Name: Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj metodę klonowania funkcjonalnego przy użyciu oocytów Xenopus do analizy genów indukujących odpowiedź w ektodermie. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów regulacji genów w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Grant Rozwoju Zawodowego dla C.Z.P. z Fundacji Uniwersytetu Shepherd. Autorzy pragną podziękować Brettowi Zirkle i Malii Deshotel za pomocne dyskusje na temat protokołów oraz dr Carol Hurney za hojną pomoc.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wirginii.
Uwaga: Rysunek 1 pokazuje schematyczny przegląd procedur eksperymentalnych.
1. Przygotowanie oocytów
<ol>
	<li>Samice X. laevis przed zaszczepieniem ze 150 j. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) na około tydzień przed izolacją oocytów. Wstrzyknąć 1 ml 150 j./ml PMSG do grzbietowego worka chłonnego za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 29 G.</li>
	<li>Przygotować roztwory do wstrzyknięcia oocytu i testu oocyty-kapturek.
	<ol>
		<li>Przygotować wolne od Ca++/Mg++ OR2 (OR2-): 82 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,5 mM Na2HPO4, 50 mM HEPES pH 7,2.</li>
		<li>Przygotować OR2: OR2- plus 1 mM CaCl2 i 1 mM MgCl2.</li>
		<li>Przygotować OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg/ml BSA, 100 μg/ml Gentamycyny, pH 7,8.</li>
		<li>Przygotuj 1x MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM HEPES (pH 7,8), 2,5 mM NaHCO3.</li>
		<li>Przygotuj 3% Ficoll w 1x MBS.</li>
		<li>Przygotować 1x NAM: 110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca(NO3)2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO3, 2 mM Na3PO4, pH 7,4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulić samicę w 0,03% roztworze soli metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (MS222) w 0,1 x MBS (najpierw rozpuść 0,3 g MS222 w 10 ml 95% etanolu, a następnie rozcieńczyć w 1 l 0,1 x MBS), umieszczając żabę w roztworze na 10 - 15 minut lub do momentu, gdy przestanie reagować.
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy znieczulenie zostało zakończone, obracając znieczuloną żabę na plecy, aby upewnić się, że nie reaguje (niecałkowicie znieczulone żaby poruszają kończynami lub przewracają ciało).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chirurgicznie wyizoluj fragmenty jajnika, wykonując nacięcie brzucha przez skórę i ścianę ciała za pomocą ostrza skalpela, izolując tkankę jajnika za pomocą kleszczy i nożyczek. Umieść fragmenty jajników w OR2-. Zamknij ścianę ciała jedwabnym szwem 3-0 na zakrzywionej igle 24 mm i zamknij skórę osobno tymi samymi szwami. Umożliwiają odzysk samicy w 1 g / L soli akwariowej w wodzie.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczyków rozerwij tkankę jajnika na małe (10 - 20 oocytów) kawałki i przenieś do świeżego OR2-.</li>
	<li>Odblokować fragmenty jajników w 2,0 mg/ml kolagenazy A w OR2- delikatnie mieszając na wytrząsarce przez 1 godzinę, przenosząc do świeżej kolagenazy i mieszając przez dodatkową godzinę.</li>
	<li>Umyj oocyty 10 razy w OR2 [zawierającym Ca++/Mg++], odrzucając mniejsze oocyty.</li>
	<li>Umyj oocyty w OCM dwa razy i przenieś do świeżego OCM. Wyizoluj oocyty w stadium VI według wielkości po oględzinach i odrzuć niedojrzałe (mniejsze) oocyty: oocyty w stadium VI są większe niż niedojrzałe oocyty z równomierną pigmentacją w półkuli zwierzęcej i mają średnicę około 1,2-1,4 mm.</li>
	<li>Przed wstrzyknięciem należy utrzymać oocyty w temperaturze 18 - 20 °C w OCM. Uwaga: Szalki Petriego pokryte agarozą mogą być używane w celu zminimalizowania przywierania oocytów do szalki.</li>
</ol>
2. Wstrzykiwanie transkrypcji bibliotecznych
<ol>
	<li>Przygotuj kierunkową bibliotekę cDNA15 przy użyciu RNA wyekstrahowanego na odpowiednim etapie rozwoju (na przykład stadium płytki nerwowej 1410). Kup bibliotekę cDNA lub skonstruuj ją za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z przeglądem w czterech poniższych krokach.
	<ol>
		<li>Wyizolować około 5 μg mRNA, używając produktu do wzbogacania o poli(A)+ RNA (patrz tabela materiałów) i postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Uwaga: Transkrypty, które mają być użyte do wytworzenia biblioteki cDNA, mogą być ograniczone do tkanki indukującej (takiej jak płytka nerwowa, po mikrodysekcji pożądanej tkanki) lub mogą pochodzić z całych zarodków na określonym etapie.</li>
		<li>Wyprodukuj cDNA za pomocą komercyjnego zestawu, postępując zgodnie ze wskazówkami producenta.</li>
		<li>Związać około 20 ng cDNA do wektora dołączonego do zestawu handlowego lub innego odpowiedniego wektora. Odpowiedni wektor plazmidowy obejmuje sekwencje zapewniające stabilność mRNA, takie jak sekwencje 5' β-globiny i 3 sekwencje poli(A) (pCS2+, pTnT, pCS105).</li>
		<li>Przekształć ligację w kompetentne komórki bakteryjne przy użyciu zalecanego przez dostawcę protokołu transformacji szoku cieplnego. 
		Uwaga: Alternatywnie, kolekcja klonów z otwartą ramką odczytu (ORFeome) jest dostępna na rynku i może być używana do generowania transkrypcji do wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 10 pul plazmidów o złożoności 103 do 104 (104 do 105 całkowitej złożoności). Odpowiada to 10 płytkom z 1 000 - 10 000 kolonii każda.
	<ol>
		<li>Hodowlę z biblioteki płytek na 10 15-centymetrowych płytkach LB-ampicyliny, wzrost 12 - 18 godzin w temperaturze 37 °C i zebranie kolonii z każdej z nich przez delikatny nacisk za pomocą szklanego rozsiewacza w 7 ml LB.</li>
		<li>Przygotować bulion glicerolowy z 0,5 ml (dodać do 0,2 ml sterylnego glicerolu i przechowywać w temperaturze -20 °C), a pozostałe 6,5 ml wykorzystać do przygotowania DNA za pomocą standardowego, dostępnego w handlu zestawu do minipreparatyki DNA, postępując zgodnie ze wskazówkami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Linearyzować zgrupowany plazmidowy DNA (1,0 - 2,0 μg) za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnegotrawienia 16 w temperaturze 37 °C przez 1 - 1,5 godziny. Wyizolować zlinearyzowane DNA za pomocą ekstrakcji fenol/chloroform, a następnie wytrącić etanol i ponownie zawiesić w wodzie zgodnie ze specyfikacją zastosowanego zestawu polimerazy RNA. Zsyntetyzuj sens RNA za pomocą komercyjnego zestawu polimerazy RNA zgodnie ze wskazówkami producenta.</li>
	<li>Przygotować igły do mikroiniekcji (za pomocą ściągacza igieł ze szklaną rurką kapilarną) o średnicy około 20 μm; zmierzyć końcówki igieł pod mikroskopem złożonym za pomocą skalibrowanego mikrometru ocznego. Uwaga: Ustawienia ściągacza igieł muszą być empirycznie określone, aby wyprodukować igłę z cienką końcówką, tak aby po złamaniu drobnymi kleszczami dawała pożądany rozmiar końcówki.</li>
	<li>Przygotować (wepchnąć glinę w jednolitą warstwę na dnie naczynia) wyłożone gliną szalki Petriego o wymiarach 35 x 10 mm z równoległymi rowkami, aby utrzymać oocyty na miejscu podczas mikroiniekcji; wykonać rowki za pomocą sondy Mall lub pipety Pasteura stopionej na końcówce w płomieniu. Jako alternatywę dla gliny przygotuj naczynia agarozowe, wykonując wgłębienia za pomocą formy elastomerowej17. Przenieś oocyty za pomocą pipety o szerokim otworze do 3% Ficoll w 1X MBS (około 2 ml) w rzędach w naczyniach wyłożonych gliną.</li>
	<li>Za pomocą mikrowstrzykiwacza napełnij igłę 1 ng/nl RNA i wyreguluj równowagę, aby wytworzyć lekkie dodatnie ciśnienie (aby zapobiec tworzeniu się cytoplazmy oocytów).</li>
	<li>Wstrzyknąć oocyty z około 20 nl RNA w regionie równikowym. Odczekaj 1 godzinę, aż wstrzyknięte oocyty pozostaną w Ficoll-MBS, a następnie delikatnie przenieś do 1x MBS. Inkubować przez 8–24 godziny w temperaturze 20 °C przed badaniem czapek u zwierząt.</li>
</ol>
3. Test na czapeczkę zwierzęcą
<ol>
	<li>Przygotuj 3/4x NAM i uzyskaj cienkie kleszcze, pętlę do włosów, zakrzywione fragmenty szkiełek nakrywkowych, gliniane naczynia z wgłębieniami w kształcie miseczek do przechowywania oocytów. Wykonaj zakrzywione fragmenty szkiełka nakrywkowego, rozbijając szklane szkiełka nakrywkowe na małe fragmenty (około 1 - 2 mm x 2 - 4 mm) i przechodząc przez płomień, aż krawędzie wypolerują się i opadną, tworząc zakrzywiony kawałek.</li>
	<li>Zapłodnić jaja X. laevis 18 poprzez in vitro lub naturalne krycie i hodowlę do etapów gastruli (10 - 11 godzin po zapłodnieniu w RT) w 0,1x MBS przed sortowaniem według etapów; zebrać zarodki w połowie gastruli (stadium 11 - 11,5)10.</li>
	<li>Przenieś zarodki na szalkę Petriego wypełnioną mniej więcej do połowy z 3/4x NAM. Za pomocą dwóch par cienkich kleszczy usuń błonę zapłodnienia (witelinę) z gastrulae.</li>
	<li>Przenieś oocyty do 3/4x NAM (około 2 ml) w naczyniach wyłożonych gliną i unieruchamiaj w indywidualnych wyciskach w glinie, wytwarzając wyciski w celu pomieszczenia poszczególnych zarodków, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Przenieś zarodki do wyłożonych gliną naczyń i odetnij kapelusze zwierząt z gastrulae za pomocą dwóch par cienkich kleszczy. Należy uważać, aby wyizolować tylko ektodermę czapeczki zwierzęcej, a nie tkankę równikową18.</li>
	<li>Umieść zwierzęcą czapkę na półkuli zwierzęcej każdego oocytu, tak aby wewnętrzna powierzchnia kapturka zwierzęcia stykała się z oocytem. Trzymaj rekombinanty razem, nakładając zakrzywiony szklany fragment szkiełka nakrywkowego i wywierając nacisk w dół na szkło, spłaszczając ektodermę, gdy szkiełko nakrywkowe styka się z gliną (nakrętki zwierzęce mogą pozostać otwarte z wewnętrzną warstwą wystawioną na powierzchnię oocytu przez 6 - 8 godzin lub dłużej). 
	Uwaga: Alternatywnie umieść czapkę zwierzęcia w glinianym wgłębieniu jej wewnętrzną powierzchnią skierowaną do góry i umieść oocyt na czapce; Zabezpiecz rekombinant małymi przedłużeniami gliny.</li>
	<li>Hodowla w temperaturze 20 °C do momentu, gdy zarodki kontrolne osiągną pożądane stadium do oznaczenia.</li>
	<li>Oddzielić rekombinant, usuwając szkiełko nakrywkowe/glinkę i izolując ektodermę za pomocą kleszczy i pętli do włosów.</li>
	<li>Utrwal fragmenty ektodermalne przez 1 godzinę w MEMFA (3,8% formaldehydu w MEM [0,1 M MOPS pH 7,4, 2 mM EGTA i 1 mM MgSO4]).</li>
	<li>Przenieść fragmenty (i zarodki kontrolne) z MEMFA do etanolu i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
4. Analiza odpowiedzi w ektodermie przez hybrydyzację in situ (ISH)
<ol>
	<li>Przygotuj rozwiązania dla ISH.
	<ol>
		<li>Przygotuj 1x PBS: 0,01 M sól fizjologiczna buforowana fosforanem, NaCl 0,138 M, pH 7,4</li>
		<li>Przygotowanie PBS-Tween (PTw): 1x PBS, 0,1% Tween-20</li>
		<li>Przygotuj 100x roztwór Denharta: 2% BSA, 2% poliwinylopirolidon, 2% Ficoll</li>
		<li>Przygotuj bufor hybrydyzacyjny: 50% formamidu, 5x SSC, 1 mg/ml RNA drożdży torula, 1 μg/ml heparyny, 1x roztwór Denharta, 0,1% Tween-20, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA, DEPC-H2O</li>
		<li>Przygotuj bufor kwasu maleinowego (MAB): 100 mM kwas maleinowy, 150 mM NaCl, pH 7,5</li>
		<li>Przygotuj MAB + blok: MAB, 2% odczynnik blokujący (podgrzać do 60 °C do rozpuszczenia)</li>
		<li>Przygotuj bufor fosfatazy alkalicznej (AP): 100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween, dH2O</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj sondę RNA.
	<ol>
		<li>Korzystając z komercyjnego zestawu polimerazy RNA i mieszanki dig-NTP, dodaj do probówki o pojemności 1,5 ml (reakcja 50 μl): 25,5 μl DEPC-H2O, 10 μl 5X buforu transkrypcyjnego, 2,5 μl 10x mieszanka dig-NTP, 5 μl 100 mM DTT, 2 μl RNAsin, 2 μl zlinearyzowana matryca DNA (~1 μg/μl), 3 μl polimerazy RNA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 min.</li>
		<li>Dodać 2 μl polimerazy RNA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 min.</li>
		<li>Sprawdź 2 μl reakcji na 1% żelu agarozowym.</li>
		<li>Dodać 1 μl DNazy RQ1 bez RNaz i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Wytrącić sondę, dodając 50 μl DEPC-H2O, 25 μl 10 M octanu amonu i 313 μl etanolu. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc (O/N), a następnie odzyskać RNA przez odwirowanie w temperaturze 13 800 x g przez 20 minut. Umyć 500 μl 75% etanolu, krótko odwirować, usunąć etanol i pozostawić granulat do wyschnięcia na powietrzu. Dodać 50 μl DEPC-H2O.</li>
		<li>Dodać bufor hybrydyzacyjny do końcowego stężenia ~0,5 μg/μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj tkankę do hybrydyzacji. O ile nie zaznaczono inaczej, napełniać fiolki do góry przy każdej opisanej zmianie roztworu (około 4 ml).
	<ol>
		<li>Usuń etanol z fiolek i przenieś zarodki do 75% etanolu/PTw, a następnie 50% etanolu/PTw przez 10 minut każdy, poziomo na wahaczu.</li>
		<li>Umyj trzy razy w PTw przez 5 minut na bujaku.</li>
		<li>Przenieść do 10 μg/μl Leczenie proteinazą K w PTw; rurki skalne pionowo 15 min.</li>
		<li>Płukać dwa razy po 10 min w 0,1 M Trietanoloamina pH 7,8 - rurki skalne pionowo.</li>
		<li>Dodaj 12,5 μl bezwodnika octowego do probówek i miel pionowo przez 5 min. Powtórz z dodatkowymi 12,5 μl bezwodnika octowego przez 5 min.</li>
		<li>Prać w PTw 5 min pionowo na bujaku.</li>
		<li>Ponownie napraw w 4% paraformaldehydzie 20 min na bujaku. Bufor do hybrydyzacji cieplnej do 60 °C.</li>
		<li>Umyj trzy razy w PTw przez 5 minut na bujaku.</li>
		<li>Usuń wszystkie oprócz ~1 ml PTw z każdej probówki i dodaj 250 μl buforu Hyb; delikatnie zakręć probówkami do wymieszania. Rury skalne w pionie 5 min.</li>
		<li>Zastąp roztworem Hyb Buffer o temperaturze 60 °C (0,5 ml) i delikatnie mieszaj w temperaturze 60 °C przez 10 minut. Zastąp świeżym buforem Hyb i mieszaj w temperaturze 60 °C przez dwie do 4 godzin.</li>
		<li>Podgrzej sondę (1 ml przy 0,5 μg/μl w buforze Hyb) do 60 °C (3 min). Usuń Hyb Buffer i dodaj sondę do probówek. Delikatnie mieszać O/N w temperaturze 60 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj tkankę na przeciwciała.
	<ol>
		<li>Ciepły bufor Hyb i 2x SSC + 0,1% roztwory Tween-20 do 60 °C.</li>
		<li>Zastąp roztwór sondy buforem Hyb (zachowaj sondy w temperaturze -20 °C do 2-3 razy ponownego użycia). Prać w temperaturze 60 °C przez 10 min.</li>
		<li>Umyć trzykrotnie w temperaturze 60 °C w 2x SSC-Tween (po 20 minut z mieszaniem).</li>
		<li>Prać trzykrotnie w temperaturze 60 °C w 0,2x SSC-Tween (po 20 minut z mieszaniem).</li>
		<li>Umyj dwa razy w MAB (RT) przez 15 minut każdy poziomo na bujaku.</li>
		<li>Dodać 1 ml MAB + blok. Prać 2 godziny pionowo na bujaku.</li>
		<li>Przenieść do 1 ml MAB + bloku zawierającego 1/2 000 Anti-digoxygenin-AP. Kołysz pionowo w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj tkankę do odczynnika barwiącego.
	<ol>
		<li>Zastąp roztwór przeciwciała roztworem MAB; umyj trzy razy w MAB po 5 minut poziomo na kołysce.</li>
		<li>Umyj trzy razy w MAB po 1 godzinie, poziomo na bujaku.</li>
		<li>Umyj dwa razy w buforze AP po 10 minut poziomo na kołysce.</li>
		<li>Przenieś tkankę do wielodołkowej plastikowej tacki, usuń bufor AP i dodaj odczynnik BM Purple (~1 ml). Pozwól, aby reakcja postępowała w ciemności 5 minut do O/N.</li>
		<li>Po uzyskaniu odpowiedniego zabarwienia przenieś tkankę do fiolek z PTw. Umyj dwa razy po 10 minut w PTw na kołysce.</li>
		<li>Utrwalić w roztworze Bouina w temperaturze 4 °C O/N na wahaczu.</li>
		<li>Umyj Bouin's trzema praniami 70% etanolu/30% PTw w RT. Przejdź do przechwytywania obrazu za pomocą epi-illuminacji i kamery zamontowanej pod mikroskopem, wybielając w razie potrzeby18.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wybór i klonowanie Sib
<ol>
	<li>Wybierz pulę o najwyższej aktywności (największa odpowiedź w tkance ektodermalnej).</li>
	<li>Miareczkować (rozcieńczyć LB do odpowiedniej gęstości) zapas glicerolu dla puli o najwyższej aktywności i pokryć dziesięć nowych płytek około jedną dziesiątą kolonii z poprzedniego etapu (stosując sekcję 2 w powyższym protokole).</li>
	<li>Zmniejsz rozmiar puli, dopóki aktywność nie zostanie przypisana do pojedynczej kolonii.</li>
	<li>Uzyskać sekwencję DNA przy użyciu standardowych starterów w wektorze.</li>
</ol>

<ol><li>Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetic+Screens+in+Xenopus.+Using+Transposon-Mediated+Insertional+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).</li>
<li>Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+tropicalis.+as+a+Model+Organism+for+Genetics+and+Genomics%3A+Past%2C+Present+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).</li>
<li>Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Efficient+CRISPR%2FCas9-Mediated+Targeted+Mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51, 835-843 (2013).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis.</a> Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+Genetic+Studies+Using+Antisense+Morpholino+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).</li>
<li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injected+Xwnt-8.+RNA+acts+early+in+Xenopus.+embryos+to+promote+formation+of+a+vegetal+dorsalizing+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center.</a> Cell. 67, 753-765 (1991).</li>
<li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin.%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+in+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+of+induction+of+anterior+head+ectodermal+properties+in+Xenopus.+embryos+are+mediated+by+transcriptional+cofactor+ldb1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus.+ectoderm%3A+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Development. 112, 177-188 (1991).</li>
<li>Nieuwkoop, P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+P+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).</li>
<li>Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+Siamois.%2C+a+Xenopus.+homeobox+gene+expressed+in+dorsal-vegetal+cells+of+blastulae+and+able+to+induce+a+complete+secondary+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis.</a> Cell. 81, 85-94 (1995).</li>
<li>Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+a+Xenopus+T.-related+gene+%28Xombi.%29+involved+in+mesodermal+patterning+and+blastopore+lip+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation.</a> Development. 122, 4001-4012 (1996).</li>
<li>Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus.+dorsalizing+factor+Gremlin+identifies+a+novel+family+of+secreted+proteins+that+antagonize+BMP+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities.</a> Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).</li>
<li>Lustig, K., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+oocyte+expression+assay+to+reconstitute+inductive+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li>
<li>Viczian, A., Zuber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Determination+Using+the+Animal+Cap+Transplant+%28ACT%29+Assay+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis.</a> J. Vis. Exp. (39), e1932(2010).</li>
<li>Sive, H., Grainger, R., Harland, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+H+%22Early+development+of.Xenopus+laevis.%3A+A+laboratory+manual%22">Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).</li>
<li>Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+activation+during+early+stages+of+lens+induction+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus.</a> Development. 125, 3509-3519 (1998).</li>
<li>Medina-Martinez, O., Jamrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxe+view+of+lens+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Foxe view of lens development and disease.</a> Development. 134, 1455-1463 (2007).</li>
<li>Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+in+the+tetraploid+Xenopus.laevis.+enables+genome-wide+insight+in+a+classic+developmental+biology+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism.</a> Methods. 66, 398-409 (2014).</li>
<li>Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+large+set+of+full-length+clones+from+a+Xenopus+tropicalis+EST+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project.</a> Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).</li>
<li>Karpinka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus.+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signaling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PLoS ONE. , e79469(2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana tutaj metoda funkcjonalnego klonowania genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie może być wykorzystana do identyfikacji szerokiego zakresu produktów genowych. Metoda ta rozszerza wcześniejsze prace, łącząc testy indukujące tkanki z technikami klonowania ekspresji. Wykorzystujemy szlaki metaboliczne oocytu Xenopus jako źródło produkcji czynników indukujących, bezpośrednio lub pośrednio, po wstrzyknięciu RNA. To, w połączeniu z zastosowaniem uznanych metod klonowania genu będącego pr...

Zaawansowane podejścia genetyczne do identyfikacji genów będących przedmiotem zainteresowania na podstawie ich funkcji lub utraty funkcji1,2 są integralną częścią zrozumienia złożonych zdarzeń wzorcowych w rozwoju. W połączeniu z potężnymi technikami genetyki odwrotnej dostępnymi dla coraz szerszego wachlarza systemów i badaczy3-5, możliwe jest teraz zidentyfikowanie genów odgrywających kluczową rolę funkcjonalną w szlaku, a następnie wyjaśnienie, które funkcjonują na poziomie komórkowym i w interakcji z innymi produktami genowymi. Jednym z podejść do funkcjonalnej identyfikacji genów będących przedmiotem zainteresowania, które przyniosło wiele kluczowych odkryć w przeszłości, jest klonowanie ekspresji6,7.
Naszym ostatnim celem8 było zidentyfikowanie wczesnych czynników indukcyjnych soczewki, ponieważ wykazano, że początkowe etapy procesu indukcji soczewki kręgowców zachodzą już w stadium gastruli. W tym celu użyliśmy przejściowo kompetentnej ektodermy9 zwierzęcych czapek (etap 11-11,510) zarodków Xenopus jako tkanki reagującej na indukcję oraz oocytu Xenopus stadium VI jako źródła produkcji czynników indukujących.
Poniższy protokół opiera się na protokołach klonowania wyrażeń i selekcji sib Smitha i Harlanda6,7, z powodzeniem używanych również przez innych11-13. W naszym systemie ekspresji oocytów (po raz pierwszy wykorzystanym do produkcji czynników indukujących przez Lustiga i Kirschnera14) wybierane i identyfikowane są pule wstrzykniętych transkryptów zdolnych do bezpośredniego lub pośredniego powodowania oocytów do wytwarzania czynników wywołujących odpowiedź indukcyjną soczewki w ektodermie kapsowej zwierząt w postaci czapeczki zwierzęcej. Ponieważ system jest przydatny do bezpośredniej ekspresji wydzielanych cząsteczek indukujących (mRNA INHBB wstrzyknięte do oocytów powoduje indukcję mezodermy w ektodermie8 zwierząt kompetentnych dla mezodermy), pierwotnie spodziewaliśmy się, że procedura przesiewowa będzie przydatna głównie do identyfikacji czynników parakrynnych. Ponieważ jednak zidentyfikowaliśmy czynnik jądrowy na naszym ekranie (ldb18), jasne jest, że system może być używany do identyfikacji szerokiej gamy cząsteczek, takich jak transkrypcyjne lub translacyjne czynniki regulatorowe, miRNA, kofaktory lub czynniki jukstakrynowe.

<table><tbody><tr><td>12/101</td><td>Badania rozwojowe przeciwciał Bank Hybridoma 12</td><td>/101</td><td>Przeciwciało monoklonalne do wykrywania tkanki mięśniowej</td></tr><tr><td>20x bufor SSC</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>dla</td></tr><tr><td>bezwodnika octowego</td> ISH <td>Sigma</td><td>A6404</td><td>dla ISH</td></tr><tr><td>Anti-Dig-AP</td><td></td><td>Roche 11093274910</td><td>dla ISH</td></tr><tr><td>Aurum Plasmid Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6400</td><td>Oczyszczanie plazmidowego DNA</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>dla ISH</td></tr><tr><td>BM Purple</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td>dla pieca</td></tr><tr><td>do hybrydyzacji ISH Boekel</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-245-121</td><td>dla</td></tr><tr><td>roztworu ISH Bouina</td><td>Sigma</td><td>HT10132</td><td>dla ISH</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>dla OCM</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C3023</td><td>dla ISH</td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>Defolikulacja oocytów</td></tr><tr><td>Cysteina</td><td>Sigma</td><td>C121800</td><td>Zarodki Dejelly</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP5611</td><td>do</td></tr><tr><td>mieszanki znakowania ISH Dig-RNA</td><td></td><td>11277073910</td><td>do sond ISH</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td>do koperty Vitelline usuwanie</td></tr><tr><td>3-aminobenzoesanu etylu</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>MS222 znieczulenie</td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma</td><td>F4375</td><td>do mediów iniekcyjnych</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>dla ISH</td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>do</td></tr><tr><td>OCM Kapilary szklane</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td>3.5" długość, I,D, 0,530 mm</td></tr><tr><td>Szklane fiolki na próbki</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-408B</td><td>dla ISH</td></tr><tr><td>Pętla</td><td></td><td></td> do włosów <td>Włosy umieszczone w pipecie Pasteura do manipulacji tkankami</td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td>do</td></tr><tr><td>wtryskiwacza ISH Nanolitr 2010</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nanolitr 2010</td><td>Mikrowtryskiwacz sterowany mikroprocesorem</td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Carolina</td><td>972433</td><td>Aquarium Sól do odzyskiwania żab</td></tr><tr><td>IRBG XGC Xenopus zweryfikowana pełnowymiarowa kamera cDNA</td><td>Źródło Nauki biologiczne</td><td>989_IRBG</td><td>biblioteka cDNA&nbsp;</td></tr><tr><td>LB Płytki agarowe ze 100 &mikro; g/ml Ampicillin</td><td>Teknova</td><td>L5004</td><td>150 mm wstępnie wylane płytki LB-Amp do selekcji sib</td></tr><tr><td>LB Luria Broth</td><td>Teknova</td><td>L8650</td><td>LB do zbierania kolonii w selekcji sib z płytek i rozcieńczania kultur</td></tr><tr><td>Magnetyczny zestaw do izolacji mRNA</td><td>New England BioLabs</td><td>S1550S</td><td>do izolacji RNA wzbogaconego w poli(A)</td></tr><tr><td>Kwas maleinowy</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td>dla ISH</td></tr><tr><td>Ręczny mikromanipulator Microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3310R</td><td>Ręczny mikromanipulator</td></tr><tr><td>Mikser nutujący</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-152</td><td>Rocker do ISH</td></tr><tr><td>Permoplast</td><td>Nasco</td><td>SB33495M</td><td>Glina do naczyń iniekcyjnych i preparacyjnych</td></tr> Sól fizjologiczna <tr><td>buforowana fosforanem</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td>dla ISH</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>w celu stymulacji rozwoju oocytów</td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon</td><td>Sigma</td><td>PVP40</td><td>dla</td></tr><tr><td>programowalnego ściągacza</td> ISH <td>World Precision Instruments</td><td>PUL-1000</td><td>Ściągacz igieł do mikropipet</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td>dla ISH</td></tr><tr><td>pTnT Vector</td><td>Promega</td><td>L5610</td><td>Budowa biblioteki cDNA</td></tr><tr><td>System kombinowany rybosondy</td><td>Promega</td><td>P1450</td><td>in vitro transkrypcja</td></tr><tr><td>Indeks górny Pełnowymiarowy zestaw do budowy biblioteki cDNA Life</td><td>Technologies</td><td>18248013</td><td>zestaw do budowy biblioteki cDNA</td></tr><tr><td>Szewy, jedwab 3-0</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td>Nić i igła do szycia po usunięciu oocytów</td></tr><tr><td>Torula RNA</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td>dla ISH</td></tr><tr><td>Trietanoloamina</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td>dla ISH</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>dla</td></tr><tr><td>uniwersalnego systemu syntezy cDNA ryboklonu</td><td>ISH Promega</td><td>C4360</td><td>Alternatywny zestaw do budowy biblioteki cDNA</td></tr><tr><td>Xenopus Pełne klony wejściowe ORF - ORFeome</td><td>Collaboration Źródło: Bioscience</td><td>5055_XenORFeome</td><td>Klony ORFeome</td></tr><tr><td>XL2-Blue Ultrakompetentne komórki</td><td>Agilent Technologies</td><td>200150</td><td>do transformacji cDNA biblioteka</td></tr></tbody></table>

klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów xenopus

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identyfikacja genów odpowiedzialnych za indukcję embrionalną stawia wiele wyzwań; by wymienić tylko kilka, wydzielane cząsteczki mogą być mało obfite, mogą nie być wydzielane, ale przywiązane do komórki sygnalizacyjnej (komórek sygnałowych), lub mogą wymagać obecności partnerów wiążących lub cząsteczek regulatorowych znajdujących się przed nimi. W związku z tym, w poszukiwaniu produktów genowych zdolnych do wywołania wczesnej odpowiedzi indukcyjnej soczewki u kompetentnej ektodermy, wykorzystaliśmy system klonowania ekspresji, który pozwoliłby na identyfikację czynników parakrynnych lub jukstakrynowych, a także białek transkrypcyjnych lub innych białek regulatorowych. Pule mRNA wstrzyknięto do oocytów Xenopus, a reagującą tkankę umieszczono bezpośrednio na oocytach i poddano wspólnej hodowli. Po funkcjonalnym klonowaniu ldb1 z biblioteki cDNA na etapie płytki nerwowej w oparciu o jej zdolność do wywoływania ekspresji markera wczesnego plakodu soczewki foxe3 w ektodermie zwierzęcej z kompetentną soczewką, scharakteryzowaliśmy wzorzec ekspresji mRNA i oznaczyliśmy progresję rozwojową po nadekspresji lub knockdownie ldb1. System ten jest odpowiedni w bardzo wielu różnych kontekstach, w których dąży się do identyfikacji induktora lub jego cząsteczek regulatorowych na wczesnym etapie łańcucha dostaw za pomocą odpowiedzi funkcjonalnej w kompetentnej tkance.

W odpowiedzi na ekspresję mRNA wstrzykniętego do oocytów, w reagującej tkance czapki zwierzęcej badano ekspresję otx2 za pomocą hybrydyzacji in situ (Rysunek 2 i Tabela 1); otx2 jest eksponowany w domniemanej ektodermie soczewkowej (PLE) od momentu zamknięcia rurki neuralnej do pogrubienia placody soczewkowej19. Jednakże, ponieważ otx2 jest również eksponowany w przedniej ektodermie neuralnej oraz w pozanierualnej ektodermie ...

Opisujemy system oocytów i czapeczek zwierzęcych Xenopus do klonowania ekspresji genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie i omawiamy techniki późniejszej analizy takich genów. System ten jest przydatny w funkcjonalnej identyfikacji szerokiej gamy produktów genowych.

Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie systemu wykorzystującego oocyty Xenopus oraz tzw. animal cap, który jest odpowiedni do identyfikacji produktów genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak to, które geny są niezbędne do wywołania odpowiedzi indukcyjnej. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie oocytów Xenopus jako systemu ekspresyjnego do produkcji i identyfikacji induktorów oddziałujących na tkankę docelową, a nawet genów działających powyżej induktorów w szlaku sygnałowym.Wizualna demonstracja tej metody jest niezwykle przydatna, ponieważ etapy sekcji i rekombinacji są silnie zależne od stadium i wymagają dopracowanej techniki. Po pobraniu tkanki jajnika od znieczulonych samic żab, należy rozdzielić tkankę na małe fragmenty, z których każdy zawiera około 10 do 20 oocytów. Następnie przenieść te fragmenty najpierw do świeżego roztworu OR2, a potem do roztworu OR2 zawierającego 2,0 mg/mL kolagenazy A. Kontynuować, delikatnie mieszając zawiesinę z tkanką na wytrząsarce przez jedną godzinę.Następnie przenieść fragmenty do świeżego roztworu kolagenazy i mieszać przez dodatkową godzinę. Po zakończeniu tej inkubacji należy zaobserwowaćy deflokulowane oocyty. Następnie przemyć oocyty 10 razy w pełnym OR2, a następnie dwukrotnie w medium do hodowli oocytów, w skrócie OCM.Następnie umieść oocyty w świeżym OCM i obejrzyj je pod mikroskopem stereoskopowym. Wyizoluj oocyty w stadium szóstym, odrzucając mniejsze, niedojrzałe komórki. Następnie umieść oocyty w pokrytej agarozą szalce Petri z OCM i przechowuj je w temperaturze od 18 do 20 °C do momentu iniekcji.Aby przygotować się do mikroiniekcji, umieść szklaną rurkę kapilarną w wyciągaczu do igieł, wyciągnij ją, a następnie odłam końcówki szkła, aby uzyskać igły o średnicy około 20 micrometers. Za pomocą mikroskopu złożonego zmierz końcówki igieł, korzystając z kalibrowanego mikrometru okularowego. Następnie rozprowadź glinę równomierną warstwą na dnie szalki Petriego o wymiarach 35 by 10 millimeter.Następnie, używając narzędzia przypominającego małą sondę, należy wykonać w tej warstwie równoległe rowki. Naczynie wyłożone gliną należy wypełnić około 2 mililitrami 3% Ficoll w 1x modyfikowanej soli Bartha (MBS). Następnie, używając pipety o szerokim otworze, należy przenieść do niego oocyty.Umieść oocyty w rowkach, aby zostały unieruchomione podczas następnej mikroiniekcji. Za pomocą mikroinjektora napełnij igłę około 2 µl wcześniej przygotowanej puli mRNA i dostosuj równowagę, aby wytworzyć niewielkie nadciśnienie, co zapobiegnie zasysaniu cytoplazmy oocytu do igły podczas wstrzykiwania. Następnie wstrzyknij do każdego oocytu 20 nL RNA w obszarze równikowym.Następnie pozostaw oocyty w roztworze Ficoll MBS na jedną godzinę, a potem ostrożnie przenieś je do 1x MBS. Inkubuj oocyty od ośmiu do 24 godzin w temperaturze 20°C. Aby rozpocząć test czepka zwierzęcego (animal cap assay), przygotuj 3/4x normal amphibian medium, w skrócie roztwór NAM, precyzyjną pęsetę, pętlę z włosa, wcześniej wstrzyknięte oocyty oraz embriony Xenopus w stadium 11 do 11,5.Następnie potłuc szklane laminki na fragmenty o rozmiarach około 1 mm na 2 mm i ogrzewać te kawałki w płomieniu, aż ich krawędzie zostaną wypolerowane i zaokrąglone. W następnej kolejności docisnąć glinę do naczynia, tworząc pojedynczą warstwę, zgodnie z wcześniejszym opisem. Za pomocą małej sondy wykonać w tej powłoce pojedyncze wgłębienia w kształcie filiżanek.Należy wypełnić szalkę około dwoma mililitrami 3/4x NAM. Następnie należy przenieść do niej wstrzyknięte oocyty, rozmieszczając je tak, aby każdy z nich został unieruchomiony w pojedynczym wgłębieniu. W celu przygotowania embrionów, należy przenieść je do szalki zawierającej roztwór 3/4x NAM.Wybierz podzbiór gastrul, które będą służyć jako kontrole stadium dla wieku ektodermy, i przenieś je do innej szalki zawierającej ten sam roztwór. Odstaw tę płytkę na bok. W przypadku embrionów, które zostaną wykorzystane w teście czepka zwierzęcego (animal cap assay), usuń ich błony witelinowe za pomocą dwóch par precyzyjnych pincet.Następnie przenieś gastrulę do wyłożonej gliną szalki z oocytami. Aby rozpocząć, odetnij czapki zwierzęce od embrionów za pomocą dwóch par precyzyjnych pęset, uważając, aby nie uszkodzić tkanki równikowej. W celu wytworzenia rekombinantów przy użyciu pierwszej metody, ustaw czapkę zwierzęcą tak, aby jej wewnętrzna powierzchnia stykała się z półkulą zwierzęcą oocytu, który został już umieszczony w zagłębieniu.Powtórz ten proces dla kilku wstrzykniętych oocytów. Aby upewnić się, że rekombinanty pozostają ze sobą połączone, umieść zakrzywiony fragment szkiełka podstawowego na każdym z nich i wywieraj nacisk w dół, aż zwierzę zostanie spłaszczone, a szkiełko dotknie gliny. Aby stworzyć rekombinanty drugą metodą, umieść czapy zwierzęce i oocyty razem w pustych, pojedynczych wgłębieniach w glinie.Należy upewnić się, że wewnętrzne powierzchnie czapeczek zwierzęcych są zwrócone w stronę oocytu. Następnie obie tkanki należy przymocować do siebie, używając małych fragmentów glinki. Po wygenerowaniu wielu rekombinantów za pomocą którejkolwiek z metod, należy inkubować je wraz z odłożonymi embrionami kontrolnymi w temperaturze 20 °C.Gdy embriony kontrolne osiągną pożądany stopień rozwoju, należy usunąć szkiełka nakrywkowe z rekombinantów i wyizolować ektodermę czapki zwierzęcej za pomocą pęsety i pętli z włosa. Następnie oba fragmenty ektodermy oraz embriony kontrolne należy utrwalić w MEMFA przez jedną godzinę. Po tym czasie należy przenieść je do etanolu i przechowywać tkanki w temperaturze -20 °C.W niniejszym badaniu zestawy oocytów wstrzyknięto z pulami mRNA odpowiadającymi coraz mniejszym liczbom klonów lub kolonii, a następnie hodowano z czapkami zwierzęcymi (animal caps). Następnie określono liczbę czapek zwierzęcych w każdym zestawie wykazujących ekspresję foxe3 – markera zazwyczaj obserwowanego w domniemanym ektodermie soczewki od wczesnych etapów płytki nerwowej do powstania pęcherzyka, wykorzystanego tutaj do oceny zdolności indukowania soczewki. Metoda ta pozwoliła zidentyfikować gen kodujący czynnik jądrowy, ldb1, który może wywołać odpowiedź indukującą soczewkę w 50 z 179, czyli w 28% ocenianych czapek zwierzęcych.Przedstawione tutaj obrazy hybrydyzacji in situ, ukazujące sygnał foxe3 (wskazany grotami strzałek) w czapkach zwierzęcych hodowanych z oocytami wstrzykniętymi z ldb1 od około stadium 11 do stadium 23. W odpowiadających im kontrolnych czapkach zwierzęcych umieszczonych na nie wstrzykniętych oocytach nie zaobserwowano ekspresji foxe3. Po wykonaniu przekrojów tych czapek zwierzęcych ekspresję foxe3 odnotowano zarówno w wewnętrznej, jak i zewnętrznej warstwie ektodermy.Ekspresja w warstwie wewnętrznej jest charakterystyczna dla odpowiedzi soczewki. Z kolei ekspresja w obu warstwach wskazuje na inne struktury, takie jak placoda węchowa. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować metody takie jak immunohistochemia, hybrydyzacja in situ lub bezpośrednia detekcja fluorescencyjnego genu reporterowego w celu oceny odpowiedzi indukcyjnej w ektodermie czapki zwierzęcej.

functional-cloning-using-a-xenopus-oocyte-expression-system

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym materiale demonstrujemy mikroiniekcję cytoplazmatyczną oocytów Xenopus laevis z substratem importu jądrowego, a także przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji za pomocą elektronowej mikroskopii sekcji cienkich.<br...

Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis

Procedura zapłodnienia oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza.

Zapłodnienie oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Niniejszy protokół wideo prezentuje metodę generowania transgenicznych Xenopus laevis poprzez wprowadzanie transgenów do jąder plemników, a następnie transplantację jąder do niezapłodnionych komórek jajowych.

Produkcja transgenicznych Xenopus laevis poprzez integrację za pośrednictwem enzymów restrykcyjnych i transplantację jąder

Opisujemy metody manipulowania niedojrzałymi oocytami Xenopus laevis, dojrzewania in vitro oocytów do komórek jajowych oraz docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Protokół ten umożliwia degradację niektórych białek matczynych i nadekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania podczas zapłodnienia, a zatem jest cenny dla badania ról określonych czynników we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Opisano zoptymalizowane procedury izolacji pojedynczych pęcherzyków, mikroiniekcji cytoplazmatycznego RNA, usuwania otaczających warstw komórek i ekspresji białek w oocytach Xenopus. Ponadto przedstawiono prostą metodę szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych z kanałami jonowymi bramkowanymi ligandem.

Ksenopus (Ksenopus) Oocyty: zoptymalizowane metody mikroiniekcji, usuwania warstw komórek pęcherzykowych i szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych

Geny niezbędne do przetrwania stanowią techniczne przeszkody w tworzeniu linii mutantów. Skakanie pozwala uniknąć śmiertelności, łącząc edycję genomu z przeszczepem pierwotnych komórek rozrodczych w celu stworzenia zwierząt typu dzikiego z mutacjami linii zarodkowej. Leapfrogging pozwala również na efektywne generowanie homozygotycznych mutantów zerowych w pokoleniu F1. Tutaj pokazany jest etap przeszczepu.

Przeszczep pierwotnych komórek rozrodczych w celu przeskoku opartego na CRISPR/Cas9 w Xenopus

Prezentujemy metodę generowania in vitro samopodtrzymujących się oscylacji mitotycznych na poziomie pojedynczej komórki poprzez kapsułkowanie ekstraktów jajecznych Xenopus laevis w mikroemulsjach typu woda w oleju.

Rekonstrukcja oscylacji cyklu komórkowego w mikroemulsjach bezkomórkowych ekstraktów jajowych Xenopus

Ten artykuł ma na celu pokazanie użycia partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych jako substytutu plemników do budowy półklonowanych embrionów.

Zastosowanie partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych myszy jako substytutu plemników

Manipulacje embriologiczne, takie jak eksterminacja i przeszczepianie komórek, są ważnymi narzędziami do badania wczesnego rozwoju. Protokół ten opisuje proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania do wykonywania tych manipulacji w zarodkach danio pręgowanego.

Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

Poznaj metodę klonowania funkcjonalnego przy użyciu oocytów Xenopus do analizy genów indukujących odpowiedź w ektodermie. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów regulacji genów w biologii rozwoju.

Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus

Przeglądaj więcej filmów