Odwrotne podejście genetyczne do badania redundancji funkcjonalnej podczas embriogenezy
11 sierpnia 2010
Funkcja genu może być ukryta w eksperymentach z utratą funkcji, jeśli występuje kompensacja przez inny gen. Model danio pręgowanego zapewnia stosunkowo wysokoprzepustowy sposób ujawniania takiej funkcjonalnej redundancji u żywych zarodków.
Ogólnym celem tej procedury jest ustalenie, czy dwa geny są funkcjonalnie redundantne dla specyfikacji zdefiniowanej linii komórkowej. Osiąga się to poprzez zdefiniowanie najpierw fenotypu utraty funkcji każdego pojedynczego genu za pomocą specyficznych dla genu morfo wstrzykiwanych do rozwijających się zarodków danio pręgowanego. Drugim etapem procedury jest opracowanie testu do ilościowego określania specyfikacji lub różnicowania linii komórkowych.
Na przykład przy użyciu odmiany ryb reporterowych, jak pokażemy tutaj. Trzecim krokiem procedury jest połączenie dwóch morfów FENO, aby ukierunkować się na utratę funkcji obu genów jednocześnie. Ostatnim krokiem procedury jest ocena fenotypu spowodowanego podwójnym nokautem.
Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na utratę lub wzmocnienie funkcji komórek określonej linii poprzez badanie reportera linii lub analizę ekspresji markera specyficznego dla linii. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak łączenie nokautów w modelu mysim, jest to, że dwa, a nawet trzy geny mogą być celowane w modelu ryb, po prostu łącząc zweryfikowane morfy w jednym eksperymencie. W ciągu kilku dni można wstrzyknąć ponad 100 zarodków i ocenić fenotypy.
Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania. W biologii rozwojowej, takiej jak definiowanie szlaków transkrypcyjnych kontrolujących los komórki, kluczowe szlaki regulacyjne są często reprezentowane przez małe rodziny powiązanych genów, które są funkcjonalnie nadmiarowe. Ich rola nie jest zatem oczywista w badaniach nad nokautem myszy ze względu na kompensację z genów siostrzanych.
Chociaż model ten może dostarczyć informacji na temat embriogenezy danio pręgowanego, wyniki można zastosować do innych systemów, takich jak myszy, ponieważ te same programy genetyczne są zazwyczaj dobrze zachowane przez cały okres ewolucji. Przygotuj płytki do mikroiniekcji przed wstrzyknięciem zarodków. Wlej około 12 mililitrów 2%agros do wody systemowej, która jest czystą wodą pobieraną bezpośrednio z systemu akwarium do odwróconej pokrywy 100-milimetrowej szalki Petriego.
Oprzyj dwa szkiełka mikroskopowe pod kątem około 45 stopni po obu stronach pokrywy. Gdy agros zastygnie, delikatnie odciągnij szkiełka od pokrywy, tworząc koryta, w których zarodki będą odpoczywać podczas wstrzykiwania morf, żadne łodygi nie są trzymane w temperaturze pokojowej o stężeniu jednego milimola i sterylnej destylowanej wody dejonizowanej Przed wstrzyknięciem. Inkubuj buliony morphos w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby upewnić się, że są całkowicie w roztworze.
Pozwól bulionom ostygnąć do temperatury pokojowej. Każdy nowo zaprojektowany morfo musi zostać empirycznie zweryfikowany pod kątem aktywności i tolerancji zarodka. W mikroprobówkach wirówkowych należy rozpocząć od jednego do dwóch seryjnych rozcieńczeń podstawowego morfo w destylowanej wodzie dejonizowanej, uzyskując stężenia robocze jednego milimola, 0,5 milimola, 0,25 milimola i 0,125 milimola.
Pod lunetą sekcyjną za pomocą ssania załadować od przodu skalibrowaną igłę do wstrzykiwań, która została przymocowana do mikromanipulatora i prawidłowo umieszczona. Załadować igłę około jednym mikrolitrem roztworu morpho o najniższym stężeniu. Za pomocą pipety transferowej przenieś zapłodnione zarodki jednokomórkowe do koryt płytki do mikroiniekcji.
Za pomocą pipety usuń nadmiar wody z płytki, tak aby zarodki opadły na dno koryta. Umieścić płytkę iniekcyjną pod mikroskopem, zanurzyć igłę przez korion i zanurzyć w żółtku. Należy wstrzyknąć każdy zarodek przed wyjęciem igły i zmianą położenia płytki iniekcyjnej w celu uzyskania dostępu do następnego zarodka.
Podczas nauki wstrzykiwania pomocne może być użycie niezbędnego barwnika, aby zobrazować wstrzyknięcie do komórki, jak pokazano tutaj, przenieś zarodki z powrotem na 100-milimetrową szalkę Petriego z systemową hodowlą wodną w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza. Usunąć pozostały roztwór morfo z igły i wypełnić go następnym roztworem morpho o najwyższym stężeniu w celu wstrzyknięcia następnej partii zarodków na odpowiednim etapie rozwoju. Zbadaj zarodki pod kątem fenotypów przy każdym wstrzykniętym stężeniu morfo.
Dawka progowa dla każdego morpho jest najniższą dawką, przy której istnieje określony wiarygodny fenotyp. Może być konieczne przeprowadzenie wielu rund miareczkowania w celu określenia niedokładnego progu. Poszukiwanie genetycznej interakcji między dwoma różnymi genami.
Przygotować mieszaninę dwóch morfo, z których każdy ma odpowiednie stężenie progowe. Ważne jest, aby pamiętać, że zarodki mogą nie tolerować więcej niż 20 nanogramów całkowitego morfo na wstrzyknięcie. Należy wstrzyknąć zarodki w taki sam sposób jak poprzednio.
Utrzymuj stałą objętość iniekcji między grupą eksperymentalną i kontrolną, która powinna obejmować zestawy wstrzykiwane z każdym morfo osobno pod mikroskopem preparacyjnym. Natychmiast po wstrzyknięciu należy monitorować wstrzyknięte zarodki i kilka razy w ciągu dnia używać pipety transferowej w celu usunięcia martwych lub umierających zarodków. Ponieważ mogą one zagrozić żywotności pozostałych morfin za pomocą ruchów pipety transferowej, zarodki są uspokojone lub poddawane eutanazji w dowolnym momencie.
Wskaż slajd z wgłębieniem w celu obserwacji. Do fotografii. W razie potrzeby użyj ostrych kleszczy, aby usunąć korion.
Ustabilizuj zarodek w kropli 3% Metylocelulozy Przesiewaj zarodki, aby uzyskać odrębny fenotyp, unikalny dla kombinacji morfów, w przeciwieństwie do większej penetracji fenotypu pojedynczych morfin. Oto kilka zarodków typu dzikiego, którym wstrzykuje się morfos na progu. W przypadku gata piątej typowym fenotypem jest rozszczep krążenia lub dwa serca, ponieważ przodkowie nie zlali się w linii środkowej.
Zwróć uwagę na kardiomiocyty GFP dodatnie wskazane przez strzałki. Fenotyp sześciu morfin obejmuje zniekształcone serca, które nie zapętlają się prawidłowo. W tych zarodkach rozwijają się również kardiomiocyty GFP-dodatnie.
Jednak zarodki, którym wstrzyknięto kombinację zarówno gata five, jak i gata six morphos, pokazane tutaj. Wykazują całkowitą utratę rozwoju kardiomiocytów wskazującą, że do rozwoju kardiomiocytów musi być wyrażona zarówno gata pięć, jak i gata szósta. Te dwa geny są funkcjonalnie redundantne dla specyfikacji kardiomiocytów.
Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby najpierw w pełni zweryfikować swój morfos i mieć jak największą pewność, że reprezentują one prawdziwy knockdown pojedynczego genu docelowego Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak łączenie warunkowych mysich alleli zerowych, mogą być wykonane w celu pokazania, że te same geny działają. Podobnie u ssaków.
Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić, czy dwa geny są funkcjonalnie zbędne podczas embriogenezy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie bada funkcyjną nadmiarowość genów w zarodkach ryby klaczkowca, która może zasłonić funkcję genu w eksperymentach z utrata funkcji. Za pomocą modelu wysokiego przepływu naukowcy mogą ujawnić mechanizmy kompensacyjne między genami.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Genetyka
- Biologia rozwoju
Tło
- Funkcję genu mogą zasłaniać działania kompensacyjne innych genów.
- Klaczkowce służą jako organizm modelowy do badania interakcji genów.
- Eksperymenty z utrata funkcji są kluczowe dla zrozumienia ról genów.
- Funkcyjna nadmiarowość może komplikować interpretację badań nad wyciszeniem genów.
Cel badania
- Określić, czy dwa geny są funkcyjnie nadmiarowe w specyfikacji linii komórkowych.
- Ocenić wpływ jednoczesnego wyciszenia genów na fenotypy.
- Opracować ilościowy test na różnicowanie linii komórkowych.
Zastosowane metody
- Wstrzyknięcie specyficznych dla genu morpholinos do zarodków klaczkowca.
- Wykorzystanie szczepów ryb reporterowych do testów specyfikacji linii komórkowych.
- Kombinacja morpholinos do eksperymentów z podwójnym wyciszeniem.
- Ocena wynikających fenotipow z podwójnego wyciszenia.
Główne wyniki
- Identyfikacja fenotipow z utrata funkcji dla pojedynczych genów.
- Udana ilościowa ocena specyfikacji linii komórkowych.
- Demonstracja funkcyjnej nadmiarowości między docelowymi genami.
- Wgląd w mechanizmy kompensacyjne w funkcji genów.
Wnioski
- Model klaczkowca jest skuteczny w badaniu nadmiarowości genów.
- Jednoczesne wyciszenie genów ujawnia skomplikowane interakcje genów.
- Rozumienie funkcyjnej nadmiarowości jest kluczowe dla analizy funkcji genów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Functional redundancy in gene families can obscure target validation in early discovery, leading to false negatives in phenotypic screening. This zebrafish-based reverse genetic approach enables high-throughput interrogation of compensatory mechanisms, improving target confidence and de-risking lead identification. By revealing genetic interactions through sub-threshold co-knockdown, the method supports predictive modeling of gene essentiality in vertebrate systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic interactions and functional compensation between related genes.
- Operational Value: Uses morpholino titration to establish threshold doses for individual and combined knockdown.
- Predictive Value: Reveals phenotypic outcomes only when both genes are suppressed, indicating functional redundancy.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Utilizes reporter fish strains to quantify cardiomyocyte specification as a lineage-specific readout.
- Operational Value: Allows injection and phenotyping of over 100 embryos per experiment for scalable screening.
- Assay Readiness: Generates quantitative, visually distinct phenotypes (e.g., cardio bifida, failed heart looping) for lineage assessment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Findings in zebrafish cardiogenesis are applicable to mammalian systems due to conserved genetic programs.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from single-gene loss or require combinatorial perturbation.
- Preclinical Model Support: Provides a zebrafish-based platform to validate target redundancy before mammalian model investment.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to validate targets and de-risk hypotheses before lead identification, particularly for gene families with compensatory members.
- Discovery Biology: Tests transcriptional regulators like GATA factors for redundant roles in cell fate specification.
- Screening: Establishes standardized morpholino dosing and phenotypic scoring for reproducible lineage assessment.
- Analytics: Uses phenotypic penetrance and lineage reporter output to compare single vs. double knockdown effects.
- Translational Research: Connects zebrafish embryogenesis findings to conserved pathways in higher vertebrates.
- Enterprise Reuse: Morpholino validation and injection workflows are adaptable to other gene pairs or developmental processes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing true genetic interactions from compensatory masking.
- Operational Value: Enables standardized, high-throughput embryo injection and phenotyping across multiple concentrations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing hidden dependencies in target networks.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by uncovering redundancy that could undermine monotherapy efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryogenesis, microinjection, and morpholino design validation.
- Dependent on microinjection apparatus, fluorescence microscopy, and embryo culture systems at 28.5°C.
- Necessitates cross-team standardization of morpholino storage, titration, and injection volume control.
- Involves adaptation considerations for different gene targets, including solubility and toxicity thresholds.
- Limited by embryo tolerance, with total morpholino dosage constrained to avoid non-specific effects (≤20 ng per injection).
