Badanie pobudliwości neuronów fluorescencyjnych za pomocą klamry krosowej dla całych komórek

Weź unieruchomiony, transfekowany wycinek koronalny myszy w komorze nagraniowej perfuzji płynu mózgowo-rdzeniowego.

Wycinek zawiera rzadką populację neuronów piramidowych wyrażających docelowy enzym i białko fluorescencyjne.

Zmontuj pipetę rejestrującą składającą się z roztworu wewnątrzkomórkowego i elektrody podłączonej do wzmacniacza do pomiaru sygnałów neuronalnych.

Mikroskopowo zidentyfikuj obszar tkanki docelowej i zlokalizuj neuron fluorescencyjny.

Zastosuj dodatnie ciśnienie do pipety, aby zapobiec zatkaniu i przesunąć ją do docelowego neuronu.

Dodatnie ciśnienie powoduje niewielkie wgłębienie na błonie neuronalnej w kontakcie.

Zwolnij ciśnienie, tworząc szczelne uszczelnienie między membraną a końcówką.

Ustaw potencjał utrzymywania na stałą wartość ujemną, aby ustabilizować neuron.

Zastosuj krótkie podciśnienie, aby rozerwać membranę, łącząc cytoplazmę z wnętrzem pipety i ustanawiając konfigurację całej komórki.

Przełącz się w tryb cęgów prądowych i zastosuj dodatnie impulsy prądowe, generując potencjały czynnościowe wskazujące na pobudliwość neuronów.

Przenieś plasterek do komory rejestracyjnej za pomocą pipety Pasteura lub małego pędzelka. Przytrzymaj plasterek harfą i przetapiaj go ACSF z szybkością 2 mililitrów na minutę. Aby załatać neuron GFP-dodatni, zlokalizuj obszar zainteresowania za pomocą mikroskopu pod kątem 10x. Następnie znajdź komórkę GFP-dodatnią za pomocą obiektywu 60x.

Następnie napełnij elektrodę rejestrującą roztworem wewnątrzkomórkowym. Następnie umieść szklaną pipetę w uchwycie na pipety. Następnie umieść końcówkę pipety w wannie i skup się na końcówce. Gdy pipeta znajdzie się w kąpieli, należy zastosować nadciśnienie przez system kontroli ciśnienia wstecznego.

Zbliżyć się do celi zainteresowania pod kierunkiem wizualnym, utrzymując ciśnienie wsteczne w pipecie. Po pojawieniu się małego wgłębienia na powierzchni komórki zwolnij ciśnienie. W tym momencie może powstać szczelne uszczelnienie o rezystancji większej niż 1 gigaom. W przeciwnym razie zastosuj lekkie podciśnienie, aby to ułatwić.

Podczas formowania uszczelki doprowadź zacisk podtrzymujący napięcie do ujemnych 60 miliwoltów. Po uformowaniu uszczelki gigaomowej zastosuj impuls ssania, aby rozerwać błonę komórkową i przejść w tryb całej komórki. Gdy znajdzie się w trybie całej komórki, przełącz się z trybu cęgów napięciowych na tryb cęgów prądowych i rozpocznij nagrywanie.