Odwrotne podejście genetyczne do badania redundancji funkcjonalnej podczas embriogenezy

Funkcja genu może być ukryta w eksperymentach z utratą funkcji, jeśli występuje kompensacja przez inny gen. Model danio pręgowanego zapewnia stosunkowo wysokoprzepustowy sposób ujawniania takiej funkcjonalnej redundancji u żywych zarodków.

Ogólnym celem tej procedury jest ustalenie, czy dwa geny są funkcjonalnie redundantne dla specyfikacji zdefiniowanej linii komórkowej. Osiąga się to poprzez zdefiniowanie najpierw fenotypu utraty funkcji każdego pojedynczego genu za pomocą specyficznych dla genu morfo wstrzykiwanych do rozwijających się zarodków danio pręgowanego. Drugim etapem procedury jest opracowanie testu do ilościowego określania specyfikacji lub różnicowania linii komórkowych.

Na przykład przy użyciu odmiany ryb reporterowych, jak pokażemy tutaj. Trzecim krokiem procedury jest połączenie dwóch morfów FENO, aby ukierunkować się na utratę funkcji obu genów jednocześnie. Ostatnim krokiem procedury jest ocena fenotypu spowodowanego podwójnym nokautem.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na utratę lub wzmocnienie funkcji komórek określonej linii poprzez badanie reportera linii lub analizę ekspresji markera specyficznego dla linii. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak łączenie nokautów w modelu mysim, jest to, że dwa, a nawet trzy geny mogą być celowane w modelu ryb, po prostu łącząc zweryfikowane morfy w jednym eksperymencie. W ciągu kilku dni można wstrzyknąć ponad 100 zarodków i ocenić fenotypy.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania. W biologii rozwojowej, takiej jak definiowanie szlaków transkrypcyjnych kontrolujących los komórki, kluczowe szlaki regulacyjne są często reprezentowane przez małe rodziny powiązanych genów, które są funkcjonalnie nadmiarowe. Ich rola nie jest zatem oczywista w badaniach nad nokautem myszy ze względu na kompensację z genów siostrzanych.

Chociaż model ten może dostarczyć informacji na temat embriogenezy danio pręgowanego, wyniki można zastosować do innych systemów, takich jak myszy, ponieważ te same programy genetyczne są zazwyczaj dobrze zachowane przez cały okres ewolucji. Przygotuj płytki do mikroiniekcji przed wstrzyknięciem zarodków. Wlej około 12 mililitrów 2%agros do wody systemowej, która jest czystą wodą pobieraną bezpośrednio z systemu akwarium do odwróconej pokrywy 100-milimetrowej szalki Petriego.

Oprzyj dwa szkiełka mikroskopowe pod kątem około 45 stopni po obu stronach pokrywy. Gdy agros zastygnie, delikatnie odciągnij szkiełka od pokrywy, tworząc koryta, w których zarodki będą odpoczywać podczas wstrzykiwania morf, żadne łodygi nie są trzymane w temperaturze pokojowej o stężeniu jednego milimola i sterylnej destylowanej wody dejonizowanej Przed wstrzyknięciem. Inkubuj buliony morphos w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby upewnić się, że są całkowicie w roztworze.

Pozwól bulionom ostygnąć do temperatury pokojowej. Każdy nowo zaprojektowany morfo musi zostać empirycznie zweryfikowany pod kątem aktywności i tolerancji zarodka. W mikroprobówkach wirówkowych należy rozpocząć od jednego do dwóch seryjnych rozcieńczeń podstawowego morfo w destylowanej wodzie dejonizowanej, uzyskując stężenia robocze jednego milimola, 0,5 milimola, 0,25 milimola i 0,125 milimola.

Pod lunetą sekcyjną za pomocą ssania załadować od przodu skalibrowaną igłę do wstrzykiwań, która została przymocowana do mikromanipulatora i prawidłowo umieszczona. Załadować igłę około jednym mikrolitrem roztworu morpho o najniższym stężeniu. Za pomocą pipety transferowej przenieś zapłodnione zarodki jednokomórkowe do koryt płytki do mikroiniekcji.

Za pomocą pipety usuń nadmiar wody z płytki, tak aby zarodki opadły na dno koryta. Umieścić płytkę iniekcyjną pod mikroskopem, zanurzyć igłę przez korion i zanurzyć w żółtku. Należy wstrzyknąć każdy zarodek przed wyjęciem igły i zmianą położenia płytki iniekcyjnej w celu uzyskania dostępu do następnego zarodka.

Podczas nauki wstrzykiwania pomocne może być użycie niezbędnego barwnika, aby zobrazować wstrzyknięcie do komórki, jak pokazano tutaj, przenieś zarodki z powrotem na 100-milimetrową szalkę Petriego z systemową hodowlą wodną w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza. Usunąć pozostały roztwór morfo z igły i wypełnić go następnym roztworem morpho o najwyższym stężeniu w celu wstrzyknięcia następnej partii zarodków na odpowiednim etapie rozwoju. Zbadaj zarodki pod kątem fenotypów przy każdym wstrzykniętym stężeniu morfo.

Dawka progowa dla każdego morpho jest najniższą dawką, przy której istnieje określony wiarygodny fenotyp. Może być konieczne przeprowadzenie wielu rund miareczkowania w celu określenia niedokładnego progu. Poszukiwanie genetycznej interakcji między dwoma różnymi genami.

Przygotować mieszaninę dwóch morfo, z których każdy ma odpowiednie stężenie progowe. Ważne jest, aby pamiętać, że zarodki mogą nie tolerować więcej niż 20 nanogramów całkowitego morfo na wstrzyknięcie. Należy wstrzyknąć zarodki w taki sam sposób jak poprzednio.

Utrzymuj stałą objętość iniekcji między grupą eksperymentalną i kontrolną, która powinna obejmować zestawy wstrzykiwane z każdym morfo osobno pod mikroskopem preparacyjnym. Natychmiast po wstrzyknięciu należy monitorować wstrzyknięte zarodki i kilka razy w ciągu dnia używać pipety transferowej w celu usunięcia martwych lub umierających zarodków. Ponieważ mogą one zagrozić żywotności pozostałych morfin za pomocą ruchów pipety transferowej, zarodki są uspokojone lub poddawane eutanazji w dowolnym momencie.

Wskaż slajd z wgłębieniem w celu obserwacji. Do fotografii. W razie potrzeby użyj ostrych kleszczy, aby usunąć korion.

Ustabilizuj zarodek w kropli 3% Metylocelulozy Przesiewaj zarodki, aby uzyskać odrębny fenotyp, unikalny dla kombinacji morfów, w przeciwieństwie do większej penetracji fenotypu pojedynczych morfin. Oto kilka zarodków typu dzikiego, którym wstrzykuje się morfos na progu. W przypadku gata piątej typowym fenotypem jest rozszczep krążenia lub dwa serca, ponieważ przodkowie nie zlali się w linii środkowej.

Zwróć uwagę na kardiomiocyty GFP dodatnie wskazane przez strzałki. Fenotyp sześciu morfin obejmuje zniekształcone serca, które nie zapętlają się prawidłowo. W tych zarodkach rozwijają się również kardiomiocyty GFP-dodatnie.

Jednak zarodki, którym wstrzyknięto kombinację zarówno gata five, jak i gata six morphos, pokazane tutaj. Wykazują całkowitą utratę rozwoju kardiomiocytów wskazującą, że do rozwoju kardiomiocytów musi być wyrażona zarówno gata pięć, jak i gata szósta. Te dwa geny są funkcjonalnie redundantne dla specyfikacji kardiomiocytów.

Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby najpierw w pełni zweryfikować swój morfos i mieć jak największą pewność, że reprezentują one prawdziwy knockdown pojedynczego genu docelowego Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak łączenie warunkowych mysich alleli zerowych, mogą być wykonane w celu pokazania, że te same geny działają. Podobnie u ssaków.

Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić, czy dwa geny są funkcjonalnie zbędne podczas embriogenezy.