.</li>
	<li>Zbieraj obrazy epifluorescencji o szerokim polu widzenia w mikroskopie odwróconym z obiektywem 40X 1,4NA, możliwościami epifluorescencyjnymi i EM-CCD.
	<ol>
		<li>Ręczne analizowanie rozgałęzień przy użyciu narzędzia ImageJ. Otwórz stosy obrazów w ImageJ, przeciągając plik do okna lub przechodząc do opcji Plik> Otwórz> Nazwa pliku (Rysunek 4A wstawka 1).</li>
		<li>Używając linii >segmentowej linii, prześledź akson, zdefiniowany jako najdłuższy neuryt wystający z somy (Rysunek 4A wstawka 2 - 3).</li>
		<li>Korzystając z narzędzia Analyze>Tools>ROI Manager, zapisz śledzenie aksonów jako obszar zainteresowania. Śledź i zapisz każdą gałąź aksonu, zdefiniowaną jako neuryt o długości ≥20 μm. W analizie należy uwzględnić tylko gałęzie pierwotne (wyrostki wyrastające bezpośrednio z aksonu) (rysunek 4A, wstawka 3 - 4).</li>
		<li>Naciśnij "m", aby zmierzyć zapisane obszary zainteresowania i przenieś długości w pikselach do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć długość w μm.</li>
		<li>Podziel liczbę gałęzi aksonów o długości ≥20 μm przez długość aksonu w μm podzieloną przez 100, aby uzyskać liczbę gałęzi aksonów na 100 μm długości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Drachman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+we+have+brain+to+spare%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Do we have brain to spare?</a> Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).</li>
<li>Serafini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin-1+Is+Required+for+Commissural+Axon+Guidance+in+the+Developing+Vertebrate+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System.</a> Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).</li>
<li>Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+netrin-1+in+the+guidance+of+cortical+efferents%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents.</a> Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).</li>
<li>Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78 (3), 425-435 (1994).</li>
<li>Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins%3A+versatile+extracellular+cues+with+diverse+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions.</a> Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).</li>
<li>Pfenninger, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+expansion%3A+a+neuron%27s+Herculean+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).</li>
<li>Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Netrin-1-sensitive+mechanism+promotes+local+SNARE-mediated+exocytosis+during+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+Primary+Culture+of+Embryonic+Mouse+Hippocampal+and+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+membrane+fusion+complex%3A+action+of+clostridial+neurotoxins+on+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly.</a> The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Centonze Frohlich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Contrast+and+Differential+Interference+Contrast+%28DIC%29+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Blasi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+neurotoxin+A+selectively+cleaves+the+synaptic+protein+SNAP-25%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25.</a> Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rozgałęzianie aksonów jest podstawowym procesem neurorozwojowym i stanowi podstawę rozległych połączeń neurologicznych układu nerwowego ssaków. Zrozumienie mechanizmów związanych z miejscową ekspansją błony plazmatycznej jest integralną częścią naszego zrozumienia zarówno normalnego, jak i patologicznego rozwoju neurologicznego. Zastosowanie wielotorowego podejścia obejmującego zarówno metodologie na poziomie populacji, jak i na poziomie pojedynczej komórki zwiększa odtwarzalność oraz rozdzielczość przestrzenną i czasową...

Ostatnie szacunki sugerują, że ludzki mózg składa się z 1011 neuronów z 1014 połączeniami synaptycznymi1, co podkreśla znaczenie rozgałęziania się aksonów in vivo. Zewnątrzkomórkowe wskazówki naprowadzające aksonów, takie jak netrin-1, kierują aksony do odpowiednich partnerów synaptycznych i stymulują rozgałęzianie aksonów, zwiększając w ten sposób pojemność synaptyczną2-5. Arboryzacja aksonalna zależna od Netrin-1 wiąże się ze znaczną ekspansją błony plazmatycznej6, co jak przypuszczamy, wymaga dostarczenia dodatkowych składników błony poprzez fuzję pęcherzyków egzocytarnych zależną od kompleksu SNARE7. 
Badanie roli egzocytozy za pośrednictwem SNARE w rozgałęzianiu aksonów zależnym od netryny-1 jest skomplikowane z powodu kilku czynników. Po pierwsze, heterogeniczność neuronów korowych zwiększa wielkość próbki wymaganej do zidentyfikowania znaczących efektów, komplikując techniki jednokomórkowe, takie jak obrazowanie. Po drugie, chociaż techniki biochemiczne pozwalają na obserwację zmian zachodzących na poziomie populacji, brakuje im rozdzielczości czasowej i przestrzennej niezbędnej do zlokalizowania ekspansji błony plazmatycznej do aksonu w ramach czasowych rozgałęziania się aksonów. Wreszcie, chociaż gałęzie aksonów tworzą się w ciągu godzin, zmiany komórkowe, które przyczyniają się do wydłużenia aksonów, mogą rozpocząć się w ciągu kilku minut i wystąpić w ciągu kilku sekund, rozszerzając w ten sposób zakres czasowy do rozważenia eksperymentalnego. 
Przedstawiamy podejście oparte na wielu technikach, które odnosi się do tych różnorodnych czasowych i przestrzennych skal egzocytozy i rozgałęziania aksonów, a tym samym zwiększa nasze zrozumienie podstawowych mechanizmów komórkowych. Wykorzystanie tych podejść dostarcza dowodów potwierdzających kluczową rolę egzocytozy za pośrednictwem SNARE w rozgałęzianiu aksonów.

<table><tbody><tr><td>6-dołkowe płytki poddane hodowli tkankowej</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>szklane szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher scientific</td><td>12-545-81</td><td>12CIR-1.5; muszą być poddane działaniu kwasu azotowego przez 24 godziny, przepłukane w wodzie DI 2x i wysuszone przed użyciem. Musi być pokryty 1 mg/ml poli-d-lizyny i wypłukany przed posiewem komórek.</td></tr><tr><td>Roztwór nukleofekcji Amaxa</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td>100 ml/transfekcja</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector/elektroporator</td><td>Program Lonza</td><td></td><td>O-005</td></tr><tr><td>35 mm Naczynia do obrazowania żywych komórek ze szklanym dnem</td><td>Matek Corporation</td><td>p356-1.5-14-C</td><td>muszą być pokryte 1 mg/ml poli-d-lizyny i przepłukane przed posiewem komórek</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Olympus IX81-ZDC2</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampa ksenonowa Lambda LS</td><td>Firma Sutter Instruments Środowisko</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator górny</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x 1.49 NA TIRF</td><td>obiektyw Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon EM-CCD</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Licor System obrazowania w podczerwieni</td><td>LI-COR</td><td>Odyssey CL-X</td><td>Służy do skanowania kleksów</td></tr><tr><td>Studio obrazów pakiet oprogramowania</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Służy do skanowania w systemie Odyssey Infrared; Image studio lite służy do analizy plam w trybie offline</td></tr><tr><td>Metamorph dla urządzeń Olympus</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td>wersja 7.7.6.0</td><td>Oprogramowanie używane do obrazowania i analizy timelapse DIC</td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące CELL TIRF</td><td>Oprogramowanie Olympus</td><td></td><td>używane do sterowania laserami do obrazowania TIRF</td></tr><tr><td>Fidżi (zdjęcie J)</td><td>NIH</td><td>ImageJ Wersja 1.49t</td><td></td></tr><tr><td>60x Plan Apochromat 1.4 NA</td> <td>obiektywOlympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x 1.4 NA Plan Apochromat</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasew</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td>Roztwór bazowy do pożywek hartujących bez surowicy i trypsyny</td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td>500 ml/50 ml Pożywka bez surowicy i pożywka do gaszenia trypsyny</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td></td><td>35050-061</td><td>1 ml/50 ml Pożywka bez surowicy</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Bio Basic Incorporated</td><td>9048-46-8</td><td>10% roztwór w 1x PBS do blokowania szkiełek nakrywkowych; 5% roztwór w TBS-T do blokowania błon nitrocelulozowych.</td></tr><tr><td>10x&nbsp; trypsyna</td><td>Sigma</td><td>59427C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CELLGRO</td><td>25-060-CL</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)+ Ca + Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-cm</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Corning/CELLGRO</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher scientific</td><td>CAS67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2Fisher</td> <td>scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS base</td><td>Fisher scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>N-Propyl Galusan</td><td>MP Biomedicals</td><td>102747</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol Klasa fotometryczna</td><td>Acros Organics</td><td>18469-5000</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol (klasa nieoptyczna)</td><td>Fisher scientific</td><td>CAS56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>B-merkaptoetonalny</td><td>Fisher scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>152340-147</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizyna</td><td>Sigma</td><td>p-7886</td><td>Rozpuszczony w sterylnej wodzie w stężeniu 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Toksyna botulinowa A Lista BoNTA</td><td>Laboratoria biologiczne</td><td>128-A</td><td></td></tr><tr><td>Królik poliklonalny anty ludzki VAMP2</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>11829</td><td></td></tr><tr><td>Mysi monoklonalny anty szczur Syntaxin1A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-12736</td><td></td></tr><tr><td>Koza poliklonalna anty ludzka SNAP-25</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7538</td><td></td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna anty ludzka i beta; III-tubulina&nbsp;</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 i Alexa Fluor 488 falloidyna lub Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-COR IR-dye przeciwciała drugorzędowe</td><td>LI-COR</td><td>P / N 925-32212, P / N 925-68023, P/N 926-68022</td><td>800 ośle anty-mysz, 680 osioł anty królik, 680 osioł anty koza</td></tr><tr><td>0,2 i # 956; m wielkość porów membrana nitrocelulozowa</td><td>Biorad</td><td>9004-70-0</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher scientific</td><td>S25426A</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol Blue</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher scientific</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher scientific</td><td>O-4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher scientific</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>40% bis-akrylimidu</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1408-1</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Alternatywne zwalidowane przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Monoklonalna antysyntaksyna HPC-1 klon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0664</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Mysi monoklonalny synaptobrevin 2 (VAMP2)</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>104-211</td><td></td></tr><tr><td>Mysie monoklonalne</td><td>systemy synaptyczne</td> SNAP25 <td>111-011</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Podczas rozwoju neuronalnego, rosnące aksony rozciągają się na wielu partnerów synaptycznych poprzez rozwijanie gałęzi aksonalnych. Rozgałęzianie się aksonów jest promowane przez zewnątrzkomórkowe wskazówki naprowadzające, takie jak netryna-1, i powoduje dramatyczny wzrost powierzchni aksonalnej błony plazmatycznej. Rozgałęzienia aksonów zależne od Netrin-1 prawdopodobnie obejmują czasową i przestrzenną kontrolę rozszerzania błony plazmatycznej, której składniki są dostarczane przez fuzję pęcherzyków egzocytarnych. Te zdarzenia fuzji są poprzedzone tworzeniem kompleksów SNARE, zawierających v-SNARE, takich jak VAMP2 (białko błonowe związane z pęcherzykami 2) i t-SNARE błony plazmatycznej, syntaksynę-1 i SNAP25 (białko związane z synaptosomalami 25). Szczegółowo opisano w niniejszym dokumencie wielotorowe podejście stosowane do badania roli egzocytozy za pośrednictwem SNARE w rozgałęzianiu aksonów. Mocną stroną połączonego podejścia jest pozyskiwanie danych w różnych rozdzielczościach przestrzennych i czasowych, począwszy od dynamiki pojedynczych zdarzeń fuzji pęcherzyków w pojedynczych neuronach, a skończywszy na tworzeniu kompleksów SNARE i rozgałęzianiu aksonów w populacjach hodowanych neuronów. Protokół ten wykorzystuje uznane podejścia biochemiczne do oznaczania poziomów endogennych kompleksów SNARE i mikroskopii całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) neuronów korowych eksprymujących VAMP2 znakowanych wrażliwym na pH GFP (VAMP2-pHlourin) w celu identyfikacji zależnych od netryny-1 zmian aktywności egzocytarnej w poszczególnych neuronach. Aby wyjaśnić czas rozgałęzień zależnych od netryny-1, wykorzystuje się mikroskopię poklatkowego kontrastu interferencji różnicowej (DIC) pojedynczych neuronów w ciągu kilku godzin. Utrwalona immunofluorescencja komórek w połączeniu z neurotoksynami botulinowymi rozszczepiającymi maszynerię SNARE i blokującymi egzocytozę pokazuje, że rozgałęzianie aksonów zależne od netryny-1 wymaga aktywności egzocytarnej za pośrednictwem SNARE.

Wykorzystanie biochemicznych technik in vitro do oznaczenia ilości kompleksów SNARE odpornych na SDS w populacji neuronów. Rysunek 1 przedstawia wynikowy western blot po zakończeniu analizy kompleksów SNARE odpornych na SDS z zastosowaniem przeciwciał przeciwko SNAP-25, syntaksynie 1A i VAMP2.
Mikroskopia TIRF w obrębie podstawowej błony komórkowej umożliwia uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości p...

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie ilościowych obserwacji czasowego i przestrzennego występowania fuzji pęcherzyków egzocytowych neuronów oraz rozgałęziania aksonów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, takie jak to, kiedy i gdzie fuzja pęcherzyków wprowadza materiał błonowy do rozszerzającej się błony plazmatycznej podczas rozwoju neuronów. Główną zaletą tej techniki jest połączenie obrazowania żywych komórek, co pozwala na uzyskanie wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w pojedynczych komórkach, z podejściami biochemicznymi umożliwiającymi pozyskanie informacji dotyczących całej populacji.Po hodowli i stymulacji neuronów korowych Netriną-1 lub kontrolą zgodnie z treścią protokołu, odessać PBS z pierwszej studni danej warunku i zastąpić go 250 µl buforu do homogenizacji. Inkubować na lodzie przez pięć minut, a następnie, używając cell liftera, zhomogenizować komórki na lodzie.Odssać PBS z kolejnej studzienki o tych samych warunkach i dodać do niej niedawno homogenizowaną mieszaninę, co zwiększy stężenie białek. Następnie przenieść homogenizat do schłodzonej rurki do mikrowirówki o pojemności 1,6 ml umieszczonej w lodzie i dodać 20% Triton X-100, aby uzyskać stężenie końcowe 1%. Następnie, używając pipety 1 000 µL, poddać mieszaninę tryturacji dziesięciokrotnie, minimalizując powstawanie pęcherzyków powietrza. Inkubować rurki w lodzie przez dwie minuty w celu solubilizacji białek.Następnie odwiruj próbkę przy 6 010 RCF w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby utworzyć osad z materiału nierozpuszczonego. Przenieś nadsącz do nowej, schłodzonej probówki o pojemności 1,6 mililitra umieszczonej w lodzie. Następnie przeprowadź analizę metodą Bradforda w celu oznaczenia stężenia białka.Następnie należy użyć buforu do homogenizacji z 1% Triton X-100 oraz 5X buforu do próbek uzupełnionego o BME, aby rozcieńczyć próbki do stężenia końcowego 3-5 mg/mL. Każdą próbkę eksperymentalną należy równomiernie podzielić do dwóch probówek. Następnie jedną próbkę inkubuje się w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a drugą w temperaturze 100 °C przez 30 minut.Okresowo odwracaj probówki, aby próbki pozostawały w roztworze. Następnie przeprowadź elektroforezę SDS-PAGE oraz Western blotting zgodnie z protokołem tekstowym. Po ustawieniu mikroskopu TIRF oraz próbki i odnalezieniu płaszczyzny ogniskowania neuronów zgodnie z protokołem tekstowym.Uruchom oprogramowanie lasera i połącz się z programem sterującym laserem. Ustaw oświetlenie na szerokie pole (wide field) i wybierz obiektyw. Następnie ustaw współczynnik załamania światła próbki i dostosuj intensywność lasera, odznaczając opcję TTL dla lasera 491.Optymalizacja parametrów obrazowania jest istotna podczas obrazowania nienaruszonych pęcherzyków egzocytowych na dnie, aby uniknąć dryftu ostrości i fototoksyczności, uzyskując jednocześnie obrazy o wysokim stosunku sygnału do szumu, wystarczającym do analizy. Przesuń suwak do wartości 100, a następnie zmniejsz go do wartości między 20 a 40. Następnie ponownie sprawdź TTL.Następnie ponownie ustaw ostrość na próbce przy użyciu oświetlenia w świetle przechodzącym. W oprogramowaniu do obrazowania wybierz oświetlenie laserem 491 i otwórz migawkę. Umieść kondensor odwrócony do góry dnem na stole optycznym, aby nie porysować soczewki.Dokonaj precyzyjnej regulacji punktu ogniskowego lasera na suficie, a następnie, po usunięciu kondensora, ustaw punkt centralnie względem zamkniętej przysłony pola. Następnie zamontuj z powrotem kondensor i w oprogramowaniu TIRF ustaw głębokość penetracji na 110 nanometrów. Następnie przełącz tryb oświetlenia z szerokiego pola na tryb oświetlenia TIRF w celu przeprowadzenia obrazowania.Następnie, korzystając z szerokopolowej epifluorescencji, należy odnaleźć przez okulary komórki wykazujące fluorescencję VAMP2. Następnie, aby ograniczyć fotoblaknięcie i fototoksyczność, należy dostosować parametry obrazowania w celu maksymalizacji stosunku sygnału do szumu oraz zakresu dynamicznego, stosując minimalny czas ekspozycji i intensywność lasera. Należy ustawić ciągłe automatyczne ogniskowanie dla każdej komórki.Następnie wykonaj zestaw obrazów time-lapse, rejestrując obrazy co 0.5 sekundy przez pięć minut. W przypadku warunku stymulacji Netrin-1, w laminarnej komorze z przepływem powietrza, dodaj do szalki z komórkami Netrin-1 do stężenia końcowego 500 nanogramów per milliliter i wprowadź szalkę z powrotem do inkubatora na jedną godzinę przed obrazowaniem. Celem jest ilościowe określenie częstotliwości zdarzeń egzocytotycznych z normalizacją w odniesieniu do powierzchni komórki i czasu.W programie ImageJ otwórz stosy obrazów, przeciągając plik do okna lub wybierając Plik, Otwórz, nazwa pliku. Aby usunąć stabilne sygnały fluorescencyjne, które nie reprezentują zdarzeń fuzji pęcherzyków, użyj Obraz, Stos, Projekcja Z, Typ projekcji Średnia Intensywność. Aby utworzyć średnią Projekcję Z całego stosu.Odejmij otrzymany obraz średni od każdego obrazu w serii timelapse, korzystając z opcji Process, Image Calculator, wybierając w Image 1 swój stos obrazów, a w Operation opcję Subtract image two. Wynikiem będzie nowo utworzona Projekcja Z. Pozwoli to na uwydatnienie zdarzeń egzocytozy.Następnie należy wzrokowo policzyć zdarzenia fuzji egzocytotycznej, które można zidentyfikować jako punkty dyfrakcyjnie ograniczonych sygnałów fluorescencyjnych, ulegające szybkiej dyfuzji w miarę rozprzestrzeniania się fluorescencyjnego VAMP2 w błonie plazmatycznej. Zaznacz pierwszy obraz, wybierz Image, Adjust, Threshold i przesuwaj suwak, aż cała komórka zostanie zaznaczona progiem. Następnie w menu Analyze wybierz Set Measurements i zaznacz pole area oraz display label.Za pomocą narzędzia do obrysowywania (wand tracing tool) zaznacz obszar komórkowy po zastosowaniu progu i naciśnij M, aby dokonać pomiaru. Przenieś zebrane dane do arkusza kalkulacyjnego zgodnie z protokołem tekstowym. Po dwóch dniach hodowli in-vitro umieść szalkę do obrazowania z szklanym dnem zawierającą nieprzetransfekowane neurony w wstępnie ogrzanej, wilgotnej komorze środowiskowej.W celu uzyskania najlepszej jakości i rozdzielczości obrazu należy użyć mikroskopu wyposażonego w obiektyw DIC 60x plan apochromat 1,4 NA oraz kondensator o wysokiej aperturze numerycznej. Następnie, przy użyciu oświetlenia przechodzącego, należy dostosować płaszczyznę ogniskowania, aby odnaleźć neurony przez okulary. W przypadku obrazowania DIC rozgałęzień aksonów, prawidłowa konfiguracja oświetlenia będzie kluczowa dla optymalizacji obrazu i niezbędna do uzyskania wyników nadających się do analizy.Następnie, gdy badane neurony znajdują się w polu widzenia, należy użyć funkcji akwizycji wieloobszarowej w oprogramowaniu do obrazowania, aby zlokalizować i zapisać współrzędne XYZ co najmniej sześciu komórek. Teraz należy dodać Netrin-1 lub inny interesujący czynnik do stężenia końcowego 250 ng/mL, aby stymulować komórki, a następnie uruchomić wieloobszarową akwizycję. Należy sekwencyjnie pozyskiwać obrazy w każdej pozycji co 20 s przez 24 h.Wstrzymaj akwizycję i w razie potrzeby ponownie ustaw ostrość. W oprogramowaniu do obrazowania przejrzyj obrazy, wybierając Apps, Review Multi Dimensional Data, a następnie otwórz żądany plik. Zidentyfikuj stabilne odgałęzienia aksonów, które utworzyły się podczas sesji obrazowania.Użyj narzędzia do wyznaczania regionu (trace region tool), aby zmierzyć stabilną gałązkę aksonu od podstawy aksonu do jego zakończenia. Po potraktowaniu neuronów Netryną oraz toksyną botulinową, a następnie utrwaleniu i przeprowadzeniu immunobarwienia na beta-3 tubulinę oraz aktynę zgodnie z protokołem tekstowym, użyj mikroskopu odwróconego do wykonania obrazów epifluorescencyjnych w szerokim polu.Otwórz stos obrazów w programie ImageJ, a następnie w celu manualnej analizy rozgałęzień wykorzystaj narzędzia: linia (line), linia segmentowana (segmented line) i obrys (trace), aby wyznaczyć akson, definiowany jako najdłuższy neuryt wyrastający z somy. Za pomocą funkcji Analyze, Tools, ROI Manager zapisz obrys aksonu jako obszar zainteresowania (ROI). Następnie obrysuj i zapisz każdą gałąź aksonu, definiowaną jako neuryt o długości większej lub równej 20 µm.W analizie należy uwzględnić wyłącznie gałęzie główne. Przedstawiono tutaj analizę Western blot po zakończeniu testu na kompleksy SNARE odporne na SDS. Wykryto obecność SNAP25, Syntaxin 1A oraz VAMP2.Białka SNARE w kompleksie; tutaj przedstawiono możliwe do zidentyfikowania monomery. Tutaj pokazano przykład zdarzenia egzocytozy zapośredniczonej przez VAMP2 z fluorescencją, zachodzącego w czasie w neuronie korowym. Powiększone wstawki przedstawiają somę, odgałęzienie aksonu oraz stożek wzrostu aksonu, co obrazuje użyteczność przestrzenną tego testu.Okręgi oznaczają pojedyncze zdarzenia fuzji egzocytoticznej, które można zaobserwować za pomocą mikroskopii TIRF. To obrazowanie DIC w odstępach czasu pokazuje stymulowane przez Netrinę tworzenie się odgałęzienia aksonu w czasie rzeczywistym. Te miejsca wskazują początkową protruzyję w miejscu odgałęzienia.Reprezentują one w pełni uformowane stabilne odgałęzienia o długości co najmniej 20 µm, mierzonej od głównego aksonu do koncówki odgałęzienia. W tym eksperymencie neurony kory mózgowej w 3. dniu in vitro (DIV) poddano działaniu Netryny-1, która stymuluje rozgałęzianie, lub toksyny botulinowej A, która rozszczepia SNAP25, komponent kompleksu SNARE, i blokuje egzocytozę. Wyniki wykazują, że egzocytoza zapośredniczona przez SNARE jest niezbędna dla rozgałęziania zależnego od Netryny.Po opanowaniu techniki, obrazowanie DIC można przeprowadzić podczas jednej nocnej sesji obrazowania. Obrazowanie TIRF poszczególnych zdarzeń egzocytozy można zrealizować w ciągu 4-5 godzin. Protokół biochemiczny formowania kompleksu SNARE można przeprowadzić w ciągu dwóch godzin.Podczas wykonywania tych procedur ważne jest, aby zachować odpowiednie tempo i nie spieszyć się przy żadnym z etapów. Każda procedura wymaga uwagi i cierpliwości, aby uzyskać najlepsze wyniki. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak kotransfekcja oznakowanych komponentów pęcherzyków z oznakowanymi kandydatami na ładunki, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania.Na przykład, co stanowi ładunek pęcherzyków egzocytozy? Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neuronauki do badania neuritogenezy, rozgałęziania aksonów oraz innych etapów morfogenezy w dowolnej dysocjowanej kulturze neuronalnej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak obserwować i kwantyfikować przestrzenną i czasową naturę zdarzeń fuzji pęcherzyków egzocytozy neuronów w odniesieniu do zmian w morfogenezie neuronalnej.Należy pamiętać, że praca z toksyną botulinową lub laserami o dużej mocy może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie odpowiedniej odzieży ochronnej i korzystanie z mechanizmu blokady bezpieczeństwa mikroskopu.

utilizing-combined-methodologies-to-define-role-plasma-membrane

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym kurczaka, z wykorzystaniem elektroporacji in ovo genów reporterowych pod kontrolą specyficznych elementów enhancera.

Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

Stereotypowe projekcje aferentów sensorycznych do rdzenia kręgowego gryzoni stanowią łatwo dostępny system eksperymentalny do badania rozgałęzień aksonalnych poprzez śledzenie pojedynczych aksonów.

Znakowanie neuronów ziewnięcia grzbietowego (DRG) barwnikiem DiI w celu badania rozgałęzień aksonalnych w preparacie całego rdzenia kręgowego zarodka myszy

Opisano metodę, która pozwala na specyficzne dla typu komórek i możliwe do śledzenia obniżenie ekspresji genów w rurce nerwowej. Wykazujemy, w jaki sposób elektroporacja in ovo plazmidów opartych na mikroRNA, które wywołują kontrolowaną przestrzennie i czasowo interferencję RNA, może być wykorzystana do badania prowadzenia aksonów komisuralnych w rozwijającej się rurce nerwowej.

In ovo elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie DiI w preparatach typu open-book

Źródło: Winkle, C. C., et al. Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia technikę obrazowania na żywo z wykorzystaniem mikroskopii różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) do obserwacji rozgałęzień aksonalnych w czasie rzeczywistym w neuronach korowych. Filmy poklatkowe ukazują efekty leczenia netryną-1, cząsteczką sygnałową, która indukuje...

Obrazowanie in vitro w czasie rzeczywistym rozgałęzień aksonalnych w neuronach korowych myszy

Opisujemy tutaj użycie wrażliwego na pH wariantu białka zielonej fluorescencji, pHluorin, do badania czasoprzestrzennej dynamiki receptorów naprowadzania aksonów przemieszczających się na powierzchni komórki. Receptor znakowany pHluoryną ulega ekspresji zarówno w hodowli komórkowej, jak i in vivo, za pomocą elektroporacji zarodka pisklęcia.

Stosowanie pHluorin do oceny dynamiki receptorów kierowania aksonami w hodowli komórkowej i w zarodku piskląt

Ten protokół opisuje izolację neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) izolowanych od szczurów oraz hodowlę neuronów DRG na statycznym, wstępnie rozciągniętym systemie hodowli komórek w celu poprawy wyrównania aksonów, z późniejszą kokulturą komórek Schwanna (SC) w celu promowania mielinizacji.

Podejście do poprawy wyrównania i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego

Ta procedura opisuje, jak szybko inicjować, rozszerzać i łączyć neuryty zorganizowane w komorach mikroprzepływowych za pomocą pokrytych poli-D-lizyną koralików przymocowanych do mikropipet, które kierują wydłużaniem neurytu.

Przeprogramowanie obwodów neuronalnych: nowa metoda szybkiego wydłużania neurytów i funkcjonalnego połączenia neuronalnego

Prezentujemy rozwój samoorganizujących się, trójwymiarowych wiązek podłużnie wyrównanych somatów astrocytarnych i procesów w nowej obudowie z biomateriału. Te zaprojektowane "żywe rusztowania", wykazujące średnicę w skali mikronów, a jednocześnie wydłużające się na centymetry, mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych.

Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego

Ten protokół opisuje metodę jednoczesnego obrazowania rozgałęzień aksonów wzgórza i tworzenia synaps w organotypowych kokulturach wzgórza i kory mózgowej. Poszczególne aksony wzgórzowo-korowe i ich zakończenia presynaptyczne są wizualizowane za pomocą techniki elektroporacji pojedynczej komórki z synaptofizyną znakowaną DsRed i GFP.

Wizualizacja rozgałęzień aksonów wzgórzowo-korowych i tworzenia synaps w kokulturach organotypowych

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Odkryj metodę obserwacji egzocytozy zależnej od SNARE w rozgałęzianiu aksonów neuronów kory mózgowej stymulowanych Netrin-1. Technika łączy obrazowanie komórkowe z biochemią.

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Przeglądaj więcej filmów