Izolacja ludzkich limfocytów T, hodowla i analiza migracji in vitro

Migracja limfocytów T następuje podczas naprowadzania do narządów limfatycznych, wyjścia z naczyń krwionośnych i wnikania do tkanek obwodowych. Proces ten polega na adhezyjnym oddziaływaniu powierzchni limfocytów T z innymi komórkami. Aby zbadać to zjawisko, ludzkie limfocyty T in vitro są izolowane, hodowane i umieszczane na płytkach do hodowli tkankowych pokrytych białkiem adhezyjnym.

ICAM jeden i chemokine SDF jeden. Następnie można pozyskać i przeanalizować obrazy migracji limfocytów T. Cześć, nazywam się Craig LeFort i pracuję w laboratorium Minsu Kima w Centrum Biologii i Immunologii Szczepionek na Uniwersytecie w Rochester.

Dzisiaj pokażemy Wam procedurę izolacji i hodowli ludzkich limfocytów nastoletnich, analizę ich migracji in vitro. Używamy tego testu w naszym laboratorium do badania roli integryn i migracji limfocytów T. Główną integryną w limfocytach T jest antygen jeden związany z funkcją limfocytów lub LFA.

Specyficznymi ligandami dla LFA są ICA, takie jak ICAM. Ponadto do migracji limfocytów T wymagany jest sygnał krewniaczy, który zapewnia zarówno sygnał kierunkowości, jak i aktywację integryn. W naszym teście używamy ludzkiego ICAM one i CX CL 12 lub SDF one jako substratów do migracji limfocytów T.

Więc zacznijmy. Po uzyskaniu krwi ludzkiej od zdrowego dawcy pozwól krwi ostygnąć do temperatury pokojowej. Zajmuje to około 30 minut.

Po schłodzeniu krwi delikatnie odpipetuj trzy mililitry pożywki o temperaturze pokojowej i gradientu gęstości polimorficznej do ośmiomililitrowej rurki z polistyrenu o okrągłym dnie. Następnie delikatnie dodaj trzy mililitry pełnej krwi na wierzch. Ważne jest, aby unikać mieszania.

Umieść probówki w wirówce i obracaj je 500 G przez 45 minut. W temperaturze pokojowej po odwirowaniu jednojądrzaste komórki krwi obwodowej lub P BMC zostały oddzielone od innych składników krwi. Warstwa PBMC pojawia się jako pierwsze zachmurzone pasmo od góry.

W sterylnych warunkach ostrożnie usuń i wyrzuć przezroczystą żółtą górną fazę. Następnie za pomocą mikropipety P 1000 przenieś warstwę PBMC do nowej stożkowej probówki. Przemyć PBMC dwukrotnie komorami wirówkowymi PBS o stężeniu 500 G przez pięć minut.

Za każdym razem supernatant będzie nieco mętny Po każdym praniu. Ponownie zawieś komórki w 20 mililitrach pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS, 1% streptomycyny penicyliny i jeden mikrogram na mililitr. Fitohemaglutynina lub inkubacja PHA w obecności PHA indukuje aktywację i ekspansję limfocytów T.

Za pomocą pipety przenieść pbmc do kolby hodowlanej T 75. Następnie inkubowany w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez jedną do 24 godzin. Ten etap pozwala na oddzielenie monocytów, które będą przylegać do powierzchni kolby, od limfocytów, które pozostają w zawiesinie.

Po inkubacji ostrożnie usuń wszystkie pożywki, które zawierają głównie limfocyty i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Wirować przy 500 G przez pięć minut. Reese był osadem komórkowym w RPMI 1640 i przeniósł komórki do nowego flaza T 75 zawierającego 25 mililitrów RPMI 1640 z FBS, penicyliną, streptomycyną i PHA inkubowanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 24 godzinach wzrostu może być konieczne dodanie od 15 do 20 mililitrów świeżej pożywki i przeniesienie do większej kolby T 1 75. Kontynuuj inkubację przez trzy dni lub dwa dni. Jeśli początkowa inkubacja PBMC nastąpiła przez noc po trzech dniach, użyj pipety, aby usunąć pożywkę, która będzie zawierać zawieszone limfocyty i przenieś ją do 50-mililitrowej wirówki stożkowej o stężeniu 500 G na pięć minut.

Reese był granulką ogniw i przeniósł ogniwa do nowego T 75 zawierającego 25 mililitrów RPMI 1640. W przypadku FBS, penicyliny, streptomycyny i ludzkiej IL two lub IL 15 należy umieścić komórki w inkubatorze. W przypadku uruchomienia kolby T 75 kultura będzie musiała zostać rozszerzona i przeniesiona do kolby T 1 75.

Po jednym do dwóch dni rosną limfocyty w sumie przez cztery do siedmiu dni. Na dzień przed testem migracji pokryj szklane naczynie o grubości 0,17 milimetra 20 mikrogramami na mililitr białka A lub G w PBS, inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia. Dokładnie umyj naczynie PBS, a następnie dodaj do naczynia ICAM one FC i ludzki SD F1 w roztworze PBS.

Inkubować przez cztery godziny w temperaturze pokojowej, aby unieruchomić cząsteczki. Określ gęstość hodowanych komórek za pomocą hemocytometru. Następnie przemyć limfocyty dwukrotnie PBS i ponownie zawiesić je w jednym mililitrze pożywki L 15 zawierającej glukozę D po inkubacji, umyć powlekane naczynie ICAM jednym FC i SDF jednym intensywnie za pomocą PBS, przenieść limfocyty T w jednym mililitrze pożywki do naczynia, około dwa do pięciu razy 10 do piątej komórki należy użyć na naczynie, aby uzyskać gęstość komórek odpowiednią do analizy migracji.

Aby uzyskać obrazy migracji komórek, umieść naczynie na stoliku mikroskopu w środowisku o kontrolowanej temperaturze, takim jak podgrzewana komora o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Otwórz oprogramowanie NIS Elements w menu ustawień obrazu. Wybierz binowanie dwa na dwa jako tryb zarówno dla obrazowania na żywo, jak i przechwytywania obrazu.

Przejdź do menu aplikacji i wybierz, zdefiniuj, uruchom, eksperymentuj. Wybierz czas między obrazami i czas całkowity. W przypadku sekwencji przechwytywania obrazu naciśnij przycisk uruchom, aby rozpocząć akwizycję obrazu po akwizycji.

Parametry migracji, takie jak prędkość, długość ścieżki i przemieszczenie, można określić ilościowo za pomocą pakietu oprogramowania, takiego jak Image J, Auto Quant lub veloc. Aby wygenerować wykres pajęczyny, zbierz współrzędne XY dla każdej komórki i punktu czasowego, a następnie rzutuj je na wykres ze wspólnym punktem początkowym dla każdej komórki w punkcie początkowym. Pokazane tutaj limfocyty T zostały wyhodowane, posiane na ICAM i SDF i obrazowane co 10 sekund przez 30 minut.

Ten film pokazuje losową migrację limfocytów T z prędkością około 15 mikronów na minutę przy użyciu współrzędnych XYT dla każdej komórki. 15 komórek wybrano losowo i wykreślono ze wspólnym punktem początkowym w punkcie początkowym. Porównanie wykresów pajęczyn daje szybki wizualny obraz różnic w migracji między różnymi warunkami eksperymentalnymi.

Wykresy migracji limfocytów T w warunkach kontrolnych pokazano po lewej stronie, natomiast wykresy migracji limfocytów T w obecności przeciwciała blokującego jeden ligand anty LFA pokazano po prawej stronie. Dane te pokazują, że limfocyty T wykorzystują integrynę LFA do migracji na jednym substracie ICAM. Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać test migracji przy użyciu hodowanych ludzkich limfocytów T podczas zabiegu.

Ważne jest, aby pamiętać o dodaniu odpowiedniej liczby komórek do jednego powlekanego naczynia ICAM, aby uprościć śledzenie komórek i analizę migracji. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.