Name: Izolacja ludzkich limfocytów T, hodowla i analiza migracji in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli ludzkich limfocytów T oraz analizy ich migracji in vitro przy użyciu białek adhezyjnych i chemokin. Protokół ten umożliwia badanie dynamiki komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Projekt ten był wspierany przez granty National Institutes of Health HL087088 (M.K.) oraz HL18208 (M.K.).

1. Izolacja ludzkich limfocytów T
<ol>
 <li>Pobrać krew ludzką od zdrowego dawcy. Przed przejściem do następnego etapu odczekać, aż krew osiągnie temperaturę pokojową (~30 min).</li>
 <li>Do 8 mL polistyrenowej probówki z zaokrąglonym dnem delikatnie nalać 3 mL medium do gradientu gęstości Polymorph o temperaturze pokojowej. Na wierzch medium Polymorph delikatnie nalać 3 mL krwi pełnej. Ważne jest, aby uniknąć wymieszania obu odczynników.</li>
 <li>Wirować probówki z prędkością 500 x g przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Po wirowaniu mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC) oddzieliły się od pozostałych składników krwi, tworząc górną warstwę komórkową. Warstwa PBMC widoczna jest jako pierwszy mętny prążek, licząc od góry.</li>
 <li>Ostrożnie usunąć przejrzystą, żółtą fazę górną krwi znajdującą się nad warstwą PBMC, a następnie za pomocą mikropipety P1000 przenieść warstwę PBMC do stożkowej probówki o pojemności 15 mL lub 50 mL.</li>
 <li>Przemyć PBMC dwukrotnie roztworem PBS, wirować komórki z prędkością 500 x g przez 5 minut podczas każdego etapu. Nadkrawkowa ciecz po każdym przemyciu będzie lekko mętna.</li>
</ol>
2. Hodowla ludzkich limfocytów T
<ol>
 <li>Za pomocą pipety przenieść PBMC do kolby hodowlanej T-75 zawierającej 20 mL pożywki RPMI 1640 z dodatkiem 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny oraz 1 μg/mL fitohemaglutyniny (PHA).</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę, maksymalnie do 24 godzin. Ten etap pozwala na oddzielenie monocytów, które przylegają do powierzchni kolby, od limfocytów pozostających w zawiesinie. W przypadku zastosowania krótkiej inkubacji (1 godzina) na tym etapie, dopuszczalne jest użycie pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny bez dodatku PHA określonego w kroku 2.1.</li>
 <li>Ostrożnie usunąć całą pożywkę z kolby, przenieść ją do stożkowej probówki 50 mL i wirować przy 500 x g przez 5 minut.</li>
 <li>Resuspender osad komórkowy, który składa się obecnie głównie z limfocytów, i przenieść komórki do nowej kolby T-75 zawierającej 25 mL pożywki RPMI 1640 z dodatkiem 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny oraz 1 μg/mL PHA.</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 37°C przez 3 dni (2 dni, jeśli początkowa inkubacja PBMC trwała całą noc). Po 24 godzinach wzrostu może być konieczne dodanie 15-20 mL świeżej pożywki i przeniesienie hodowli do większej kolby T-175.</li>
 <li>Po 3 dniach za pomocą pipety usunąć pożywkę wraz z zawiesiną limfocytów z kolby i przenieść je do stożkowej probówki 50 mL. Wirować przy 500 x g przez 5 minut.</li>
 <li>Resuspender osad komórkowy i przenieść komórki do nowej kolby T-75 lub T-175 zawierającej odpowiednio 25 mL (T-75) lub 50 mL (T-175) pożywki RPMI 1640 z dodatkiem 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny oraz 20 ng/mL ludzkiej IL-2 lub IL-15.</li>
 <li>Hodować limfocyty przez 4-7 dni. W przypadku rozpoczęcia hodowli w kolbie T-75, po 1-2 dniach konieczne będzie rozszerzenie hodowli i przeniesienie jej do kolby T-175.</li>
</ol>
3. Test migracji limfocytów in vitro
<ol>
 <li>Na jeden dzień przed testem migracji pokryć szalkę z szklanym dnem 0,17 mm 20 μg/mL Protein A lub G w PBS, inkubując przez noc w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Szalkę dokładnie przemyć PBS.</li>
 <li>Unieruchomić ludzkie ICAM-1/Fc (10 μg/mL) oraz ludzkie SDF-1 (2 μg/mL), dodając te odczynniki w roztworze PBS do szalki i inkubując przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotować limfocyty T, najpierw określając gęstość komórek w hodowli w kolbie T-175 za pomocą hemacytometru. Aby uzyskać gęstość komórek odpowiednią do analizy migracji, na jedną szalkę należy użyć około 2-5 x 105 komórek.</li>
 <li>Limfocyty T przemyć dwukrotnie PBS, a następnie resuspender w 1 mL pożywki L-15 zawierającej 1 mg/mL D-glukozy.</li>
 <li>Szalkę pokrytą ICAM-1/Fc i SDF-1 dokładnie przemyć PBS.</li>
 <li>Przenieść limfocyty T w 1 mL pożywki do szalki i utrzymywać je w temperaturze 37°C.</li>
</ol>
4. Rejestrowanie sekwencji obrazów za pomocą oprogramowania NIS Elements
<ol>
 <li>Otwórz oprogramowanie NIS Elements.</li>
 <li>W menu ustawień kamery wybierz „2x2 binning” jako tryb zarówno dla obrazowania na żywo, jak i dla rejestracji obrazów.</li>
 <li>Przejdź do menu Applications i wybierz Define/Run Experiment.</li>
 <li>Określ odstępy czasowe między obrazami oraz całkowity czas trwania sekwencji rejestracji obrazów.</li>
 <li>Naciśnij przycisk „Run”, aby rozpocząć akwizycję obrazów.</li>
 <li>Komórki można śledzić, a parametry migracji (prędkość, długość ścieżki, przemieszczenie itp.) kwantyfikować przy użyciu jednego z kilku pakietów oprogramowania, takich jak ImageJ, AutoQuant lub Volocity (Rysunek 1).</li>
 <li>Aby wygenerować wykres typu „spider web plot”, zbiera się współrzędne x-y dla każdej komórki i punktu czasowego (Rysunek 2), a następnie rzutuje się je na wykres ze wspólnym punktem startowym dla każdej komórki w początku układu współrzędnych (Rysunek 3).</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
W 6. dniu hodowli w obecności IL-2 lub IL-15 limfocyty T stanowią &gt;98% komórek, co określono na podstawie pozytywnego barwienia na CD3 oraz pozytywnego barwienia na CD4 i/lub CD8. W przypadku IL-2 stwierdzono obecność 83% komórek CD4+, 15% CD8+ oraz &lt;1% komórek CD4+CD8+. W przypadku IL-15 stwierdzono obecność 88% komórek CD4+, 11% CD8+ oraz &lt;1% komórek CD4+CD8+. Podczas migracji limfocytów T na podłożach ICAM-1/SDF-1 komórki wykazywały prędkość wynoszącą około 15 μm/min, która może być utrzymana przez 1 godzinę. Migracja limfocytów T na ICAM-1/SDF-1 jest zależna od adhezji zapośredniczonej przez LFA-1, ponieważ przeciwciało blokujące ligand LFA-1 silnie hamuje migrację.
<img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig1.jpg" alt="Analiza migracji komórek; obrazy mikroskopowe pokazujące ścieżki komórek z trajektoriami zakodowanymi kolorami." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Śledzenie ruchu migrujących limfocytów T. Limfocyty T wyizolowane z krwi pełnej i hodowane w obecności IL-2 lub IL-15 przez 6 dni poddano adhezji i migracji na szalkach z szklanym dnem pokrytych 10 μg/mL ICAM-1 oraz 2 μg/mL SDF-1. Obrazy pozyskiwano co 10 sekund przez 30 minut. Komórki identyfikowano na każdym obrazie i śledzono w czasie za pomocą oprogramowania Volocity. Film ten przedstawia losową migrację limfocytów T z prędkością ~15 μm/min.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2017/2017_Kim_Movie1.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.</a> 
Film 1. Śledzenie komórek migrujących limfocytów T. Limfocyty T wyizolowane z krwi pełnej i hodowane w obecności IL-2 lub IL-15 przez 6 dni poddano adhezji i migracji na szalkach z szklanym dnem pokrytych 10 μg/mL ICAM-1 i 2 μg/mL SDF-1. Obrazy pozyskiwano co 10 sekund przez 30 minut. Komórki identyfikowano na każdym obrazie i śledzono w czasie za pomocą oprogramowania Volocity. Film ten przedstawia losową migrację limfocytów T z prędkością ~15 μm/min.
<img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig2.jpg" alt="Wyniki śledzenia centroidów komórek; tabela danych, współrzędne pozycji w czasie, analiza migracji komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Spacjoczasowa pozycja komórek. Współrzędne X-Y każdej komórki zostały uzyskane dla każdego punktu czasowego przy użyciu oprogramowania Volocity.
<img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig3.jpg" alt="Trajektorie błądzenia losowego, wykres rozrzutu, symulacja statystyczna, procesy stochastyczne w analizie danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. „Wykres pajęczyny”. Wykorzystując współrzędne X-Y-t dla każdej komórki, wybrano losowo 15 komórek i naniesiono je na wykres ze wspólnym punktem startowym w początku układu współrzędnych. Porównanie wykresów pajęczyn daje szybki wizualny obraz różnic w migracji pomiędzy różnymi warunkami eksperymentalnymi. Wykresy migracji limfocytów T w warunkach kontrolnych (panel lewy) oraz w obecności blokującego ligand przeciwciała anty-LFA-1 (panel prawy).

<ol><li>Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+integrin+VLA-4+localizes+to+the+lamellipodia+and+mediates+t+cell+migration+on+VCAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1.</a> J Immunol. 183, 359-369 (2009).</li>
<li>Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmuscle+myosin+heavy+chain+IIA+mediates+integrin+LFA-1+de-adhesion+during+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).</li>
<li>Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+integrins+and+their+ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+research%22%5BJournal%5D)">Leukocyte integrins and their ligand interactions.</a> Immunologic research. , (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

W tym doświadczeniu przedstawiamy szczegóły prostego systemu służącego do analizy motywności pierwotnych ludzkich limfocytów T. Testy migracji in vitro są wykorzystywane do badania roli wielu cząsteczek i szlaków sygnałowych zaangażowanych w lokomocję różnych typów komórek. Projektując własne doświadczenie na podstawie naszego protokołu, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych kontroli, takich jak: 1) powłoki podłoża nieprzyczepne lub nieprzyczepne poprzez integryny, odpowiednio: albuminy surowicy bydlęcej (BSA)...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH300070.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>1-Step Polymorphs</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-15</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-IL</td><td></td></tr><tr><td>Białko G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19459</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka ICAM-1/Fc</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>720-IC</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka SDF-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>350-NS</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, hodowla i analiza migracji ludzkich limfocytów t in vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Migracja limfocytów T obejmuje interakcje adhezyjne integryn powierzchniowych komórki z ligandami ekspresjonowanymi na innych komórkach lub z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej. Precyzyjna aktywacja czasowo-przestrzenna integryn z stanu o niskim powinowactwie do stanu o wysokim powinowactwie na przednim brzegu komórki jest istotna dla migracji limfocytów T1Podobnie, retrakcja tylnej krawędzi komórki, czyli uropodu, jest niezbędnym etapem w utrzymaniu stałej, zależnej od integryn ruchliwości limfocytów T2Wiele podejść terapeutycznych w chorobach autoimmunologicznych lub zapalnych celuje w integryny w celu zahamowania nadmiernej rekrutacji i migracji leukocytów3. Aby zbadać zdarzenia molekularne regulujące migrację ludzkich limfocytów T, wykorzystaliśmy układin vitrosystem do analizy migracji komórek na podłożu dwuwymiarowym, które naśladuje środowisko, z jakim limfocyt T styka się podczas rekrutacji z naczyń krwionośnych. Limfocyty T są najpierw izolowane od ludzkich dawców, a następnie stymulowane i hodowane przez siedem do dziesięciu dni. Podczas testu limfocyty T mogą przylegać i migrować na podłożu pokrytym cząsteczką adhezji międzykomórkowej 1 (ICAM-1), która jest ligandem dla integryny LFA-1, oraz czynnikiem pochodzącym z komórek zrębu 1 (SDF-1). Nasze dane pokazują, że limfocyty T wykazują prędkość migracji wynoszącą ~15 μm/min. Migrację limfocytów T można zahamować poprzez blokadę integryn1lub za pomocą inhibitorów komórkowego aparatu akto-miozynowego regulującego migrację komórek2Empty source HTML. No content to translate.

Migracja limfocytów T zachodzi podczas homingu do organów limfatycznych, opuszczania naczyń krwionośnych i wnikania do tkanek obwodowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który może być wykorzystany do analizy migracji limfocytów T in vitro.

Izolacja, hodowla i analiza migracji ludzkich limfocytów T in vitro

Migracja limfocytów T obejmuje interakcje adhezyjne integryn powierzchniowych komórki z ligandami eksprymowanymi na innych komórkach lub z macierzą zewnątrzkomórkową...

Migracja limfocytów T zachodzi podczas homingu do narządów limfatycznych, opuszczania naczyń krwionośnych i wnikania do tkanek obwodowych. Proces ten obejmuje oddziaływania adhezyjne powierzchni limfocytów T z innymi komórkami. Aby zbadać to zjawisko in vitro, limfocyty T człowieka są izolowane, hodowane i nanoszone na płytki do hodowli tkanek pokryte białkiem adhezyjnym.ICAM-1 oraz chemokina SDF-1. Następnie można pozyskać i przeanalizować obrazy migracji limfocytów T. Cześć, jestem Craig LeFort z laboratorium Minsu Kim w Centrum Biologii i Immunologii Szczepionek na Uniwersytecie w Rochester.Dzisiaj przedstawimy procedurę izolacji i hodowli ludzkich limfocytów T oraz analizę ich migracji in vitro. W naszym laboratorium wykorzystujemy ten test do badania roli integryn i migracji limfocytów T. Główną integryną w limfocytach T jest antygen LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen 1).Specyficznymi ligandami dla LFA-1 są cząsteczki ICAM, takie jak ICAM-1. Ponadto do migracji limfocytów T wymagany jest sygnał kinazowy, który zapewnia zarówno sygnał kierunkowy, jak i aktywację integryn. W naszym teście jako substraty dla migracji limfocytów T wykorzystujemy ludzkie ICAM-1 oraz CXCL

human-t-lymphocyte-isolation-culture-analysis-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolowanie limfocytów T ludzkich, hodowla i analiza migracji in vitro

Eksperymenty z konkurencyjnym homingiem pozwalają na bezpośrednią ocenę właściwości migracyjnych dwóch różnych populacji komórek u jednej myszy. W niniejszym materiale ilustrujemy tę procedurę, porównując migrację limfocytów T o tropizmie jelitowym i nietropowym generowanych ex vivo.

Konkurencyjne testy homingu w celu badania migracji limfocytów T tropujących do jelit

Opisano wydajną metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne oraz separację w gradiencie Percoll w celu zapewnienia efektywnej izolacji. Technikę tę można również dostosować do zastosowania u innych...

Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

Ten film przedstawia eksperymentalne badanie transmigracji limfocytów przez model śródbłonka bariery krew-mózg (BBB). Monowarstwa komórek śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu (HBMEC) jest generowana in vitro, a komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zawierające limfocyty są dodawane do monowarstwy. Komórki są następnie inkubowane, aby umożliwić transmigrację limfocytów, a migrowane komórki są oznaczane ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej.

Badanie migracji limfocytów przez monowarstwę komórek śródbłonka mikronaczyniowego

Opisujemy protokół skutecznego izolowania limfocytów T rezydujących w skórze z biopsji ludzkiej skóry. Protokół ten zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych limfocytów rezydentnych w ludzkiej skórze do analizy cytometrii przepływowej i hodowli ex vivo.

Izolacja limfocytów z ludzkiej skóry w celu analizy fenotypowej i hodowli komórkowej ex vivo

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek śródbłonka limfatycznego, wyściełających ludzkie malformacje limfatyczne, torbielowate naczynia i napletki za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Późniejsza hodowla komórkowa i ekspansja tych komórek pozwala na nowy poziom wyrafinowania eksperymentalnego w badaniach genetycznych, proteomicznych, funkcjonalnych i różnicowania komórek.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Tutaj opisujemy model ludzkiej bariery krew-mózg, umożliwiający badanie transmigracji limfocytów do ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Analiza wynaczynienia limfocytów przy użyciu modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

W tym protokole, limfocyty są umieszczane w górnej komorze systemu transmigracyjnego, oddzielone od dolnej komory porowatą błoną. Do dolnej komory dodaje się chemokinę, która indukuje aktywną migrację wzdłuż gradientu chemokin. Po 48 godzinach limfocyty są liczone w obu komorach w celu ilościowego określenia transmigracji.

Ocena migracji limfocytów w systemie transmigracji ex vivo

Ten protokół zapewnia metodę pierwotnej izolacji mysich limfocytów T i mikroskopii poklatkowej migracji limfocytów T w określonych warunkach środowiskowych z analizą ilościową.

Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +

Poznaj metodę izolacji i hodowli ludzkich limfocytów T oraz analizy ich migracji in vitro przy użyciu białek adhezyjnych i chemokin. Protokół ten umożliwia badanie dynamiki komórek immunologicznych.

Izolacja, hodowla i analiza migracji ludzkich limfocytów T in vitro

Przeglądaj więcej filmów