Name: Mapowanie hamujących obwodów neuronalnych za pomocą fotostymulacji skaningowej laserowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Odkryj metodę mapowania hamujących obwodów neuronalnych za pomocą fotostymulacji laserowej skaningowej w myszach transgenicznych GFP. Technika ta umożliwia szczegółową analizę organizacji synaptycznej w korze mózgowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Tran Huynh, Andrew San Antonio oraz Jerry Lin za pomoc techniczną. Praca ta była finansowana z grantów National Institutes of Health DA023700 oraz DA023700-04S1 przyznanych X.X.

1. Przygotowanie skrawków mózgu
<ol>
 <li>Myszy transgeniczne są głęboko narkotyzowane pentobarbitalem sodu (&gt;100 mg/kg, ip), a następnie poddawane szybkiej dekapitacji, po czym ich mózgi są wyjmowane do zamrożonego i natlenionego roztworu do krojenia.</li>
 <li>W celu wizualnej weryfikacji ekspresji GFP w mózgu myszy stosuje się gogle do GFP.</li>
 <li>Przekroje pierwotnej kory somatosensorycznej o grubości 400 μm są wycinane wibratomem w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF) zawierającym sacharozę. Plasterki są najpierw inkubowane w ACSF z sacharozą przez 30 min do 1 h w temperaturze 32°C, a po początkowym okresie inkubacji przenoszone do ACSF do rejestracji w temperaturze pokojowej. Przez cały czas inkubacji i rejestracji plasterki są stale napowietrzane mieszanką 95% O2-5% CO2.</li>
</ol>
2. Uruchamianie sprzętu
Ogólna implementacja systemu została przedstawiona na Rysunku 1.
<ol>
 <li>Włącza się system chłodzenia lasera oraz zasilacz, przygotowując laser do pracy.</li>
 <li>Włącza się cały sprzęt związany z kontrolą fotostymulacji (w tym system luster skanujących, modulator optyczny, elektroniczną migawkę oraz wzmacniacz wejściowy fotodiody).</li>
 <li>Włącza się sprzęt elektrofizjologiczny (w tym wzmacniacz Multiclamp 700B i mikromanipulatory). Rejestracje elektrofizjologiczne, fotostymulacja oraz obrazowanie preparatów skrawków są przeprowadzane w komorze perfuzyjnej do skrawków zamontowanej na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu.</li>
 <li>Włącza się kamerę obrazującą (Retiga 2000, Q-imaging, Austin, TX). Skrawki są wizualizowane za pomocą mikroskopu pionowego (BW51X, Olympus) z wykorzystaniem kontrastu interferencyjnego różnicowego (DIC) w podczerwieni oraz optyki epifluorescencyjnej poprzez system obrazowania.</li>
 <li>Uruchamia się oprogramowanie EPHUS oparte na środowisku Matlab oraz oprogramowanie kamery Q-capture. Do sterowania protokołami fotostymulacji i pozyskiwania danych z fotostymulacji używana jest zmodyfikowana wersja oprogramowania Ephus (Ephus, dostępna pod adresem <a href="https://openwiki.janelia.org/">https://openwiki.janelia.org/</a>).</li>
 <li>Po uruchomieniu systemu należy sprawdzić, czy system fotostymulacji laserowej znajduje się w stanie roboczym. Ponieważ do dostarczania błysków UV w celu uwalniania glutaminianu (uncaging) używany jest obiektyw mikroskopowy 4x, pod nim można umieścić kawałek białego papieru, aby obserwować wzór skanowania lasera podczas pracy systemu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie perfuzji skrawków
<ol>
 <li>Włączony zostaje system perfuzji ciśnieniowej w celu doprowadzenia ACSF do rejestracji do komory z plastrem. Należy zadbać o utrzymanie stałego poziomu cieczy na wysokości 2,0 mm powyżej plastra w komorze.</li>
 <li>Aliquot roztworu stokowego MNI-caged-glutamate dodaje się do 25 ml krążącego ACSF, aby uzyskać stężenie 0,2 mM caged glutamate. Należy pamiętać, że po 5-6 h eksperymentu roztwór w kąpieli oraz MNI-glutamate zostaną wymienione na świeże.</li>
 <li>Plaster mózgu zostaje przeniesiony do komory rejestracyjnej. Można uruchomić system obrazowania, aby sprawdzić jakość plastra i anatomicznie zlokalizować pierwotny obszar somatosensoryczny. Następnie plaster zostaje zakotwiczony za pomocą wykonanego na zamówienie platynowego pierścienia ze sznurkiem. Należy uważać, aby nie umieścić kotwicy nad obszarem mózgu przeznaczonym do rejestracji.</li>
</ol>
4. Rejestracja metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell
<ol>
 <li>Elektrody szklane (oporność 4-6 MΩ) są wyciągane i wypełniane roztworem wewnętrznym zawierającym 0,1% biocytyny w celu znakowania komórek i identyfikacji morfologicznej.</li>
 <li>Aby przeprowadzić rejestrację metodą patch-clamp, komórki są wizualizowane przy użyciu obiektywu 60x. Typy komórek hamujących są najpierw identyfikowane i wybierane na podstawie wizualizacji ekspresji GFP pod mikroskopem Olympus w trybie DIC/fluorescencyjnym; następnie rejestracje są wykonywane pod kontrolą wizualną wspomaganą przez podczerwony monitoring wideo DIC. Należy pamiętać, że kilkukrotne przełączanie między trybem DIC a fluorescencyjnym jest niezbędne do potwierdzenia lokalizacji komórki GFP podczas zbliżania elektrody do komórki docelowej.</li>
 <li>Stosuje się konwencjonalne techniki patch-clamp. Elektrodę wypełnia się pod dodatnim ciśnieniem i przesuwa blisko powierzchni komórki, aby utworzyć wyraźne wgłębienie w membranie komórki docelowej; następnie szybko przykłada się ujemne ciśnienie, aby utworzyć gigaseal i dokonać przełamania błony (break-in), monitorując reakcje na wstrzykiwanie prądu na monitorze wideo.</li>
 <li>Po przełamaniu błony wykonuje się obrazy komórki przy powiększeniu 60x w trybach DIC i fluorescencyjnym w celu weryfikacji online. Przed zebraniem danych z fotostymulacji wstrzykuje się hiperpolaryzujące i depolaryzujące impulsy prądowe, aby zbadać podstawowe właściwości elektrofizjologiczne każdej komórki.</li>
 <li>Po uzyskaniu stabilnych rejestracji z całej komórki (whole-cell) przy dobrej oporności dostępowej (zazwyczaj &lt;20 MΩ), obiektyw mikroskopu jest zmieniany z 60x na 4x w celu przeprowadzenia fotostymulacji skanowania laserowego. Obraz skrawka przy powiększeniu 4x jest pozyskiwany i służy do naprowadzania oraz rejestrowania miejsc fotostymulacji.</li>
</ol>
5. Laserowa fotostymulacja skanująca
<ol>
 <li>Parametry fotostymulacji i akwizycji danych są ustawiane poprzez aktywację modułu przełącznika konfiguracji w systemie Ephus. Do mapowania fotostymulacji zazwyczaj stosuje się impuls lasera o czasie trwania 1 ms (20 mW) z odstępem między bodźcami wynoszącym 1 sekundę. Rejestrowane są ślady danych o długości 1 sekundy przy częstotliwości próbkowania 10 kHz.</li>
 <li>Obraz skrawka w powiększeniu 4x jest wczytywany do modułu mapowania systemu Ephus. Definiowana jest lokalizacja somy komórki, a wokół niej ustawiane są miejsca fotostymulacji w układzie 16x16 (odstępy 80 μm x 80 μm), obejmujące wszystkie warstwy kory.</li>
 <li>Profil pobudzenia zarejestrowanego neuronu jest mapowany poprzez analizę lokalizacji występowania potencjałów czynnościowych w odpowiedzi na fotostymulację w trybie clamp prądowy. Nasze przyjazne dla użytkownika oprogramowanie z funkcją wyświetlania w czasie rzeczywistym ułatwia przeprowadzanie eksperymentów z mapowaniem.</li>
 <li>Lokalne połączenia obwodów pobudzających są mapowane poprzez detekcję pobudzających prądów postsynaptycznych (EPSC) z rejestrowanej komórki podczas skanowania laserem w różnych lokalizacjach. W celu detekcji dośrodkowych prądów pobudzających, potencjał komórki jest utrzymywany na poziomie -70 mV w trybie clamp napięciowy. Mapy EPSC są powtarzane 2-3 razy przy obróconym lub odwróconym wzorze fotostymulacji.</li>
 <li>Opcjonalnie: Lokalne połączenia obwodów hamujących mogą być również mapowane poprzez detekcję hamujących prądów postsynaptycznych (IPSC) z rejestrowanej komórki utrzymywanej przy potencjale bliskim 0 mV w trybie clamp napięciowy w celu wykrycia odśrodkowych prądów hamujących. Należy pamiętać, że do mapowania IPSC najlepiej zastosować wewnętrzny roztwór elektrody, w którym potas zastąpiono cezem.</li>
 <li>Po zakończeniu wszystkich analiz fizjologicznych elektrodę ostrożnie usuwa się z rejestrowanej komórki. Skrawek mózgu jest wyjmowany i utrwalany w 4% paraformaldehydzie przez noc. Rejestrowane komórki są barwione przeciwko biocytynie. Morfologię komórek bada się za pomocą mikroskopii konfokalnej lub epifluorescencyjnej, co pozwala również potwierdzić, że każda rejestrowana komórka jest rzeczywiście docelowym interneuronem wykazującym ekspresję GFP.</li>
</ol>
6. Analiza danych fotostymulacji
Nasza nowo opracowana metodologia oraz implementacja oprogramowania11 zostały zastosowane do detekcji i pomiaru zdarzeń synaptycznych wywołanych fotostymulacją w surowych mapach danych. Jak pokazano na Rysunku 2, skonstruowano mapy z kodowaniem kolorystycznym, aby zilustrować wzorzec wejścia synaptycznego do rejestrowanego neuronu.
7. Reprezentatywne wyniki:
Przykładowe wyniki rejestracji elektrofizjologicznej i mapowania fotostymulacyjnego przedstawiono na rysunku 2. Celowane rejestracje specyficznych typów komórek hamujących są możliwe dzięki zastosowaniu myszy transgenicznych wykazujących ekspresję GFP w znanych typach komórek hamujących. Ze względu na różnorodność interneuronów hamujących, analizy ekspresji GFP, wrodzonej elektrofizjologii oraz charakterystyki morfologicznej (rysunek 2A) są łączone w celu dokonania ostatecznej klasyfikacji typu komórki. Rysunki 2B-C ilustrują, że fotostymulacja skanująca laserowo pozwala na szerokie mapowanie połączeń lokalnych obwodów korowych z pojedynczymi neuronami hamującymi. Surowa mapa danych przedstawiona jest na rysunku 2C. Odpowiedzi na bezpośrednie odblokowanie klatek (uncaging) są wykluczone z analizy danych (rysunek 2C). Ilościowe mapy wejść są zakodowane kolorami, przedstawiono je na rysunkach 2D-F. Przykładowe szybko strzelające (fast-spiking) interneurony hamujące otrzymywały silne pobudzające wejścia synaptyczne (EPSCs) z warstwy 4 oraz warstw głębszych. Poprzez powiązanie organizacji wejść synaptycznych komórki z określonymi szlakami korowymi, jesteśmy w stanie wywnioskować jej możliwą rolę (np. hamowanie zwrotne i wyprzedzające) w przetwarzaniu informacji w korze mózgowej.
<img alt="Układ lasera UV do skanowania laserowego fotostymulacji i elektrofizjologii; schemat szczegółowo przedstawiający optykę." src="/files/ftp_upload/3109/3109fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ogólna instrumentacja systemu do skanowania laserowego fotostymulacji. Nasz kompletny system składa się z układów sterowania fotostymulacją, obrazowania wideo oraz rejestracji elektrofizjologicznej. Przyjęliśmy projekt systemu LSPS opisany wcześniej7,17. Jednostka laserowa jest wykorzystywana do generowania lasera UV o długości fali 355 nm w celu odblokowania glutaminianu (uncaging). Wiązka lasera jest kierowana przez tor optyczny naszego systemu. Krótkie czasy trwania błysków lasera (np. 1- 3 ms) są kontrolowane za pomocą modulatora elektrooptycznego (tj. komórki Pockelsa) oraz migawki mechanicznej. Moc wiązki lasera jest modulowana przez koło gradientowe filtrów neutralnych i monitorowana poprzez skierowanie niewielkiej części wiązki lasera za pomocą szkiełka podstawowego do fotodiody. System skanowania laserowego obejmuje parę luster skanujących X-Y, soczewkę skanującą, soczewkę tubusową oraz obiektyw. Lustra kierują wiązkę lasera przez soczewkę skanującą; następnie wiązka wpada do mikroskopu poprzez lustro dichroiczne i jest ogniskowana przez specjalnie wykonaną, przepuszczającą UV soczewkę tubusową. Wiązka nie wypełnia całkowicie tylnej apertury obiektywu mikroskopu, aby zapewnić bardziej kolumnowy (w przeciwieństwie do stożkowego) strumień oświetlający, utrzymując mapowanie w stopniu możliwie najbardziej dwuwymiarowym poprzez zmniejszenie rozdzielczości osiowej. Pod obiektywem 4x wiązka lasera tworzy plamki odblokowania, z których każda ma profil zbliżony do rozkładu Gaussa o szerokości bocznej 153 μm w płaszczyźnie ogniskowej (patrz wstawka). Różne pozycje stymulacji laserowej można uzyskać za pomocą luster skanujących XY sterowanych galwanometrami, ponieważ lustra i tylna apertura obiektywu znajdują się w płaszczyznach sprzężonych, co przekłada pozycje luster na różne lokalizacje skanowania w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Podczas procesu odblokowania zmienna liczba wzorowanych punktów pokrywających całe pole jest stymulowana sekwencyjnie w kolejności nierasterowej i nierandomowej, aby uniknąć ponownego odwiedzania sąsiedztwa niedawno stymulowanych miejsc. Szczegółowe informacje znajdują się w pracy Xu et al. (2010).
<img alt="Eksperyment elektrofizjologiczny przedstawiający diagramy amplitudy, liczby i latencji EPSC wraz z mapowaniem neuronów." src="/files/ftp_upload/3109/3109fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Mapowanie połączeń lokalnego obwodu pobudzającego do ekspresującego GFP szybkokluczącego interneuronu w warstwie 4 pierwotnej kory sensorycznej myszy. A1 i A2 przedstawiają obrazy DIC oraz fluorescencyjne GFP komórki docelowej pod obiektywem 60x w żywym skrawku mózgu, natomiast A3 pokazuje morfologię komórki ujawnioną przez barwienie biocytyną w utrwalonym skrawku po rejestracji. A4 przedstawia wzorce wyładowań rejestrowanej komórki GFP, charakterystyczne dla szybkokluczącego interneuronu hamującego, w odpowiedzi na wewnątrzsomatyczne wstrzyknięcia prądów o różnej sile. B przedstawia obraz skrawka z nałożonymi 16 x 16 miejscami fotostymulacji (*). Lokalizacja komórki jest wskazana małym czerwonym kółkiem. C przedstawia zestaw śladów odpowiedzi wywołanych fotostymulacją z lokalizacji stymulacji pokazanych w B, podczas gdy komórka była utrzymywana przy -70 mV w celu wykrycia dopływowych prądów pobudzających. Różne formy odpowiedzi na fotostymulację są zilustrowane śladami w lokalizacjach 1 i 2, które zostały powiększone i pokazane osobno w insertcie. Ślad 1 jest przykładem bezpośrednich odpowiedzi (wskazanych czerwonymi grotami strzałek) na odblokowanie glutaminianu w ciele komórki i dendrytach proksymalnych. Pozostałe ślady w 2 są typowymi przykładami odpowiedzi na pobudzające wejścia synaptyczne (niebieskie). Odpowiedzi bezpośrednie i wejścia synaptyczne można odróżnić po ich amplitudach i latencjach odpowiedzi. D, E i F to odpowiednio mapy kodowane kolorami (16x16 miejsc) średniej amplitudy EPSC, liczby EPSC oraz latencji pierwszego wykrytego EPSC na miejsce, dla mapy surowych danych przedstawionej w C. Średnia amplituda wejścia z każdego miejsca stymulacji jest średnią amplitudą EPSC w oknie analizy, z odjętą od odpowiedzi na fotostymulację z tego samego miejsca bazową odpowiedzią spontaniczną. Zmierzono i naniesiono również liczbę EPSC oraz czas dotarcia lub latencję pierwszego wykrytego EPSC na miejsce. Więcej szczegółów znajduje się w publikacji (Shi et al., 2010).

<ol><li>Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Petilla+terminology%3A+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature. 9, 557-568 (2008).</li>
<li>Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nature. 5, 793-807 (2004).</li>
<li>Xu, X., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+specificity+of+functional+input+to+distinct+types+of+inhibitory+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 70-85 (2009).</li>
<li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+characterization+of+inhibitory+mouse+cortical+neurons%3A+three+chemically+distinct+classes+of+inhibitory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells.</a> J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).</li>
<li>Dantzker, J. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+sources+of+synaptic+input+to+cortical+inhibitory+interneurons+and+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 3, 701-707 (2000).</li>
<li>Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-scale+specificity+of+cortical+networks+depends+on+inhibitory+cell+type+and+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity.</a> Nat Neurosci. 8, 1552-1559 (2005).</li>
<li>Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+analysis+of+experience-dependent+plasticity+in+the+developing+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex.</a> Neuron. 38, 277-289 (2003).</li>
<li>Weiler, N., Wood, L., Yu, J., Solla, S. A., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+laminar+organization+of+the+excitatory+network+in+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Top-down laminar organization of the excitatory network in motor cortex.</a> Nat Neurosci. 11, 360-366 (2008).</li>
<li>Xu, X., Olivas, N. D., Levi, R., Ikrar, T., Nenadic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+and+fast+functional+mapping+of+cortical+circuitry+through+a+combination+of+voltage+sensitive+dye+imaging+and+laser+scanning+photostimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">High precision and fast functional mapping of cortical circuitry through a combination of voltage sensitive dye imaging and laser scanning photostimulation.</a> J Neurophysiol. 103, 2301-2312 (2010).</li>
<li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cortical+inhibitory+neuron+type+that+coexpresses+somatostatin+and+calretinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mouse cortical inhibitory neuron type that coexpresses somatostatin and calretinin.</a> J Comp Neurol. 499, 144-160 (2006).</li>
<li>Shi, Y., Nenadic, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+use+of+matched+filtering+for+synaptic+event+detection+and+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel use of matched filtering for synaptic event detection and extraction.</a> PLoS ONE. 5, e15517-e15517 (2010).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).</li>
<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li>
<li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driving+fast-spiking+cells+induces+gamma+rhythm+and+controls+sensory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses.</a> Nature. 459, 663-667 (2009).</li>
<li>Shepherd, G. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+and+columnar+organization+of+ascending+excitatory+projections+to+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+in+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex.</a> J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Techniki mapowania oparte na fotostymulacji są skutecznie stosowane do analizy obwodów korowych. Skaningowa fotostymulacja laserowa w połączeniu z rejestracją z całego komórki (whole-cell recording) umożliwia wysokorozdzielcze mapowanie laminarnych rozkładów presynaptycznych źródeł wejść do pojedynczych neuronów, ponieważ jednoczesna rejestracja z neuronu postsynaptycznego wraz z fotostymulacją skupisk neuronów presynaptycznych w wielu różnych lokalizacjach dostarcza ilościowych pomiarów przestrzennego rozkładu wejść pob...

<table><tbody><tr><td>transgeniczne linie myszy</td><td>Laboratorium Jacksona lub inne źródła</td><td></td><td>Należy odnieść się do pracy Xu i Callaway (2009)</td></tr><tr><td>gogle do detekcji GFP</td><td>BLS Ltd., Węgry</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wibratom</td><td>Leica Systems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>MNI klatkowany glutaminian (4-metoksy-7-nitroindolinylowo klatkowany L-glutaminian)</td><td>Tocris Bioscience, Ellisville, MO</td><td>Nr kat. 1490</td><td></td></tr><tr><td>biocytyna</td><td></td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>wyciągacz elektrod</td><td>Sutter Instrument, Novato, CA</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>rurki szklane do wytwarzania elektrod</td><td></td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz Multiclamp 700B</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>cyfrowa kamera CCD</td><td>Q-imaging, Austin, TX</td><td>Retiga 2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop badawczy</td><td>Olympus, Tokio, Japonia</td><td>BW51X</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie laserowe UV</td><td>DPSS Lasers, Santa Clara, CA</td><td>model 3501</td><td></td></tr><tr><td>Inne wyposażenie do laserowej fotostymulacji skanującej</td><td></td><td></td><td>Proszę odnieść się do Xu &lt;em&gt;i wsp.&lt;/em&gt; (2010)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Roztwory:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;µl&gt;&lt;li&gt;Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) zawierający sacharozę do wycinania skrawków (w mM: 85 NaCl, 75 sacharozy, 2,5 KCl, 25 glukozy, 1,25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 4 MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0,5 CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;oraz 24 NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;).&lt;/li&gt;&lt;li&gt;ACSF do rejestracji (w mM: 126 NaCl, 2,5 KCl, 26 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 2 CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2 MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1,25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, oraz 10 glukozy)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Wewnętrzny roztwór elektrody (w mM: 126 glukonianu K, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Na i 10 fosfokreatyny; pH 7,2, 300 mOsm).&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

mapowanie hamujących obwodów neuronalnych za pomocą fotostymulacji skanującej laserowo

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Neurony hamujące są kluczowe dla funkcjonowania kory mózgowej. Stanowią one około 20% całej populacji neuronów korowych i mogą być dalej podzielone na różnorodne podtypy w zależności od ich właściwości immunochemicznych, morfologicznych i fizjologicznych1-4. Chociaż poprzednie badania ujawniły wiele na temat właściwości wewnętrznych poszczególnych typów neuronów hamujących, wiedza na temat ich lokalnych połączeń w obrębie obwodów jest wciąż stosunkowo ograniczona3,5,6. Biorąc pod uwagę, że funkcja każdego pojedynczego neuronu jest kształtowana przez pobudzające i hamujące wejścia synaptyczne w obrębie obwodów korowych, wykorzystujemy fotostymulację skanującą laserem (LSPS) do mapowania lokalnych połączeń obwodowych z konkretnymi typami komórek hamujących. W porównaniu z konwencjonalną stymulacją elektryczną lub stymulacją poprzez podawanie glutaminianu (puff stimulation), LSPS oferuje unikalne zalety, umożliwiając szerokie mapowanie i ilościową analizę lokalnych wejść funkcjonalnych do pojedynczo rejestrowanych neuronów3,7-9. Fotostymulacja laserowa poprzez uwalnianie glutaminianu z klatek (uncaging) selektywnie aktywuje neurony perisomatycznie, bez aktywacji aksonów przechodzących lub dystalnych dendrytów, co zapewnia rozdzielczość mapowania poniżej poziomu warstw. Czułość i wydajność LSPS w mapowaniu wejść z wielu miejsc stymulacji w dużym obszarze są bardzo dobrze dostosowane do analizy obwodów korowych.
W niniejszej pracy przedstawiamy technikę LSPS połączoną z metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell do mapowania lokalnych obwodów hamujących. Celowane rejestracje specyficznych typów komórek hamujących są ułatwione dzięki zastosowaniu myszy transgenicznych wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) w ograniczonych populacjach neuronów hamujących w korze3,10, co umożliwia spójne próbkowanie docelowych typów komórek oraz jednoznaczną identyfikację rejestrowanych typów komórek. W odniesieniu do mapowania LSPS, opisujemy instrumentację systemu, przedstawiamy procedurę eksperymentalną i pozyskiwanie danych oraz prezentujemy przykłady mapowania obwodów w pierwotnej korze somatosensorycznej myszy. Jak pokazano w naszych eksperymentach, klatkowany glutaminian jest aktywowany w przestrzennie ograniczonym regionie skrawka mózgu za pomocą fotolizy laserem UV; jednoczesne rejestracje w konfiguracji voltage-clamp pozwalają na wykrycie odpowiedzi synaptycznych wywołanych fotostymulacją. Mapy wejść synaptycznych pobudzających lub hamujących do docelowego neuronu są generowane poprzez skanowanie wiązką lasera w celu stymulacji setek potencjalnych miejsc presynaptycznych. W ten sposób LSPS umożliwia konstrukcję szczegółowych map wejść synaptycznych wpływających na specyficzne typy neuronów hamujących poprzez powtarzane eksperymenty. Podsumowując, technika oparta na fotostymulacji oferuje naukowcom zajmującym się neuronaukami potężne narzędzie do określania organizacji funkcjonalnej lokalnych obwodów korowych.

Niniejszy artykuł przedstawia podejście łączące fotostymulację za pomocą skanowania laserowego z rejestracją z całej komórki u myszy transgenicznych wykazujących ekspresję GFP w ograniczonych populacjach neuronów hamujących. Technika ta umożliwia szerokie mapowanie i analizę ilościową lokalnych obwodów synaptycznych specyficznych hamujących neuronów kory mózgowej.

Mapowanie hamujących obwodów neuronalnych za pomocą fotostymulacji skanującej laserowo

Neurony hamujące są kluczowe dla funkcjonowania kory mózgowej. Stanowią one około 20% całej populacji neuronów kory i mogą zostać dalej podzielone na ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie lokalnej organizacji funkcjonalnej hamujących obwodów neuronalnych. Procedura rozpoczyna się od przygotowania żywych skrawków mózgu z pierwotnej kory somatosensorycznej myszy. Kolejnym krokiem jest wizualizacja oraz rejestracja aktywności wybranych, ekspresujących GFP typów komórek hamujących w skrawku mózgu.Po przeprowadzeniu fotostymulacji za pomocą skanowania laserowego z wykorzystaniem glutaminianu, stosuje się uwalnianie z klatek (uncaging), aby aktywować niewielkie grupy neuronów presynaptycznych jako pobudzające lub hamujące. Prądy postsynaptyczne są rejestrowane w interneuronach wykazujących ekspresję GFP. Ostatnim etapem jest przeprowadzenie fotostymulacji, analiza danych oraz wygenerowanie ilościowych map wkładu synaptycznego do rejestrowanych neuronów.W ostateczności, fotostymulacja za pomocą skanowania laserowego w połączeniu z rejestracją z całej komórki umożliwia konstruowanie szczegółowych map wejść synaptycznych do konkretnych typów neuronów hamujących, co może pozwolić na określenie organizacji i funkcji lokalnych hamujących obwodów korowych. Technika oparta na fotostymulacji została zapoczątkowana przez dr. Larry'eg

mapping-inhibitory-neuronal-circuits-laser-scanning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Odwzorowanie inhibitorowych obwodów neuronowych za pomocą skaningowej stymulacji świetlnej laserowej

Ten film demonstruje hamowanie pobudzających prądów synaptycznych za pośrednictwem mikroRNA w wycinkach mózgu myszy w hipokampie. Neurony CA3 zostały zainfekowane rekombinowanym wektorem wirusowym zawierającym konstrukt do ekspresji fluorescencyjnego reportera, aktywowany światłem kanał błonowy i mikroRNA, który obniża ekspresję kanałów wapniowych bramkowanych napięciem. Po umieszczeniu wycinka w komorze rejestracyjnej i załataniu neuronu CA1 za pomocą pipety rejestrującej, impulsy świetlne...

Hamowanie pobudzających prądów postsynaptycznych za pośrednictwem mikroRNA w mysich wycinkach hipokampa

Ten film demonstruje procedurę analizy połączeń synaptycznych między przyśrodkową korą przedczołową (mPFC) a neuronami ciała migdałowatego za pomocą ostrych wycinków mózgu ciała migdałowatego od myszy. Neurony mPFC u tych myszy wyrażają rodopsynę kanałową połączoną z białkiem fluorescencyjnym. Rodopsyny kanałowe ułatwiają napływ jonów i generowanie potencjału czynnościowego w neuronach mPFC po aktywacji światłem. W konsekwencji neurony mPFC uwalniają neuroprzekaźniki, które wiążą się z...

Wizualizacja i mapowanie ścieżek neuronalnych w wycinku mózgu ciała migdałowatego

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Podejścia optogenetyczne są powszechnie używane do manipulowania aktywnością neuronalną i oceny konsekwencji dla funkcjonowania mózgu. W tym miejscu przedstawiono technikę, która po ekspresji in vivo aktywatora optycznego rodopsyny kanałowej pozwala na analizę ex vivo właściwości synaptycznych określonych połączeń neuronalnych dalekiego zasięgu i lokalnych połączeń nerwowych w obwodach związanych ze strachem.

Ex vivo Optogenetyczna analiza obwodów strachu w wycinkach mózgu

Ten protokół dostarcza przepływ pracy, jak połączyć sztuczną interferencję RNA za pośrednictwem mikroRNA z optogenetyką, aby stymulować specyficznie presynaptyczne butony ze zmniejszoną ekspresją selektywnych genów w nienaruszonych obwodach neuronalnych.

Połączenie optogenetyki ze sztucznymi mikroRNA w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych

Tutaj prezentujemy protokół do ablacji genetycznie znakowanej subpopulacji neuronów za pomocą dwufotonowego lasera z larw danio pręgowanego.

Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej u larw danio pręgowanego

Ten protokół opisuje zestaw metod do identyfikacji specyficznej dla typu komórki funkcjonalnej łączności sygnałów dalekiego zasięgu z odległych obszarów mózgu za pomocą stymulacji optogenetycznej w wycinkach mózgu ex vivo.

Wewnątrzmózgowe zastrzyki stereotaktyczne in vivo do optogenetycznej stymulacji sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu myszy

Zgodnie z obecną implementacją, optogenetyka u naczelnych wymaga wstrzyknięcia wektorów wirusowych do mózgu. Optymalna metoda iniekcji powinna być niezawodna i, w przypadku wielu zastosowań, zdolna do celowania w pojedyncze miejsca o dowolnej głębokości, które można łatwo i jednoznacznie zidentyfikować w histologii pośmiertnej. Przedstawiono metodę iniekcji o tych właściwościach.

Wstrzyknięcia wektorów AAV do optogenetyki w znieczulonym i przytomnym, zachowującym się mózgu naczelnych innych niż człowiek

Opisane tutaj metody opisują procedurę używaną do optogenetycznie odwracającej plastyczności wywołanej przez kokainę w behawioralnie istotnym obwodzie u szczurów. Utrzymująca się stymulacja optyczna synaps wzgórzowo-migdałowatych o niskiej częstotliwości wywołuje długotrwałą depresję (LTD). Indukowane optogenetycznie LTD in vivo u szczurów doświadczonych z kokainą skutkowało późniejszym osłabieniem poszukiwania narkotyków motywowanego sygnałem.

Wykorzystanie optogenetyki do odwrócenia neuroplastyczności i zahamowania poszukiwania kokainy u szczurów

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

Odkryj metodę mapowania hamujących obwodów neuronalnych za pomocą fotostymulacji laserowej skaningowej w myszach transgenicznych GFP. Technika ta umożliwia szczegółową analizę organizacji synaptycznej w korze mózgowej.

Mapowanie hamujących obwodów neuronalnych za pomocą fotostymulacji skanującej laserowo

Przeglądaj więcej filmów