Mapowanie hamujących obwodów neuronalnych za pomocą fotostymulacji skaningowej laserowej
6 października 2011
Ten artykuł przedstawia podejście polegające na połączeniu fotostymulacji skaningowej laserowej z zapisami całych komórek u myszy transgenicznych wykazujących ekspresję GFP w ograniczonych populacjach neuronów hamujących. Technika ta pozwala na obszerne mapowanie i analizę ilościową lokalnych obwodów synaptycznych specyficznych hamujących neuronów korowych.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie lokalnej organizacji funkcjonalnej hamujących obwodów neuronalnych. Procedura rozpoczyna się od przygotowania żywych wycinków mózgu z pierwotnej kory somatosensorycznej myszy. Następnym krokiem jest wizualizacja i zarejestrowanie z docelowego GFP ekspresji typów komórek hamujących w wycinku mózgu.
Po tej laserowej skanowaniu fotostymulacji za pomocą glutaminianu, odklejanie jest wykorzystywane do aktywacji małych skupisk neuronów presynaptycznych jako pobudzających lub hamujących. Prądy postsynaptyczne są rejestrowane w GFP wyrażającym między neuronami. Ostatnim krokiem jest przejście przez stymulację fotograficzną, analizę danych i wygenerowanie ilościowych map danych synaptycznych do zarejestrowanych neuronów.
Ostatecznie fotostymulacja skaningowa za pomocą skaningu laserowego w połączeniu z zapisami całych komórek umożliwia budowę szczegółowych map wejść synaptycznych do określonych typów neuronów hamujących, co może pozwolić na określenie organizacji i funkcji lokalnych obwodów hamujących korę mózgową. Technika oparta na stymulacji fotograficznej została zapoczątkowana przez dr Larry'ego Katza, Neda Callowaya i dalej rozwijana przez dr Carols Waboda, moją osobę, dr Xing Z trenowaną u dr dr Callowaya w Instytucie Salka, gdzie prowadził wiele badań nad obwodami międzyustnymi. Nasza grupa obecnie rozszerza i kontynuuje te badania, badając obwody międzyustne.
Aby rozpocząć tę procedurę, należy złożyć w ofierze transgeniczną mysz w okresie poporodowym dwa do trzech tygodni przez dekapitację i szybko usunąć mózg, umieścić mózg w zamrożonym i natlenionym roztworze tnącym. Następnie użyj gogli GFP, aby wizualnie przebadać mózg i sprawdzić ekspresję GFP. Następnie pokrój pierwotną korę somatosensoryczną na sekcje o grubości 400 mikrometrów za pomocą wibratora.
Inkubować plastry w sacharozie zawierającej płyn mózgowo-rdzeniowy z bąbelkami 95% O2 i 5% CO2 w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez 30 minut do jednej godziny. Następnie przenieś plastry do zwykłego płynu mózgowo-rdzeniowego A w temperaturze pokojowej, aby przygotować laser do eksperymentu, włącz system chłodzenia lasera i zasilanie. Następnie włącz cały sprzęt związany ze sterowaniem stymulacją fotograficzną, w tym system lustra skanującego i modulator optyczny oraz migawkę elektroniczną oraz wzmacniacz wejściowy fotodiody.
Następnie włącz sprzęt elektrofizjologiczny, taki jak wzmacniacz multi clamp 700 B i mikromanipulatory. Zapisy elektrofizjologiczne, fotostymulacja i obrazowanie prowadzone są w komorze perfuzyjnej slice zamontowanej na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu. Następnie włącz kamerę do obrazowania, wycinek zostanie zwizualizowany w mikroskopie pionowym z optyką DIC w podczerwieni i epi fluorescencyjnym przez system obrazowania.
Następnie otwórz oprogramowanie FS oparte na MATLAB i oprogramowanie kamery Q capture na monitorze. Przed uruchomieniem eksperymentu sprawdź system laserowej fotostymulacji i upewnij się, że jest w stanie roboczym. Umieść kartkę papieru pod obiektywem mikroskopu z czterema otworami, aby obserwować wzór skanowania laserowego podczas pracy systemu.
Aby uzyskać mikroelektrodę o rezystancji od czterech do sześciu megapikseli, pociągnij szklaną elektrodę za pomocą ściągacza do pipet. Następnie napełnij elektrodę wewnętrznym roztworem zawierającym 0,1% biotyny do znakowania komórek i identyfikacji morfologicznej. Następnie włącz ciśnieniowy system perfuzyjny, aby wpompować A CSF do komory.
Upewnij się, że stały poziom płynu wynosi 2,0 milimetra powyżej plastra w komorze. Podwielokrotność roztworu podstawowego glutaminianu MNI w sadzkach dodaje się do 25 mililitrów krążącego płynu mózgowo-rdzeniowego A w celu uzyskania stężenia 0,2 milimolowego glutaminianu w klatce. Następnie przenieś jeden wycinek mózgu do komory nagraniowej.
Uruchom system obrazowania, aby sprawdzić jakość plastra i anatomicznie zlokalizować główny obszar somatosensoryczny. Następnie zakotwicz plasterek za pomocą wykonanego na zamówienie platynowego pierścienia ze sznurka i uważaj, aby nie umieścić kotwicy nad obszarem mózgu przeznaczonym do nagrywania. Wizualizuj komórki za pomocą obiektywu 60x w oparciu o wizualizację ekspresji GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym DIC.
Zidentyfikuj i wybierz typy komórek hamujących. Należy pamiętać, że nagrywanie będzie odbywać się pod kontrolą wizualną wspomaganą przez DIC w podczerwieni. Monitorowanie wideo i przełączanie między trybami DIC i fluorescencyjnymi jest konieczne, aby potwierdzić lokalizację ogniwa GFP przy jednoczesnym opuszczeniu elektrody do ogniwa docelowego.
Korzystanie z konwencjonalnej techniki mocowania punktowego. Najpierw zastosuj nadciśnienie do elektrody. Przesuń go blisko powierzchni komórki, aby uzyskać dostrzegalny wgłębienie na docelowej błonie komórkowej.
Następnie szybko zastosuj podciśnienie, aby utworzyć giga uszczelnienie i pęknąć w ogniwie, jednocześnie monitorując bieżące reakcje wtrysku na monitorze wideo. Po włamaniu zrób zdjęcia zarejestrowanego GFP wyrażającego wewnątrz neuronu przy 60-krotnym powiększeniu w trybach DIC i fluorescencyjnym w celu weryfikacji online. Przed zebraniem danych o fotostymulacji wstrzyknij hiperpolaryzujące i depolaryzujące impulsy prądu, aby zbadać podstawowe właściwości elektrofizjologiczne każdej komórki.
Po ustabilizowaniu zapisu całej komórki uzyskuje się z dobrą rezystancją dostępu, która zwykle jest mniejsza niż 20 megaomów, przełącz obiektyw mikroskopu z powiększenia 60 x na czterokrotne w celu stymulacji fotograficznej skanowania laserowego, uzyskaj obraz plasterka przy czterokrotnym powiększeniu i użyj go do prowadzenia i rejestrowania miejsc stymulacji fotograficznej. Ustaw parametry fotostymulacji i akwizycji danych, aktywując moduł przełącznika konfiguracyjnego phys. Użyj jednomilisekundowego impulsu laserowego o mocy około 20 miliwatów z interwałem bodźca wynoszącym jedną sekundę.
W przypadku mapowania stymulacji fotograficznej należy uzyskać ślady danych z jednej sekundy próbkowanej w częstotliwości 10 kiloherców. Następnie załaduj obraz z czterema x slice do modułu mappera phys. Określ lokalizację somy i ustaw miejsca fotostymulacji według wzoru 16 na 16 z 80 mikrometrami na 80 mikrometrów.
Odstępy wokół lokalizacji komórki, która obejmuje wszystkie warstwy korowe. Następnie zmapuj profil wzbudzenia zarejestrowanego neuronu, badając miejsca skoków w odpowiedzi na stymulację foto w bieżącym trybie cęgowym. Nasze przyjazne dla użytkownika oprogramowanie z funkcjami wyświetlania online ułatwia eksperymenty z mapowaniem.
Następnie zmapuj lokalne połączenia obwodów wzbudzających, wykrywając pobudzające prądy postsynaptyczne z zarejestrowanej komórki Dzięki skanowaniu laserowemu w różnych lokalizacjach utrzymuj ogniwo na ujemnym poziomie 70 miliwoltów w trybie cęgów napięcia, aby wykryć wewnętrzne prądy wzbudzające. Następnie powtórz pobudzające mapy prądu postsynaptycznego dwa do trzech razy z obróconym lub odwróconym wzorcem fotostymulacji. Aby zmapować lokalne połączenia obwodów hamujących, wykryj hamujące prądy postsynaptyczne z zarejestrowanej komórki.
Utrzymuj ogniwo na poziomie bliskim zeru miliwoltów w tym przypadku, ujemnym 15 miliwoltom w trybie cęgów napięcia w celu wykrycia zewnętrznych prądów hamujących. Po wykonaniu wszystkich testów fizjologicznych delikatnie wyjmij elektrodę z zarejestrowanej komórki. Wyjmij wycinek mózgu z komory, a następnie utrwal go na noc w 4% para formaldehydzie i zabarwić nagrane komórki na biotynie.
W tym eksperymencie do klasyfikacji neuronów hamujących wykorzystano kombinację ekspresji GFP, wewnętrznej elektrofizjologii i cech morfologicznych. Pokazano. Oto przykład i mapa surowych danych ilustrująca fotostymulację skaningiem laserowym, która umożliwia obszerne mapowanie lokalnych połączeń obwodów korowych z zarejestrowanym neuronem hamującym. Oto przykłady oznaczonych kolorami ilościowych map wejściowych pochodzących z surowych śladów pokazanych właśnie na rysunku D. Amplitudy zdarzeń synaptycznych wykrytych w zarejestrowanym międzyneuronowym neuronze są oznaczone kolorami i topograficznie nałożone na miejsca stymulacji fotograficznej.
Położenie treści komórki jest oznaczone czerwonym otwartym okręgiem na pasku skali. Ciepłe kolory wskazują na silne wejścia synaptyczne, a chłodne kolory wskazują na słabą łączność lub brak połączenia z docelową komórką. Podobnie, rysunek E przedstawia liczbę zdarzeń synaptycznych na próbkowane miejsce odblokowania do zarejestrowanego neuronu.
Rysunek F pokazuje czas wystąpienia pierwszego wykrytego zdarzenia synaptycznego do zarejestrowanej komórki po stymulacji fotograficznej na pasku skali. Ciepłe kolory wskazują krótkie dane wejściowe, opóźnienie, a chłodniejsze kolory wskazują dłuższe opóźnienia synaptyczne. W ten sposób LSPS umożliwia konstruowanie szczegółowych map położenia, siły, opóźnienia i liczby sygnałów wejściowych oddziałujących na określone typy neuronów hamujących.
Cóż, biorąc udział w tej procedurze, ważne jest, aby uzbroić się w cierpliwość, zrobić czysty warunek eksperymentu, ale neuron skutecznie i bardzo ostrożnie, aby zmienić z dużego powiększenia obiektu na niską modyfikację. Potem ostatnie użycie oprogramowania lądowego bardzo dobrze.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza rozprawa prezentuje metodę mapowania i analizy lokalnych obwodów synaptycznych specyficznych neuronów kory hamujących przy użyciu skanowania laserowego fotostymulacji połączonej z całokomórkowymi rejestracjami u myszy transgenicznych ekspresjonujących GFP. Podejście to umożliwia szczegółowe badanie funkcjonalnej organizacji obwodów neuronalnych hamujących.
Kluczowe Elementy Badania
Dział Obszaru Nauki
- Nauka o neuronach
- Elektrofizjologia
- Obwody neuronalne
Tło
- Neurony hamujące odgrywają kluczową rolę w regulacji obwodów neuronalnych.
- Myszy transgeniczne ekspresjonujące GFP umożliwiają ukierunkowane badania specyficznych populacji neuronów.
- Zrozumienie lokalnych obwodów synaptycznych jest niezbędne do wyjaśnienia funkcji mózgu.
- Skanowanie laserowe fotostymulacji jest potężnym narzędziem do badania interakcji synaptycznych.
Cel Badania
- Zbadanie lokalnej funkcjonalnej organizacji obwodów neuronalnych hamujących.
- Mapowanie wejść synaptycznych do specyficznych neuronów hamujących.
- Wzmocnienie zrozumienia dynamiki synaptycznej w sieciach korowych.
Wykorzystane Metody
- Przygotowanie żywych plasterzy mózgu z kory somatosensorycznej pierwotnej myszy.
- Wizualizacja i rejestracja z ukierunkowanych komórek hamujących ekspresjonujących GFP.
- Skanowanie laserowe fotostymulacji w celu aktywacji neuronów przedsynaptycznych.
- Analiza danych w celu wygenerowania ilościowych map wejść synaptycznych.
Główne Wyniki
- Pomyślne mapowanie lokalnych obwodów synaptycznych w specyficznych neuronach hamujących.
- Ilościowa analiza wejść synaptycznych ujawniła wyraźne wzorce.
- Wykaźano skuteczność połączonej techniki w badaniu obwodów neuronalnych.
- Dostarczono wgląd w funkcjonalną organizację sieci hamujących.
Wnioski
- Metoda oferuje solidne podejście do badania obwodów hamujących w mózgu.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia interakcji synaptycznych u neuronów korowych.
- Tę technikę można zastosować do dalszego badania dynamiki obwodów neuronalnych.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Mapping inhibitory neuronal circuits provides mechanistic de-risking for target validation in CNS drug discovery by revealing functional synaptic organization. This approach supports predictive confidence in pathway modulation strategies and enables data-driven triage of therapeutic hypotheses. The technique enhances translational continuity from discovery through preclinical assessment of circuit-level drug effects.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping synaptic inputs to specific inhibitory neuron subtypes, clarifying pathway engagement.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative assessment of circuit-level target modulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing functional consequences of target inhibition on local network dynamics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining baseline synaptic input patterns.
- Reproducibility: Generates quantitative maps of synaptic inputs that enable standardized comparison across experimental conditions.
- Platform Utility: Supports scalable compound evaluation by providing circuit-level readouts of neuronal response.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Maps inhibitory circuits in disease-relevant systems to align with translational biomarker strategies.
- Preclinical Continuity: Connects discovery-phase circuit mapping to preclinical validation of network-level drug effects.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing compensatory or paradoxical circuit responses to target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing circuit-level functional readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping synaptic organization of inhibitory neurons.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible quantification of synaptic inputs to recorded neurons.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of synaptic strength, latency, and input number to facilitate condition comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling circuit-level assessment of drug effects in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for iterative circuit mapping across target classes and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic de-risking of circuit-level effects.
- Operational Value: Standardization and reproducibility of synaptic input mapping across laboratories and studies.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk from unanticipated circuit adaptations.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative circuit modulation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, laser scanning photostimulation, and transgenic mouse handling.
- Dependent on laser scanning photostimulation systems, electrophysiology rigs, and fluorescence microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of stimulation parameters, voltage-clamp settings, and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when applying to different cortical regions or disease models.
- Limited by tissue viability and the need for healthy brain slices to ensure reliable synaptic responses.
