Name: Odwrotne podejście genetyczne morpholino za pomocą wstrzyknięcia do komory serca w celu transfekcji wielu trudnych do namierzenia tkanek u larwy danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj metodę odwrotnej genetyki z użyciem morfolinów do wstrzyknięć do komory serca u larw Danio rerio. Technika umożliwia badanie funkcji genów podczas regeneracji tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), chcielibyśmy podziękować Ayele Tsedeke Taddese za wsparcie techniczne.

1. Przygotowanie szklanych igieł (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Do przygotowania igieł do wstrzykiwań należy użyć szklanych naczyń włosowatych o średnicy 0,75 mm (ryc. 1A).</li>
	<li>Umieść szklaną kapilę w ściągaczu igieł i pociągnij igłę z następującym parametrem: wartość cyklu grzania: 463; wartość cyklu ciągnięcia: 230; prędkość: 150 ms; czas: 150 ms (rysunek 1B).</li>
	<li>Rozbij wyciągniętą szklaną kapilarnę za pomocą pęsety zegarmistrzowskiej, aby uzyskać igłę o średnicy 20 μm pod stereoskopem z okularem mikrometrycznym.</li>
	<li>Użyj tokarki z mokrym gumowym kołowrotkiem, aby naostrzyć igłę i uzyskać skos 20 μm (rysunki 1C i 1D). Uwaga: Ostre, skośne igły poprawiają łatwość wprowadzania do komory, a tym samym minimalizują uszkodzenia tkanki i umożliwiają ponowne uszczelnienie perforowanego mięśnia po wyjęciu igły (ryc. 1E-G).</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu Morpholino
<ol>
	<li>Przygotować wywar z morfolino, rozpuszczając liofilizowaną morfolinę w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 7,5 mM. [Szczegółowe informacje można znaleźć w instrukcjach producenta (tabela materiałów)].</li>
	<li>Przygotować roztwór do wstrzykiwań morfolino, mieszając 2,5 μl roztworu podstawowego morfolino (7,5 mM) z 2,8 μl roztworu podstawowego Endo-Portera (1 mM) (patrz tabela materiałów) w celu uzyskania końcowego stężenia 3,5 mM morfolino i 0,5 mM Endo-Porter.</li>
</ol>
3. Przygotowanie iniekcji Morpholino (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Załadować do igły ze skosu szklanego 5 μl tego roztworu za pomocą mikropipety z końcówką do pipet o pojemności 10 μl.</li>
	<li>Włóż szklaną igłę do uchwytu igły mikromanipulatora podłączonego do pneumatycznej pompy pico (rysunki 2A-C).</li>
	<li>Umieść uchwyt igły obok mikroskopu, tak aby igłę trzeba było przesunąć tylko w jednym płaskim kierunku, aby wprowadzić ją do komory serca larwy (ryc. 2A).</li>
	<li>Ustawić kąt wstrzyknięć na około 45°.</li>
	<li>Ustaw wartości mikrowtryskiwaczy w następujący sposób: ciśnienie podtrzymania: 20 funtów na cal kwadratowy (psi); ciśnienie wyrzutu: 15 psi; zakres bramkowania 100 ms, wartość okresu 1,9 (odpowiada 10,9 ms).</li>
	<li>Rozpuść agarozę w 1x PBS za pomocą standardowej kuchenki mikrofalowej, aby uzyskać 20 ml żelu o stężeniu 1,5% (w/v). Wlej stopiony żel do 10 cm szalki Petriego. Umieść rowkowaną formę iniekcyjną w ciepłej agarozie, tak aby po stwardnieniu agaroza miała bruzdy, w których zostanie umieszczona uspokojona larwa11 (ryc. 2D i 2E).</li>
</ol>
4. Zastrzyki (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Znieczulić larwy w 100 ml wody akwariowej za pomocą 20 mg/l trikainy (L-etylo-m-amino-benzoesanu-metanosulfonianu), aż przestaną reagować na dotyk.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety Pasteura ostrożnie przenieś uspokojoną larwę do rowka mokrej formy agarozowej, tak aby strona brzuszna była skierowana w stronę pionowej ścianki agarozy rowka (ryc. 3A).</li>
	<li>Umieścić płytkę agarozową pod mikroskopem stereoskopowym tak, aby komora była skierowana w stronę przeciwną do igły iniekcyjnej (ryc. 3A).</li>
	<li>Opuścić igłę, aby wprowadzić ją do komory serca. Igłę należy wprowadzić tylko na 1-2 μm do komory, uważając, aby nie włożyć igły zbyt głęboko (rysunki 3B i 3C).</li>
	<li>Po wprowadzeniu igły wstrzyknąć roztwór morfoliny do komory z 4-6 impulsami, z których każdy dostarcza 3 nl roztworu, z przerwami na odczekanie, aby umożliwić oczyszczenie serca (ryc. 3D i 3E).</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy wyjąć igłę (równolegle do płaszczyzny wprowadzenia), a następnie ostrożnie przenieść larwę za pomocą plastikowej pipety Pasteura wypełnionej pożywką E3 z powrotem na szalkę Petriego zawierającą świeżą pożywkę E3.</li>
	<li>Umieścić igłę na szalce Petriego zawierającej 1x PBS, aby zapobiec wysuszeniu igły podczas przenoszenia wstrzykniętej larwy.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 4.1-4.6 co 12-24 godziny przez cały czas trwania eksperymentu. Uwaga: Powtarzanie wstrzyknięć zapewnia wychwyt i utrzymanie morfolino w komórkach.</li>
</ol>
5. Analizy iniekcji (Rysunek 4)
<ol>
	<li>Znieczulić ryby w 100 ml wody akwariowej z 20 mg/l trikainy, aż przestaną reagować na dotyk.</li>
	<li>Umieść larwę bocznie na płaskiej, mokrej 1,5% (w/v) płytce agarozowej pokrytej podłożem E3.</li>
	<li>Obrazowanie larw za pomocą mikroskopu stereoskopowego z obrazowaniem w jasnym polu i fluorescencji. Uwaga: Ponieważ larwy są przezroczyste, znakowany fluoresceiną morfolino powinien być widoczny jako fluorescencyjny zielony kolor w naczyniach krwionośnych zwierzęcia bezpośrednio po wstrzyknięciu. Ta fluorescencja będzie dalej rozpraszać się w unaczynionych tkankach przez 15 minut (ryc. 4A-4C).</li>
</ol>
6. Ocena wzrostu regeneracyjnego
<ol>
	<li>Oceń przechwycone obrazy za pomocą bezpłatnego oprogramowania Fiji Image J (http://fiji.sc/Fiji). Aby zbadać regenerację, użyj narzędzia do śledzenia linii, aby określić ilość wzrostu regeneracyjnego, który wystąpił na larwie kontrolnej i wstrzykniętej morfolinie.</li>
	<li>Aby skalibrować obrazy, otwórz jeden z oryginalnych plików obrazów na Fidżi, przeciągając i upuszczając plik do głównego okna Fidżi.</li>
	<li>Aby ustawić skalę dla wszystkich poniższych obrazów, przejdź do "Analizuj" w menu głównym.</li>
	<li>W rozwijanym menu kliknij "Ustaw skalę".</li>
	<li>W tym oknie włącz opcję "Globalne", klikając pole wyboru.</li>
	<li>Teraz otwórz obraz, aby ponownie zmierzyć stopień wzrostu regeneracyjnego metodą przeciągnij i upuść (patrz krok 6.1).</li>
	<li>Wybierz narzędzie "zaznaczenia odręczne" na pasku narzędzi.</li>
	<li>Okrąż obszar, który ma być mierzony (rysunki 4J-4L).</li>
	<li>Naciśnij Ctrl+M. Spowoduje to otwarcie nowego okna "Wyniki" pokazującego wartość zakreślonego obszaru w kwadratowych pikselach.</li>
</ol>

<ol><li>Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6, 2011 (1998).</li>
<li>Skromne, I., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspectives+in+zebrafish+reverse+genetics%3A+moving+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward.</a> Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).</li>
<li>Zu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN-mediated+precise+genome+modification+by+homologous+recombination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish.</a> Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491, 114-118 (2012).</li>
<li>Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+gene+expression+in+the+adult+zebrafish+brain+using+cerebroventricular+microinjection+of+morpholino+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+adult+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+are+powerful+multipurose+vital+labeling+agents+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).</li>
<li>Madhavan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U%22%5BJournal%5D)">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).</li>
<li>Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilmour%2C+DT+%22Zebrafish%3A+a+practical+approach%22">Zebrafish: a practical approach</a>. 261, University Press. Oxford. 121-143 (2000).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+morpholino+experiments%3A+don%27t+stop+making+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135, 1735-1743 (2008).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Hyatt, T. M., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectors+and+techniques+for+ectopic+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).</li>
<li>Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+controlled+site-specific+recombination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li>
<li>Liu, S., D, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Re.+Pathol.+Mech.+Dis%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for cancer.</a> Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).</li>
<li>Stoick-Cooper, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Wnt+signaling+pathways+have+opposing+roles+in+appendage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration.</a> Development. 134, 479-489 (2007).</li>
<li>Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+targets+of+the+Sox+domain+proteins+Dichaete+in+the+Drosophila+CNS+via+targeted+expression+of+dominant+negative+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins.</a> BMC Dev. Biol. 13, (2013).</li>
<li>McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legless%2C+a+novel+mutation+found+in+PHT1-1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice.</a> Science. 241, 837-839 (1988).</li>
<li>Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+DNA+rearrangements+and+early+developmental+arrest+caused+by+DNA+insertion+in+transgenic+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wstrzyknięcie dokomorowe zapewnia szybką i wiarygodną metodę oceny funkcji genu na późniejszych etapach rozwoju lub homeostazy organizmu bez wpływu na funkcję genu podczas embriogenezy. Aby zapewnić powodzenie tej techniki, należy pamiętać o czterech krytycznych punktach: 1) rozmiarze igły, 2) wysychaniu igły, 3) minimalizacji objętości i 4) minimalnym czasie ekspozycji w roztworze uspokajającym. Zbyt małe igły będą się często zatykać, podczas gdy zbyt duże igły uszkodzą komorę i spowodują nadmierne krwawienie. Chociaż z...

Regeneracja organów i przydatków jest fundamentalnie ważna dla przetrwania i sprawności; jednak niektóre kręgowce, w tym człowiek, mają ograniczone zdolności regeneracyjne. Chociaż istnieje kilka modeli zwierzęcych, które mają duże zdolności regeneracyjne, techniki odwrotnej genetyki do oceny funkcji genów podczas regeneracji narządów i przydatków pozostają bardzo ograniczone lub nie istnieją. W związku z tym potrzebne są nowe podejścia do analizy biologii molekularnej regeneracji w tych organizmach modelowych.
Danio pręgowany jest dobrze znanym modelem do zrozumienia komórki i biologii molekularnej regeneracji narządów i przydatków1, nie tylko ze względu na jej znaczącą zdolność do regeneracji wielu organów, tkanek i przydatków, ale także dlatego, że istnieje kilka transgenicznych linii ryb do śledzenia komórek i nadekspresji konstruktów genów 2,3. Jednak hamowanie genów u larw danio pręgowanego ogranicza się głównie do nadekspresji konstruktów dominująco-ujemnych, które nie są dostępne dla wszystkich genów będących przedmiotem zainteresowania lub których produkt transgenu może uzyskać efekty wzmocnienia funkcji, które nie odzwierciedlają endogennej aktywności genu. W związku z tym, aby przezwyciężyć te problemy, potrzebna jest alternatywna metoda specyficznego usuwania ekspresji genów przez nokaut lub knockdown.
Celowanie specyficzne dla genu za pomocą TALENS istnieje jako odwrotny genetyczny sposób na wyeliminowanie funkcji genu; jednak ta strategia nokautu jest bardzo często ograniczona do oceny funkcjonalnej podczas wczesnej embriogenezy, ponieważ początkowe wymagania genu uniemożliwiają dalszy postęp rozwoju embrionalnego. W związku z tym badanie późniejszych zjawisk, takich jak regeneracja lub homeostaza narządów po rozwoju za pomocą TALENS, jest wykluczone 4,5. W związku z tym potrzebna jest alternatywna strategia usuwania genów, która jest ukierunkowana na funkcję genów po wczesnym rozwoju, aby ocenić wymagania dotyczące genów w pełni ukształtowanych narządach i strukturach.
Wykazano, że wstrzyknięcie morfolino jest skuteczne w celowaniu w geny w kilku dorosłych organach i dorosłej regenerującej się płetwie6-8, ale te metody wymagają elektroporacji, a wiele organów wewnętrznych jest trudnych do elektroportacji, czy to ze względu na ich lokalizację, czy ze względu na ich wrażliwość na zakłócenia elektryczne. Co więcej, niektóre tkanki larwy są trudne do bezpośredniego wstrzyknięcia, ponieważ bezpośrednie wstrzyknięcie może zakłócić ich integralność strukturalną lub dlatego, że ich rozmiar jest ograniczony. Płetwa ogonowa larwy jest jedną z takich struktur, ponieważ bezpośrednie wstrzyknięcie do fałdy płetwy nie jest możliwe. W związku z tym potrzebna była alternatywa dla elektroporacji i bezpośredniego wstrzykiwania, aby celować w geny w tkankach, które są albo zbyt małe do wstrzyknięcia, albo nie mogą być elektroporowane.
Aby namierzyć i zahamować funkcję określonych genów podczas regeneracji larwalnej płetwy ogonowej, zmodyfikowaliśmy istniejące technologie morpholino, umożliwiając ocenę funkcji genu podczas regeneracji płetwy ogonowej u późno rozwiniętych larw. Metoda ta polega na dokomorowym podawaniu9 morfolinos znakowanych fluoresceiną wraz z odczynnikiem do transfekcji Endo-Porter10. Po dostaniu się do komory mieszanina morpholino-Endo-Porter szybko rozprzestrzenia się po larwie przez układ naczyniowy i wnika do tkanek, które wcześniej były niemożliwe do namierzenia. Ta metoda iniekcji może być zmodyfikowana tak, aby celować w geny w określonych tkankach i całkiem możliwe, że może być zastosowana w innych modelach zwierzęcych, które obecnie nie mają odwrotnych metod genetycznych w celu zahamowania funkcji genów. W związku z tym oferuje szybką i łatwą metodę, która może znaleźć szerokie zastosowanie w celu natychmiastowego zbadania funkcji genów podczas ogólnej homeostazy i regeneracji narządów w stadiach larwalnych.

<table><tbody><tr><td>Morfolino z 3&ostrym; znacznik fluoresceiny</td><td>Gene Tools Inc.</td><td>Dostosowane</td><td>Więcej informacji w www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gene Tools Inc.</td><td></td><td>Więcej informacji na stronie www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Serva</td><td>120623</td><td>Do nalewania płytek w celu umieszczenia ryb podczas iniekcji i obrazowania</td></tr><tr><td>Trikaina (L-etylo-m-amino-benzatenosulfonian metanu)</td><td>Applichem</td><td></td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Podłoże E3 (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgSO4)</td><td></td><td></td><td>Do hodowli larw</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>821.472</td><td>Do umieszczania ryb podczas iniekcji i obrazowania</td></tr><tr><td>Cienkościenne szklane kapilary</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-3</td><td>Do przygotowania igieł iniekcyjnych</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5,242,956,003</td><td>Do ładowania igły</td></tr><tr><td>Pipety Pasteura (3 ml/1 ml)</td><td>Marka</td><td>747760/ 74775</td><td>Do przenoszenia larw</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Ściągacz do igieł</td><td>Sutter</td><td></td><td>Więcej informacji na stronie www.sutter.com</td></tr><tr><td>Zegarmistrz (Dumont) Pęseta (rozmiar 5)</td><td>Światowa precyzja Instrumenty, Inc.</td><td>501985</td><td>Aby zahamować igłę przed ostrzeniem</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Różni się w zależności od producenta</td><td>Część całego zestawu wtrysku</td></tr><tr><td>Kamera fluorescencyjna</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Różni się w zależności od producenta</td><td>Aby zobrazować fluorescencję po injeciton</td></tr><tr><td>Zestaw dysz PicoNozzle (uchwyt mikrowtryskiwacza)</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-12</td><td>Do mikroiniekcje</td></tr><tr><td>Pneumatyczna pompa PicoPump (mikrowtryskiwacz)</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>Do mikroiniekcji</td></tr></tbody></table>

odwrotne podejście genetyczne morpholino za pomocą wstrzyknięcia do komory serca w celu transfekcji wielu trudnych do namierzenia tkanek u larwy danio pręgowanego

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

Danio pręgowany jest ważnym modelem do zrozumienia komórki i biologii molekularnej regeneracji narządów i przydatków. Jednak strategie molekularne wykorzystujące genetykę odwrotną nie zostały jeszcze odpowiednio opracowane w celu oceny funkcji genów w regeneracji lub homeostazie tkanek w stadiach larwalnych po embriogenezie danio pręgowanego, a kilka tkanek w larwie danio pręgowanego jest trudnych do zlokalizowania. Wstrzyknięcia dokomorowe specyficznych dla genu morpholinos stanowią alternatywną metodę dla obecnej niezdolności do genomowego celowania w geny danio pręgowanego w sposób kontrolowany czasowo na tych etapach. Metoda ta pozwala na całkowite rozproszenie, a następnie włączenie morfoliny do różnych tkanek w całym ciele, w tym do struktur, do których wcześniej nie można było dotrzeć, takich jak te w larwalnej płetwie ogonowej, strukturze często wykorzystywanej do nieinwazyjnych badań nad regeneracją tkanek. Kilka genów aktywowanych podczas regeneracji fałdowania płetw larw jest również obecnych w regenerujących się tkankach dorosłych kręgowców, więc larwa jest użytecznym modelem do zrozumienia regeneracji u dorosłych. Ta metoda dyspersji morfolino pozwala na szybką i łatwą identyfikację genów niezbędnych do regeneracji tkanek larwalnych, a także innych zjawisk fizjologicznych regulujących homeostazę tkanek po embriogenezie. W związku z tym ta metoda dostarczania zapewnia obecnie potrzebną strategię kontroli czasowej do oceny funkcji genów po embriogenezie.

Ostrą, ściętą igłę do iniekcji można łatwo wprowadzić do komory serca larwy zebrafish, podchodząc od strony grzbietowej (Rysunek 3A). Serce nadal pompuje, a przepływ krwi jest utrzymany pomimo obecności igły (Rysunki 3B i 3C). Ostrożne iniekcje nie zaburzają morfologii komory ani skurczów serca (Rysunek 3D), pomimo wstrzyknięcia morfolino do serca (Rysunek 3E).
W ciągu kilku minut roztwór morpholino-Endo-Porte...

Adaptowalna metoda odwrotnej genetyki dla danio pręgowanego do oceny funkcji genów podczas późniejszych etapów rozwoju i fizjologicznej homeostazy, takich jak regeneracja tkanek za pomocą dokomorowych iniekcji specyficznych dla genu morpholinos.

Odwrotne podejście genetyczne morpholino za pomocą wstrzyknięcia do komory serca w celu transfekcji wielu trudnych do namierzenia tkanek u larwy danio pręgowanego

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie oligonukleotydów morpholino poprzez wstrzyknięcia do komory brzusznej u larw w celu wyciszenia genów i oceny ich funkcji podczas regeneracji. Jest to realizowane poprzez uprzednie znieczulenie larw i umieszczenie ich w rowku formy do immobilizacji. Następnie igłę do iniekcji wprowadza się do komory serca.Następnie roztwór morpholino wstrzykuje się od czterech do sześciu razy do komory z przerwami między impulsami, aby umożliwić oczyszczenie serca. Na koniec amputuje się płetwę grzbietową i pozostawia ją do regeneracji na trzy dni. Ostatecznie wpływ na regenerację płetwy można ocenić, mierząc obszar zregenerowanej płetwy za pomocą narzędzia do śledzenia linii w oprogramowaniu open source Fiji ImageJ.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transgeneza czy mutogeneza, jest możliwość wyciszenia genów za pomocą morphino w tkankach larwalnych, które nie nadają się do bezpośrednich iniekcji. Używając kapilar szklanych o średnicy 0,75 mm, umieść jedną z nich w wyciągaczu do igieł i wyciągnij igłę przy następujących parametrach; następnie za pomocą pęsety zegarmistrzowskiej i pod stereomikroskopem z okularem mikrometrycznym odłam wyciągniętą kapilarę, aby uzyskać igłę o średnicy 20 µm. Następnie użyj tokarki z gumowym kołem szlifierskim, aby zaostrzyć igłę i wykonać skos o szerokości 20 µm. Przygotuj roztwór stok morphino, rozpuszczając liofilizowane Morpho w 1x PBS do stężenia końcowego 7,5 mM.Przygotuj roztwór do wstrzykiwania Morpho, łącząc 2,5 µL roztworu stokowego Morpho z 2,8 µL 1 mM roztworu stokowego endo Porter, aby uzyskać końcowe stężenia 3,5 mM morph i 0,5 mM endo porter niezbędne do wykonania wstrzyknięć. Za pomocą mikropipety z końcówką 10 µL pobierz 5 µL roztworu morpho do ściętej szklanej igły. Następnie umieść szklaną igłę w uchwycie mikromanipulatora połączonego z pneumatyczną pompą pico.Ustaw kąt wstrzykiwania na około 45 stopni, aby igła wymagała przemieszczania się tylko w jednym kierunku płaszczyzny. Następnie ustaw wartości mikroinjektora w następujący sposób: ciśnienie podtrzymujące (hold pressure) na 20 pounds per square inch lub PSI, ciśnienie wyrzutu (ejection pressure) na 15 PSIA, zakres bramkowania (gating) na 100 millisecond oraz wartość okresu na 1,9, co odpowiada 10,9 milliseconds. Przygotuj 20 milliliters roztopionego 1,5% agarose w 1X PBS i wlej go do 10 centimeter szalki Petriego.Następnie należy umieścić rowkowaną formę w ciepłym agarze, aby utworzyć bruzdy w stężałym żelu służące do znieczulenia larw. Umieść je w 100 mililitrach wody akwariowej z dodatkiem 20 miligramów na litr tricanu. Po ustaniu reakcji na dotyk, użyj plastikowej pipety Pasteura, aby ostrożnie przenieść larwę do rowka wilgotnej formy z agaru w taki sposób, aby strona brzuszna była skierowana w stronę pionowej ścianki rowka.Umieść płytkę aros pod stereomikroskopem tak, aby komora serca była skierowana w stronę przeciwną do igły do iniekcji. Następnie opuść igłę i wprowadź ją na głębokość około 1-2 µm do komory serca, uważając, aby nie wprowadzić jej zbyt głęboko.Następnie wstrzyknij impuls 3 nL roztworu Morpho do komory brzusznej i odczekaj do czasu oczyszczenia serca, po czym powtórz czynność, podając pięć kolejnych impulsów. Wyjmij igłę i umieść ją w szalce Petriego zawierającej 1x PBS, aby zapobiec jej wyschnięciu. Następnie, używając pipety transferowej wypełnionej pożywką E3, ostrożnie przenieś larwy z powrotem do szalki Petriego z nową pożywką E3, aby zapewnić wchłanianie i utrzymanie morpholino w komórkach. Powtarzaj iniekcje co 12–24 h przez cały czas trwania eksperymentu w celu oceny skuteczności wstrzyknięć.Po znieczuleniu ryb należy umieścić je na płaskiej, wilgotnej płytce Aros pokrytej medium E3, a następnie obrazować za pomocą stereomikroskopu z oświetleniem w polu jasnym i fluorescencją. Obrazy pod kątem regeneracji należy analizować w darmowym oprogramowaniu Fiji Image J, wykorzystując narzędzie do śledzenia linii (line tracing tool) w celu określenia stopnia wzrostu regeneracyjnego. W pierwszej kolejności należy skalibrować obrazy, przeciągając i upuszczając plik do głównego okna Fiji w menu głównym.Ustaw skalę dla wszystkich obrazów, klikając opcję analyze w menu rozwijanym. Kliknij set scale, a następnie włącz opcję globalną, zaznaczając odpowiednie pole wyboru. Teraz ponownie przeciągnij i upuść obraz, aby zmierzyć ilość wzrostu regeneracyjnego za pomocą paska narzędzi.Wybierz narzędzie zaznaczania swobodnego i obrysuj obszar do pomiaru. Na koniec naciśnij Ctrl M. Spowoduje to otwarcie nowego okna z wynikami, wyświetlającego wartość zaznaczonego obszaru w pikselach kwadratowych. Jak widać tutaj w ciągu kilku minut od iniekcji, roztwór morpho endo porter rozprowadza się w naczyniach krwionośnych do różnych tkanek, takich jak fałd płetwy i mózg, przez co najmniej 12 lub więcej godzin.Aby ocenić regenerację dystalnych struktur płetwy larwalnej, usunięto następujące elementy: dystalną końcówkę fałdu płetwy i rdzeń kręgowy, dystalny rdzeń, dystalny mięsień tułowia, który nie jest tutaj widoczny, oraz komórki pigmentowe, które są trudne do ukierunkowania poprzez bezpośrednią injekcję, lecz wydają się wchłaniać morpho po seryjnych injekcjach komorowych. W ten sposób metoda ta stosunkowo łatwo umożliwia dostarczenie morpho do tkanek, które są trudne do indywidualnego ukierunkowania, i pozwala na jednoczesną ocenę funkcji genów w kilku tkankach regenerującej się płetwy. Aby przeanalizować znaczenie konkretnych genów biorących udział w regeneracji, płetwa larwalna zostaje częściowo amputowana, a wszystkie tkanki, które wchłonęły morpho, zostają wycięte.Jak wykazano, fałd płetwy larwalnej regeneruje swoją strukturę w ciągu kilku dni po amputacji. W niniejszym badaniu zastosowanie morpholino celujących w geny niezbędne do regeneracji zaburzyło odpowiedź regeneracyjną w porównaniu z grupami kontrolnymi (niezastrzykniętymi oraz z morpholino niedopasowanym) po zakończeniu rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny regeneracji do zgłębiania mechanizmów molekularnych zaangażowanych w regenerację płetwy u danio pręgowanego.

reverse-genetic-morpholino-approach-using-cardiac-ventricular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Odwrotne podejście genetyczne z użyciem morfoliny za pomocą iniekcji do komory serca w celu transfekcji wielu trudnych do osiągnięcia tkanek u larw rybki klasztornej

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

Funkcja genu może zostać zamaskowana w eksperymentach polegających na utracie funkcji, jeśli następuje kompensacja przez inny gen. Model rybki danio (zebrafish) zapewnia relatywnie wysokoprzepustowy sposób ujawniania takiej redundancji funkcjonalnej w żywych embrionach.

Podejście genetyki odwrotnej do badania redundancji funkcjonalnej podczas embriogenezy

Opisano metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego w siatkówce dorosłego danio-zebry, która polega na dokonywaniu iniekcji domięśniowych morfolino antysensownych oraz ich elektroporacji do siatkówki. W wyniku tego procesu ekspresja białka jest wyciszona przez kilka dni, co umożliwia zbadanie roli tego białka w regenerującej się lub nienaruszonej siatkówce.

In vivo elektroporacja morfolin do siatkówki dorosłego danio pręgowanego

Protokół opisuje celowe obniżenie ekspresji genów u danio pręgowanego poprzez wstrzyknięcie morfoliny w ogon.

Wstrzyknięcie morfolino: metoda obniżania docelowej ekspresji genów w celu zbadania funkcji u danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

W tym artykule demonstrujemy metodę manipulowania ekspresją genów w komórkach komorowych dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego za pomocą antysensownych oligonukleotydów morfolino. Przedstawiamy tę metodę jako skuteczny i szybki protokół, który można wykorzystać do badań funkcjonalnych w mózgu dorosłego kręgowca.

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Po uformowaniu się rurki neuralnej neuroepithelium ulega zwężeniu i fałdowaniu, podczas gdy rurka wypełnia się embrionalnym płynem mózgowo-rdzeniowym (eCSF), tworząc embrionalne komory mózgu. Opracowaliśmy tę technikę wstrzykiwania do komór, aby lepiej wizualizować wypełnioną płynem przestrzeń w kontraście do kształtu neuroepithelium w żywym embrionie.

Iniekcja do komór mózgowych danio pręgowanego

W niniejszym materiale przedstawiamy sposób wykonywania iniekcji do zatoki nadoczodołowej u dorosłych rybek zebrafish.

Iniekcja zaoczna u dorosłych danio pręgowanych

Poznaj metodę odwrotnej genetyki z użyciem morfolinów do wstrzyknięć do komory serca u larw Danio rerio. Technika umożliwia badanie funkcji genów podczas regeneracji tkanek.

Odwrotne podejście genetyczne morpholino za pomocą wstrzyknięcia do komory serca w celu transfekcji wielu trudnych do namierzenia tkanek u larwy danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Odwrotne podejście genetyczne morpholino za pomocą wstrzyknięcia do komory serca w celu transfekcji wielu trudnych do namierzenia tkanek u larwy danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów