Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus

Opisujemy system oocytów i czapeczek zwierzęcych Xenopus do klonowania ekspresji genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie i omawiamy techniki późniejszej analizy takich genów. System ten jest przydatny w funkcjonalnej identyfikacji szerokiej gamy produktów genowych.

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie oocytu Xenopus, systemu czapeczek zwierzęcych, odpowiedniego do identyfikacji produktów genowych zdolnych do wywołania odpowiedzi w odpowiedniej ektodermie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwojowej, takie jak to, jakie geny są niezbędne do wywołania odpowiedzi indukcyjnej. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie oocytu Xenopus jako systemu ekspresji do produkcji i identyfikacji induktorów działających na tkankę docelową, a nawet genów działających przed induktorami.

Wizualna demonstracja tej metody jest niezwykle przydatna, ponieważ etapy sekcji i rekombinacji są w dużym stopniu zależne od etapu i wymagają wyrafinowanej techniki. Po pobraniu tkanki jajnikowej od znieczulonych samic żaby, rozerwij tkankę na małe kawałki, z których każdy zawiera około 10 do 20 oocytów. I przenieś te fragmenty, najpierw do świeżego roztworu OR2, a następnie do 2,0 miligramów kolagenazy zawierającej OR2 na mililitr A. Kontynuuj, delikatnie mieszając mieszaninę zawierającą tkankę na wytrząsarce przez godzinę.

Następnie przenieś fragmenty do świeżego roztworu kolagenazy i mieszaj przez dodatkową godzinę. Należy spodziewać się obserwacji zdelokkulowanych komórek jajowych pod koniec tego leczenia. Przystąp do mycia oocytów 10 razy w pełnym OR2, a następnie dwukrotnie w pożywce do hodowli oocytów, w skrócie OCM.

Następnie umieść oocyty w świeżym OCM i obejrzyj je wizualnie pod mikroskopem preparacyjnym. Wyizoluj je na etapie szóstym, odrzucając mniejsze, niedojrzałe oocyty. Następnie umieść oocyty na pokrytej agarozą szalce Petriego zawierającej OCM i utrzymuj je w temperaturze od 18 do 20 stopni Celsjusza do momentu wstrzyknięcia.

Aby przygotować się do mikroiniekcji, umieść szklaną rurkę kapilarną w ściągaczu do igieł, pociągnij ją, a następnie oderwij końcówki od szkła, aby wytworzyć igły o średnicy około 20 mikrometrów. Na mikroskopie złożonym zmierz końcówki igieł za pomocą skalibrowanego mikrometru ocznego. Następnie wepchnij glinę w jednolitą warstwę na dnie szalki Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów.

A następnie utwórz równoległe rowki w tej warstwie za pomocą narzędzia przypominającego sondę w centrum handlowym. Napełnij wyłożone gliną naczynie około 2 mililitrami 3% Ficollu w 1x zmodyfikowanej soli Barth's lub MBS. A następnie przenieś do niego oocyty za pomocą pipety o szerokim otworze.

Umieść oocyty w zagajnikach tak, aby były utrzymywane na miejscu podczas kolejnego mikroiniekcji. Za pomocą mikrowstrzykiwacza napełnij igłę około dwoma mikrolitrami wcześniej wygenerowanej puli mRNA i wyreguluj równowagę, aby wytworzyć lekkie nadciśnienie, które zapobiegnie wciągnięciu cytoplazmy oocytów do igły podczas wstrzykiwania. Następnie wstrzyknij każdemu oocytowi 20 nanolitrów RNA w regionie równikowym.

Następnie pozostaw oocyty w Ficoll MBS na godzinę, a następnie delikatnie przenieś je do 1x MBS. Kontynuuj inkubację oocytów przez osiem do 24 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć test czapki zwierzęcej, zbierz 3/4 razy normalną pożywkę, w skrócie roztwór NANAM, cienkie kleszcze, pętlę do włosów, wcześniej wstrzyknięte oocyty i zarodki xenopus na etapie od 11 do 11,5.

Następnie rozbij szklaną pokrywę na fragmenty o wymiarach około jednego milimetra na dwa milimetry i przepuść te kawałki przez płomień, aż ich krawędzie wypolerują i naciągną. Następnie wyciśnij glinę w jedną warstwę w naczyniu, jak opisano wcześniej. I użyj sondy mall, aby stworzyć indywidualne odciski w kształcie miseczki w tej powłoce.

Przystąp do napełniania naczynia około dwoma mililitrami 3/4x NAM. I do niego przenieś wstrzyknięte oocyty, ustawiając kilka tak, aby każdy był unieruchomiony w jednym wgłębieniu. Aby przygotować zarodki, przenieś je do naczynia zawierającego 3/4x roztwór NAM.

Należy wybrać podzbiór gastruli, który ma być użyty jako kontrola stopnia zaawansowania dla wieku ektodermy i przenieść je do innego naczynia zawierającego ten sam roztwór. I odłóż ten talerz na bok. W przypadku zarodków, które będą używane w kapturku zwierzęcym, należy usunąć ich błony witelinowe za pomocą dwóch par cienkich kleszczy.

Następnie przenieś gastrulę do wyłożonego gliną naczynia z oocytami. Na początek odetnij zwierzęce kapelusze od zarodków za pomocą dwóch par cienkich forecepsów, uważając, aby uniknąć tkanki równikowej. Aby wygenerować rekombinanty przy użyciu pierwszej metody, umieść czapeczki zwierzęce tak, aby wewnętrzna powierzchnia stykała się z półkulą zwierzęcą oocytu, już umieszczoną we wgłębieniu.

I powtórz ten proces dla kilku wstrzykniętych oocytów. Aby upewnić się, że te rekombinanty są trzymane razem, umieść zakrzywiony szklany fragment szkiełka nakrywkowego na każdym z nich i naciskaj w dół, aż zwierzę zostanie spłaszczone, a szkiełko nakrywkowe zetknie się z gliną. Aby wygenerować rekombinanty przy użyciu drugiej metody, umieść razem kapelusze zwierzęce i oocyty w pustych pojedynczych wgłębieniach w glinie.

I upewnij się, że wewnętrzne powierzchnie czapek zwierzęcych są skierowane w stronę oocytu. Następnie zabezpiecz obie tkanki razem za pomocą małych przedłużek gliny. Po wygenerowaniu wielu rekombinantów przy użyciu dowolnej metody, należy przeprowadzić hodowlę i odłogowane zarodki kontrolne w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Gdy zarodki kontrolne osiągną pożądane stadium, należy usunąć szkiełka nakrywkowe z rekombinantów i wyizolować ektodermę kapelusza zwierzęcego za pomocą kleszczy i pętli do włosów. Kontynuuj utrwalanie obu fragmentów ektodermalnych i kontrolnych zarodków w MEMFA przez jedną godzinę. I przenieś je do etanolu i przechowuj tę tkankę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

W tym przypadku zestawom oocytów wstrzyknięto pule mRNA odpowiadające coraz mniejszej liczbie klonów lub kolonii, a następnie hodowano je za pomocą czapek zwierzęcych. Następnie określono liczbę czapek zwierzęcych w każdym zestawie wyrażających foxe3, marker zwykle obserwowany w przypuszczalnej ektodermie soczewki od wczesnych etapów płytki nerwowej do tworzenia pęcherzyków i zastosowanie tutaj, w celu oceny zdolności indukowania soczewki. Metoda ta zidentyfikowała gen kodujący czynnik jądrowy, ldb1, który może wywołać odpowiedź indukującą soczewkę w 50 ze 179 lub 28% ocenianych czapek zwierzęcych.

Pokazane tutaj nasze obrazy hybrydyzacji in situ, przedstawiające sygnał foxe3, oznaczony grotami strzałek, w zwierzęcych czapkach hodowanych z oocytami wstrzykniętymi ldb1 od mniej więcej stadium 11 do stadium 23. Nie obserwuje się ekspresji foxe3 w odpowiednich kontrolnych kapturkach zwierzęcych umieszczonych na niewstrzykniętych oocytach. Kiedy wyprodukowano skrawki z tych zwierzęcych czapek, ekspresję foxe3 zaobserwowano zarówno w wewnętrznej, jak i zewnętrznej warstwie ektodermalnej.

Ekspresja w warstwie wewnętrznej jest charakterystyczna dla reakcji soczewki. Lub, jak sygnalizowano w obu warstwach, wskazuje na inne struktury, takie jak plakod węchowy. Po tej procedurze można przeprowadzić metody takie jak immunohistochemia, hybrydyzacja in situ lub bezpośrednie wykrywanie fluorescencyjnego genu reporterowego, w celu oceny odpowiedzi indukcyjnej w ektodermie kapelusza zwierzęcego.