JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:06 min. • July 8th, 2025
Weź unieruchomiony, transfekowany wycinek koronalny myszy w komorze nagraniowej perfuzji płynu mózgowo-rdzeniowego.
Wycinek zawiera rzadką populację neuronów piramidowych wyrażających docelowy enzym i białko fluorescencyjne.
Zmontuj pipetę rejestrującą składającą się z roztworu wewnątrzkomórkowego i elektrody podłączonej do wzmacniacza do pomiaru sygnałów neuronalnych.
Mikroskopowo zidentyfikuj obszar tkanki docelowej i zlokalizuj neuron fluorescencyjny.
Zastosuj dodatnie ciśnienie do pipety, aby zapobiec zatkaniu i przesunąć ją do docelowego neuronu.
Dodatnie ciśnienie powoduje niewielkie wgłębienie na błonie neuronalnej w kontakcie.
Zwolnij ciśnienie, tworząc szczelne uszczelnienie między membraną a końcówką.
Ustaw potencjał utrzymywania na stałą wartość ujemną, aby ustabilizować neuron.
Zastosuj krótkie podciśnienie, aby rozerwać membranę, łącząc cytoplazmę z wnętrzem pipety i ustanawiając konfigurację całej komórki.
Przełącz się w tryb cęgów prądowych i zastosuj dodatnie impulsy prądowe, generując potencjały czynnościowe wskazujące na pobudliwość neuronów.
Przenieś plasterek do komory rejestracyjnej za pomocą pipety Pasteura lub małego pędzelka. Przytrzymaj plasterek harfą i przetapiaj go ACSF z szybkością 2 mililitrów na minutę. Aby załatać neuron GFP-dodatni, zlokalizuj obszar zainteresowania za pomocą mikroskopu pod kątem 10x. Następnie znajdź komórkę GFP-dodatnią za pomocą obiektywu 60x.
Następnie napełnij elektrodę rejestrującą roztworem wewnątrzkomórkowym. Następnie umieść szklaną pipetę w uchwycie na pipety. Następnie umieść końcówkę pipety w wannie i skup się na końcówce. Gdy pipeta znajdzie się w kąpieli, należy zastosować nadciśnienie przez system kontroli ciśnienia wstecznego.
Zbliżyć się do celi zainteresowania pod kierunkiem wizualnym, utrzymując ciśnienie wsteczne w pipecie. Po pojawieniu się małego wgłębienia na powierzchni komórki zwolnij ciśnienie. W tym momencie może powstać szczelne uszczelnienie o rezystancji większej niż 1 gigaom. W przeciwnym razie zastosuj lekkie podciśnienie, aby to ułatwić.
Podczas formowania uszczelki doprowadź zacisk podtrzymujący napięcie do ujemnych 60 miliwoltów. Po uformowaniu uszczelki gigaomowej zastosuj impuls ssania, aby rozerwać błonę komórkową i przejść w tryb całej komórki. Gdy znajdzie się w trybie całej komórki, przełącz się z trybu cęgów napięciowych na tryb cęgów prądowych i rozpocznij nagrywanie.