Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie systemu wykorzystującego oocyty Xenopus oraz tzw. animal cap, który jest odpowiedni do identyfikacji produktów genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak to, które geny są niezbędne do wywołania odpowiedzi indukcyjnej. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie oocytów Xenopus jako systemu ekspresyjnego do produkcji i identyfikacji induktorów oddziałujących na tkankę docelową, a nawet genów działających powyżej induktorów w szlaku sygnałowym.

Wizualna demonstracja tej metody jest niezwykle przydatna, ponieważ etapy sekcji i rekombinacji są silnie zależne od stadium i wymagają dopracowanej techniki. Po pobraniu tkanki jajnika od znieczulonych samic żab, należy rozdzielić tkankę na małe fragmenty, z których każdy zawiera około 10 do 20 oocytów. Następnie przenieść te fragmenty najpierw do świeżego roztworu OR2, a potem do roztworu OR2 zawierającego 2,0 mg/mL kolagenazy A. Kontynuować, delikatnie mieszając zawiesinę z tkanką na wytrząsarce przez jedną godzinę.

Następnie przenieść fragmenty do świeżego roztworu kolagenazy i mieszać przez dodatkową godzinę. Po zakończeniu tej inkubacji należy zaobserwowaćy deflokulowane oocyty. Następnie przemyć oocyty 10 razy w pełnym OR2, a następnie dwukrotnie w medium do hodowli oocytów, w skrócie OCM.

Następnie umieść oocyty w świeżym OCM i obejrzyj je pod mikroskopem stereoskopowym. Wyizoluj oocyty w stadium szóstym, odrzucając mniejsze, niedojrzałe komórki. Następnie umieść oocyty w pokrytej agarozą szalce Petri z OCM i przechowuj je w temperaturze od 18 do 20 °C do momentu iniekcji.

Aby przygotować się do mikroiniekcji, umieść szklaną rurkę kapilarną w wyciągaczu do igieł, wyciągnij ją, a następnie odłam końcówki szkła, aby uzyskać igły o średnicy około 20 micrometers. Za pomocą mikroskopu złożonego zmierz końcówki igieł, korzystając z kalibrowanego mikrometru okularowego. Następnie rozprowadź glinę równomierną warstwą na dnie szalki Petriego o wymiarach 35 by 10 millimeter.

Następnie, używając narzędzia przypominającego małą sondę, należy wykonać w tej warstwie równoległe rowki. Naczynie wyłożone gliną należy wypełnić około 2 mililitrami 3% Ficoll w 1x modyfikowanej soli Bartha (MBS). Następnie, używając pipety o szerokim otworze, należy przenieść do niego oocyty.

Umieść oocyty w rowkach, aby zostały unieruchomione podczas następnej mikroiniekcji. Za pomocą mikroinjektora napełnij igłę około 2 µl wcześniej przygotowanej puli mRNA i dostosuj równowagę, aby wytworzyć niewielkie nadciśnienie, co zapobiegnie zasysaniu cytoplazmy oocytu do igły podczas wstrzykiwania. Następnie wstrzyknij do każdego oocytu 20 nL RNA w obszarze równikowym.

Następnie pozostaw oocyty w roztworze Ficoll MBS na jedną godzinę, a potem ostrożnie przenieś je do 1x MBS. Inkubuj oocyty od ośmiu do 24 godzin w temperaturze 20°C. Aby rozpocząć test czepka zwierzęcego (animal cap assay), przygotuj 3/4x normal amphibian medium, w skrócie roztwór NAM, precyzyjną pęsetę, pętlę z włosa, wcześniej wstrzyknięte oocyty oraz embriony Xenopus w stadium 11 do 11,5.

Następnie potłuc szklane laminki na fragmenty o rozmiarach około 1 mm na 2 mm i ogrzewać te kawałki w płomieniu, aż ich krawędzie zostaną wypolerowane i zaokrąglone. W następnej kolejności docisnąć glinę do naczynia, tworząc pojedynczą warstwę, zgodnie z wcześniejszym opisem. Za pomocą małej sondy wykonać w tej powłoce pojedyncze wgłębienia w kształcie filiżanek.

Należy wypełnić szalkę około dwoma mililitrami 3/4x NAM. Następnie należy przenieść do niej wstrzyknięte oocyty, rozmieszczając je tak, aby każdy z nich został unieruchomiony w pojedynczym wgłębieniu. W celu przygotowania embrionów, należy przenieść je do szalki zawierającej roztwór 3/4x NAM.

Wybierz podzbiór gastrul, które będą służyć jako kontrole stadium dla wieku ektodermy, i przenieś je do innej szalki zawierającej ten sam roztwór. Odstaw tę płytkę na bok. W przypadku embrionów, które zostaną wykorzystane w teście czepka zwierzęcego (animal cap assay), usuń ich błony witelinowe za pomocą dwóch par precyzyjnych pincet.

Następnie przenieś gastrulę do wyłożonej gliną szalki z oocytami. Aby rozpocząć, odetnij czapki zwierzęce od embrionów za pomocą dwóch par precyzyjnych pęset, uważając, aby nie uszkodzić tkanki równikowej. W celu wytworzenia rekombinantów przy użyciu pierwszej metody, ustaw czapkę zwierzęcą tak, aby jej wewnętrzna powierzchnia stykała się z półkulą zwierzęcą oocytu, który został już umieszczony w zagłębieniu.

Powtórz ten proces dla kilku wstrzykniętych oocytów. Aby upewnić się, że rekombinanty pozostają ze sobą połączone, umieść zakrzywiony fragment szkiełka podstawowego na każdym z nich i wywieraj nacisk w dół, aż zwierzę zostanie spłaszczone, a szkiełko dotknie gliny. Aby stworzyć rekombinanty drugą metodą, umieść czapy zwierzęce i oocyty razem w pustych, pojedynczych wgłębieniach w glinie.

Należy upewnić się, że wewnętrzne powierzchnie czapeczek zwierzęcych są zwrócone w stronę oocytu. Następnie obie tkanki należy przymocować do siebie, używając małych fragmentów glinki. Po wygenerowaniu wielu rekombinantów za pomocą którejkolwiek z metod, należy inkubować je wraz z odłożonymi embrionami kontrolnymi w temperaturze 20 °C.

Gdy embriony kontrolne osiągną pożądany stopień rozwoju, należy usunąć szkiełka nakrywkowe z rekombinantów i wyizolować ektodermę czapki zwierzęcej za pomocą pęsety i pętli z włosa. Następnie oba fragmenty ektodermy oraz embriony kontrolne należy utrwalić w MEMFA przez jedną godzinę. Po tym czasie należy przenieść je do etanolu i przechowywać tkanki w temperaturze -20 °C.

W niniejszym badaniu zestawy oocytów wstrzyknięto z pulami mRNA odpowiadającymi coraz mniejszym liczbom klonów lub kolonii, a następnie hodowano z czapkami zwierzęcymi (animal caps). Następnie określono liczbę czapek zwierzęcych w każdym zestawie wykazujących ekspresję foxe3 – markera zazwyczaj obserwowanego w domniemanym ektodermie soczewki od wczesnych etapów płytki nerwowej do powstania pęcherzyka, wykorzystanego tutaj do oceny zdolności indukowania soczewki. Metoda ta pozwoliła zidentyfikować gen kodujący czynnik jądrowy, ldb1, który może wywołać odpowiedź indukującą soczewkę w 50 z 179, czyli w 28% ocenianych czapek zwierzęcych.

Przedstawione tutaj obrazy hybrydyzacji in situ, ukazujące sygnał foxe3 (wskazany grotami strzałek) w czapkach zwierzęcych hodowanych z oocytami wstrzykniętymi z ldb1 od około stadium 11 do stadium 23. W odpowiadających im kontrolnych czapkach zwierzęcych umieszczonych na nie wstrzykniętych oocytach nie zaobserwowano ekspresji foxe3. Po wykonaniu przekrojów tych czapek zwierzęcych ekspresję foxe3 odnotowano zarówno w wewnętrznej, jak i zewnętrznej warstwie ektodermy.

Ekspresja w warstwie wewnętrznej jest charakterystyczna dla odpowiedzi soczewki. Z kolei ekspresja w obu warstwach wskazuje na inne struktury, takie jak placoda węchowa. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować metody takie jak immunohistochemia, hybrydyzacja in situ lub bezpośrednia detekcja fluorescencyjnego genu reporterowego w celu oceny odpowiedzi indukcyjnej w ektodermie czapki zwierzęcej.