Name: Odwrotne podejście genetyczne do badania redundancji funkcjonalnej podczas embriogenezy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Poznaj metodę podwójnego nokdaunu genów w embriach Danio rerio przy użyciu morfolin. Technika ta pozwala odkryć funkcjonalną redundancję genów podczas embriogenezy i określić ich rolę w specyfikacji linii komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy członkom laboratorium Evansa za pomoc w przygotowaniu tej prezentacji. Morfolino wykorzystane w tej pracy zostały pierwotnie zwalidowane przez dr Audrey Holtzinger. T.E. otrzymuje wsparcie finansowe z grantów National Institutes of Health (HL064282 i HL056182). Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez Institute for Animal Care and Use Committee w Weill Cornell Medical College.

<ol><li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata5+and+Gata6+are+functionally+redundant+in+zebrafish+for+specification+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes.</a> Dev Biol. 312, 613-622 (2007).</li>
<li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Dev Biol. 311, 623-635 (2007).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata4+regulates+the+formation+of+multiple+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata4 regulates the formation of multiple organs.</a> Development. 132, 4005-4014 (2005).</li>
<li>Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+factors+in+Drosophila+heart+and+blood+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GATA factors in Drosophila heart and blood cell development.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W opisanym tutaj eksperymencie połączyliśmy dwa morfolino, z których każde z osobna wywołuje odmienny zakres fenotypów, i zaobserwowaliśmy całkowicie inny fenotyp po ich wspólnej iniekcji. Oczywiście, w pierwszej kolejności potrzebowaliśmy uzasadnienia dla przeprowadzenia tego badania. Podejrzewaliśmy, że dwa geny mogą wzajemnie kompensować swoją funkcję na wcześniejszym etapie, w tym przypadku podczas specyfikacji serca. Wynika to z faktu, że geny te są blisko spokrewnione (i zdolne do wiązania się z tymi samymi sekwenc...

<table><tbody><tr><td>Zbiorniki i przegrody do hodowli ryb</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siatki do ryb</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda systemowa</td><td></td><td></td><td>60mg Instant Ocean&amp;#8221; na litr dH2O</td></tr><tr><td>100mm szalki Petriego</td><td>BD Biosciences</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Wytciągacz igieł do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97 Flaming/Brown</td><td></td></tr><tr><td>3.5&quot; kapilary szklane</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Personna Medical Care</td><td>94-120-71</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszlifierka</td><td>Narishige International</td><td>EG-4</td><td></td></tr><tr><td>Siatkowy okular mikroskopowy</td><td>Premiere</td><td>MF-02</td><td></td></tr><tr><td>Mikrometr</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza ultra czysta</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Spatułka</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe naczynia wagowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>2-202-B</td><td></td></tr><tr><td>Konwencjonalna kuchenka mikrofalowa</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera</td><td>Corning</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>Przedmioty szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552</td><td></td></tr><tr><td>cylinder miarowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6D</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna pipeta</td><td>BrandTech</td><td>2026333</td><td></td></tr><tr><td>70% roztwór płuczący etanolu</td><td>Tarr</td><td>801VWR</td><td></td></tr><tr><td>Butla N2</td><td>Tech Air</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowstrzykiwacz</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Micro Instruments</td><td>LTD</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American National Can</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>morpholino miejsca splicingu &lt;em&gt;gata5&lt;/em&gt;</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Bloker ATG gata5</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Bloker ATG długiej izoformy &lt;em&gt;gata6&lt;/em&gt;</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Jednorazowa pipeta Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian trikainy</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155495</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzejny</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-4</td><td></td></tr><tr><td>Ostre pęsety</td><td>Dumont</td><td></td><td>Rozmiar 55</td></tr><tr><td>Mikroszkiełka z wgłębieniem</td><td>VWR international</td><td>48339-009</td><td></td></tr></tbody></table>

podejście genetyki odwrotnej do badania redundancji funkcjonalnej podczas embriogenezy

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Funkcja genów podczas embriogenezy jest zazwyczaj definiowana za pomocą eksperymentów polegających na utracie funkcji, na przykład poprzez celowaną mutogenezę (knockout) u myszy. W modelu danio pręgowanego opracowano skuteczne techniki genetyki odwrotnej z wykorzystaniem mikroiniekcji specyficznych dla danego genu antysensownych morfolino. Morfolino wiążą się z mRNA poprzez specyficzne parowanie zasad i przejściowo blokują funkcję genu, hamując translację lub splicing przez kilka dni podczas embriogenezy (knockdown). Jednak u kręgowców, takich jak mysz czy danio pręgowany, niektóre funkcje genów mogą zostać zamaskowane przez te podejścia ze względu na obecność innego genu, który kompensuje tę stratę. Dotyczy to szczególnie rodzin genów zawierających geny siostrzane, które są współwyrażane w tych samych rozwijających się tkankach. U danio pręgowanego kompensację funkcjonalną można przetestować w sposób stosunkowo wysokoprzepustowy poprzez ko-iniekcję morfolino, które jednocześnie celują w knockdown obu genów. Podobnie, z wykorzystaniem morfolino można wykazać interakcję genetyczną między dowolnymi dwoma genami poprzez jednoczesny knockdown obu genów na poziomach poniżej progu. Na przykład morfolino można miareczkować tak, aby żaden z indywidualnych knockdownów nie generował fenotypu. Jeśli w tych warunkach ko-iniekcja obu morfolino wywołuje fenotyp, wykazano interakcję genetyczną. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak wykazać redundancję funkcjonalną w kontekście dwóch powiązanych czynników transkrypcyjnych GATA. Czynniki GATA są niezbędne do specyfikacji progenitorów serca, ale ujawnia się to jedynie po utracie zarówno Gata5, jak i Gata6. Pokazujemy, jak przeprowadzić eksperymenty z mikroiniekcji, zwalidować morfolino oraz ocenić skompensowany fenotyp w procesie kardiogenezy.

Funkcja genu może zostać zamaskowana w eksperymentach polegających na utracie funkcji, jeśli następuje kompensacja przez inny gen. Model rybki danio (zebrafish) zapewnia relatywnie wysokoprzepustowy sposób ujawniania takiej redundancji funkcjonalnej w żywych embrionach.

Podejście genetyki odwrotnej do badania redundancji funkcjonalnej podczas embriogenezy

Funkcja genu podczas embriogenezy jest zazwyczaj definiowana poprzez eksperymenty polegające na utracie funkcji, na przykład za pomocą celowanej mutogenezy (knockout) u myszy. W ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie, czy dwa geny są funkcjonalnie redundantne w procesie specyfikacji określonej linii komórkowej. Osiąga się to najpierw poprzez zdefiniowanie fenotypu utraty funkcji każdego z poszczególnych genów przy użyciu specyficznych dla genów morpholino wstrzykniętych do rozwijających się embrionów zebrafish. Drugim krokiem procedury jest opracowanie testu do ilościowej oceny specyfikacji lub różnicowania linii komórkowej.Na przykład, wykorzystując linię ryb reporterowych, co zaprezentujemy w niniejszym materiale. Trzecim krokiem procedury jest połączenie dwóch FENO morph, aby jednocześnie uzyskać utratę funkcji obu genów. Ostatnim krokiem procedury jest ocena fenotypu wywołanego podwójnym wyciszeniem genów.W rezultacie można uzyskać dane wykazujące utratę lub nabycie funkcji komórek danej linii poprzez badanie reportera linii lub analizę ekspresji markerów specyficznych dla linii. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak łączenie knockoutów w modelu mysim, jest możliwość celowania w dwa lub nawet trzy geny w modelu rybim poprzez proste połączenie zwalidowanych morphino w jednym eksperymencie. Można wstrzykn

a-reverse-genetic-approach-to-test-functional-redundancy-during

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Odwrócone podejście genetyczne do testowania redundancji funkcjonalnej podczas embriogenezy

Adaptowalna metoda odwrotnej genetyki dla danio pręgowanego do oceny funkcji genów podczas późniejszych etapów rozwoju i fizjologicznej homeostazy, takich jak regeneracja tkanek za pomocą dokomorowych iniekcji specyficznych dla genu morpholinos.

Odwrotne podejście genetyczne morpholino za pomocą wstrzyknięcia do komory serca w celu transfekcji wielu trudnych do namierzenia tkanek u larwy danio pręgowanego

Opisujemy system oocytów i czapeczek zwierzęcych Xenopus do klonowania ekspresji genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie i omawiamy techniki późniejszej analizy takich genów. System ten jest przydatny w funkcjonalnej identyfikacji szerokiej gamy produktów genowych.

Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus

Celem tego protokołu jest opisanie metody funkcji utraty i zysku, która ma zastosowanie do identyfikacji neogeniny jako specyficznego dla etapu receptora, który prowadzi do trofektodermy i różnicowania wewnętrznej masy komórkowej w preimplantacyjnych zarodkach myszy.

Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy

Ten artykuł wideo szczegółowo opisuje prostą metodologię in vivo, która może być używana do systematycznego i efektywnego charakteryzowania składników złożonych szlaków sygnałowych i sieci regulacyjnych w wielu zarodkach bezkręgowców.

Siła prostoty: zarodki jeżowców jako modele rozwojowe in vivo do badania złożonych interakcji sieci sygnalizacyjnych między komórkami

Prezentujemy prosty protokół ekranu tłumiącego w drożdżach rozszczepienia. Metoda ta jest skuteczna, wolna od mutagenów i selektywna w przypadku mutacji, które często występują w pojedynczym locus genomu. Protokół jest odpowiedni do izolowania supresorów, które łagodzą defekty wzrostu w płynnej kulturze, które są spowodowane mutacją lub lekiem.

Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Światło / ciemność testu transformacji jest jednym z najczęściej stosowanych testów do pomiaru lęku zachowań w myszy. Poniżej prezentujemy film, który pokazuje szczegółowe procedury, w jaki sposób przeprowadzenia testu.

Światło / ciemność test przejścia dla Myszy

W tym filmie zaprezentowano New culture – metodę, dzięki której zarodki kurcząt są hodowane poza jajem przez maksymalnie 24 hr. Metoda ta umożliwia badanie wczesnego rozwoju (od pręgi pierwotnej do 14 som.), co odpowiada okresowi E7-9 u myszy. Zastosowania tej techniki obejmują elektroporację, hybrydyzację in situ oraz immunohistochemię.

Metoda hodowli wczesnych zarodków kurczaka ex vivo (nowa hodowla)

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Indukcja neuralna jest pierwszym etapem formowania się mózgu. Jest to mechanizm, dzięki któremu węzeł Hensen’a (organizator) instruuje sąsiednie tkanki do przyjęcia losu neuralnego, tzn. do przekształcenia się w układ nerwowy. Niniejszy film prezentuje test indukcji neuralnej w embrionie kurczaka.

Analiza indukcji neuralnej w embrionie kurczaka

Poznaj metodę podwójnego nokdaunu genów w embriach Danio rerio przy użyciu morfolin. Technika ta pozwala odkryć funkcjonalną redundancję genów podczas embriogenezy i określić ich rolę w specyfikacji linii komórkowych.

Podejście genetyki odwrotnej do badania redundancji funkcjonalnej podczas embriogenezy

Przeglądaj więcej filmów