Odwrotne podejście genetyczne morpholino za pomocą wstrzyknięcia do komory serca w celu transfekcji wielu trudnych do namierzenia tkanek u larwy danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie oligonukleotydów morpholino poprzez wstrzyknięcia do komory brzusznej u larw w celu wyciszenia genów i oceny ich funkcji podczas regeneracji. Jest to realizowane poprzez uprzednie znieczulenie larw i umieszczenie ich w rowku formy do immobilizacji. Następnie igłę do iniekcji wprowadza się do komory serca.

Następnie roztwór morpholino wstrzykuje się od czterech do sześciu razy do komory z przerwami między impulsami, aby umożliwić oczyszczenie serca. Na koniec amputuje się płetwę grzbietową i pozostawia ją do regeneracji na trzy dni. Ostatecznie wpływ na regenerację płetwy można ocenić, mierząc obszar zregenerowanej płetwy za pomocą narzędzia do śledzenia linii w oprogramowaniu open source Fiji ImageJ.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transgeneza czy mutogeneza, jest możliwość wyciszenia genów za pomocą morphino w tkankach larwalnych, które nie nadają się do bezpośrednich iniekcji. Używając kapilar szklanych o średnicy 0,75 mm, umieść jedną z nich w wyciągaczu do igieł i wyciągnij igłę przy następujących parametrach; następnie za pomocą pęsety zegarmistrzowskiej i pod stereomikroskopem z okularem mikrometrycznym odłam wyciągniętą kapilarę, aby uzyskać igłę o średnicy 20 µm. Następnie użyj tokarki z gumowym kołem szlifierskim, aby zaostrzyć igłę i wykonać skos o szerokości 20 µm. Przygotuj roztwór stok morphino, rozpuszczając liofilizowane Morpho w 1x PBS do stężenia końcowego 7,5 mM.

Przygotuj roztwór do wstrzykiwania Morpho, łącząc 2,5 µL roztworu stokowego Morpho z 2,8 µL 1 mM roztworu stokowego endo Porter, aby uzyskać końcowe stężenia 3,5 mM morph i 0,5 mM endo porter niezbędne do wykonania wstrzyknięć. Za pomocą mikropipety z końcówką 10 µL pobierz 5 µL roztworu morpho do ściętej szklanej igły. Następnie umieść szklaną igłę w uchwycie mikromanipulatora połączonego z pneumatyczną pompą pico.

Ustaw kąt wstrzykiwania na około 45 stopni, aby igła wymagała przemieszczania się tylko w jednym kierunku płaszczyzny. Następnie ustaw wartości mikroinjektora w następujący sposób: ciśnienie podtrzymujące (hold pressure) na 20 pounds per square inch lub PSI, ciśnienie wyrzutu (ejection pressure) na 15 PSIA, zakres bramkowania (gating) na 100 millisecond oraz wartość okresu na 1,9, co odpowiada 10,9 milliseconds. Przygotuj 20 milliliters roztopionego 1,5% agarose w 1X PBS i wlej go do 10 centimeter szalki Petriego.

Następnie należy umieścić rowkowaną formę w ciepłym agarze, aby utworzyć bruzdy w stężałym żelu służące do znieczulenia larw. Umieść je w 100 mililitrach wody akwariowej z dodatkiem 20 miligramów na litr tricanu. Po ustaniu reakcji na dotyk, użyj plastikowej pipety Pasteura, aby ostrożnie przenieść larwę do rowka wilgotnej formy z agaru w taki sposób, aby strona brzuszna była skierowana w stronę pionowej ścianki rowka.

Umieść płytkę aros pod stereomikroskopem tak, aby komora serca była skierowana w stronę przeciwną do igły do iniekcji. Następnie opuść igłę i wprowadź ją na głębokość około 1-2 µm do komory serca, uważając, aby nie wprowadzić jej zbyt głęboko.

Następnie wstrzyknij impuls 3 nL roztworu Morpho do komory brzusznej i odczekaj do czasu oczyszczenia serca, po czym powtórz czynność, podając pięć kolejnych impulsów. Wyjmij igłę i umieść ją w szalce Petriego zawierającej 1x PBS, aby zapobiec jej wyschnięciu. Następnie, używając pipety transferowej wypełnionej pożywką E3, ostrożnie przenieś larwy z powrotem do szalki Petriego z nową pożywką E3, aby zapewnić wchłanianie i utrzymanie morpholino w komórkach. Powtarzaj iniekcje co 12–24 h przez cały czas trwania eksperymentu w celu oceny skuteczności wstrzyknięć.

Po znieczuleniu ryb należy umieścić je na płaskiej, wilgotnej płytce Aros pokrytej medium E3, a następnie obrazować za pomocą stereomikroskopu z oświetleniem w polu jasnym i fluorescencją. Obrazy pod kątem regeneracji należy analizować w darmowym oprogramowaniu Fiji Image J, wykorzystując narzędzie do śledzenia linii (line tracing tool) w celu określenia stopnia wzrostu regeneracyjnego. W pierwszej kolejności należy skalibrować obrazy, przeciągając i upuszczając plik do głównego okna Fiji w menu głównym.

Ustaw skalę dla wszystkich obrazów, klikając opcję analyze w menu rozwijanym. Kliknij set scale, a następnie włącz opcję globalną, zaznaczając odpowiednie pole wyboru. Teraz ponownie przeciągnij i upuść obraz, aby zmierzyć ilość wzrostu regeneracyjnego za pomocą paska narzędzi.

Wybierz narzędzie zaznaczania swobodnego i obrysuj obszar do pomiaru. Na koniec naciśnij Ctrl M. Spowoduje to otwarcie nowego okna z wynikami, wyświetlającego wartość zaznaczonego obszaru w pikselach kwadratowych. Jak widać tutaj w ciągu kilku minut od iniekcji, roztwór morpho endo porter rozprowadza się w naczyniach krwionośnych do różnych tkanek, takich jak fałd płetwy i mózg, przez co najmniej 12 lub więcej godzin.

Aby ocenić regenerację dystalnych struktur płetwy larwalnej, usunięto następujące elementy: dystalną końcówkę fałdu płetwy i rdzeń kręgowy, dystalny rdzeń, dystalny mięsień tułowia, który nie jest tutaj widoczny, oraz komórki pigmentowe, które są trudne do ukierunkowania poprzez bezpośrednią injekcję, lecz wydają się wchłaniać morpho po seryjnych injekcjach komorowych. W ten sposób metoda ta stosunkowo łatwo umożliwia dostarczenie morpho do tkanek, które są trudne do indywidualnego ukierunkowania, i pozwala na jednoczesną ocenę funkcji genów w kilku tkankach regenerującej się płetwy. Aby przeanalizować znaczenie konkretnych genów biorących udział w regeneracji, płetwa larwalna zostaje częściowo amputowana, a wszystkie tkanki, które wchłonęły morpho, zostają wycięte.

Jak wykazano, fałd płetwy larwalnej regeneruje swoją strukturę w ciągu kilku dni po amputacji. W niniejszym badaniu zastosowanie morpholino celujących w geny niezbędne do regeneracji zaburzyło odpowiedź regeneracyjną w porównaniu z grupami kontrolnymi (niezastrzykniętymi oraz z morpholino niedopasowanym) po zakończeniu rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny regeneracji do zgłębiania mechanizmów molekularnych zaangażowanych w regenerację płetwy u danio pręgowanego.