Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Metodologia ta zapewnia podejście polegające na utracie funkcji w badaniach rozwoju siatkówki u piskląt. Technika ta wspomaga szybką i trwałą supresję docelowych genów w określonym obszarze siatkówki. Podejście to można również zastosować do innych części zarodka pisklęcia, w tym zarówno tkanek nerwowych, jak i nienerwowych.

Do elektroporacji in ovo przygotuj 0,25% roztwór Fast Green, rozpuszczając 25 miligramów Fast Green FCF w 10 mililitrach PBS, a następnie przefiltruj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości 0,2 mikrona. Następnie przygotuj roztwór do wstrzykiwań koktajlu DNA, mieszając szmaragdowy plazmid GFP mikroRNA z plazmidem ekspresji transpozazy Tol2 w stosunku dwa do jednego. Następnie dodaj przygotowany roztwór Fast Green do koktajlu DNA w proporcji od 1 do 10 w celu wizualizacji wstrzykniętego obszaru.

Następnie należy skonfigurować aparat do mikroiniekcji. Aparat składa się ze strzykawki Hamiltona, dwucalowej igły o rozmiarze 18, dwucentymetrowej rurki z polichlorku winylu o długości dwóch centymetrów i igły do mikropipet. Napełnij strzykawkę Hamilton ciężkim olejem mineralnym, a następnie przymocuj igłę o rozmiarze 18 do strzykawki i wypełnij wewnętrzną przestrzeń igły olejem, naciskając tłok strzykawki.

Następnie przymocuj rurkę z polichlorku winylu do końca igły i napełnij rurkę olejem. Przymocuj wyciągniętą igłę do mikropipety do rurki. Następnie pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą cienkich kleszczy odłamać końcówkę igły do średnicy od 10 do 20 mikrometrów, aby zrobić mały otwór.

Napełnij całą igłę olejem. Następnie umieść pięć mikrolitrów kolorowego koktajlu DNA na szalce Petriego. Pod mikroskopem preparacyjnym umieścić końcówkę igły do mikropipety w roztworze DNA na szalce Petriego i powoli wciągnąć roztwór do igły.

Po wyrównaniu ciśnienia wewnątrz i na zewnątrz igły, wyjąć końcówkę igły z roztworu DNA i trzymać ją zanurzoną w sterylnym PBS w małej zlewce do czasu wstrzyknięcia. Następnie, aby ustawić aparat do elektroporacji, należy mocno ustawić parę elektrod platynowych z uchwytem elektrody na mikromanipulatorze. Dostosuj odstęp między końcówkami elektrod do dwóch milimetrów i podłącz elektrody do generatora impulsów fali prostokątnej za pomocą.

Następnie, w celu mikroiniekcji DNA, wyjmij zapłodnione jajo White Leghorn z inkubatora i przetrzyj powierzchnię jaja bibułą nasączoną 70% etanolem. Następnie przymocuj igłę o rozmiarze 18 do 10-mililitrowej strzykawki i włóż igłę przez koniec jajka, pod kątem w dół, aby uniknąć uszkodzenia żółtka. Po pobraniu od dwóch do trzech mililitrów albuminy z jaja uszczelnij otwór kawałkiem taśmy klejącej i zapal jajko światłem, aby upewnić się, że zarodek i błona witeliny zostały oderwane od skorupki.

Następnie za pomocą kleszczy usuń kawałek skorupki jajka z wierzchu jajka, odsłaniając zarodek. Nie należy otwierać więcej niż pięciu jaj jednocześnie, aby zapobiec wysychaniu zarodków podczas elektroporacji. Włóż końcówkę igły do pęcherzyka wzrokowego od jego bliższej strony pod kątem 45 stopni i wstrzyknij koktajl DNA, powoli naciskając tłok, aż niebieski roztwór wypełni światło.

Wyjąć igłę i umieścić jej końcówkę z powrotem w PBS. W przypadku elektroporacji ustaw napięcie impulsu na 15 woltów, długość impulsu na 15 milisekund, interwał impulsów na 915 milisekund, a liczbę impulsów na pięć. Po dodaniu kilku kropli HBSS na błonę witeliny nad zarodkiem, za pomocą mikromanipulatora opuść elektrody do HBSS prostopadle do osi przednio-tylnej zarodka.

Umieść elektrody po obu stronach pęcherzyka wzrokowego, upewniając się, że elektrody nie dotykają zarodka ani naczyń krwionośnych, a następnie zastosuj pulsacyjne pola elektryczne. Po zakończeniu elektroporacji wyjmij elektrody i delikatnie wyczyść elektrody sterylnym patyczkiem kosmetycznym nasączonym wodą, aby uniknąć gromadzenia się albuminy. Uszczelnij okno taśmą klejącą i ponownie inkubuj zarodek do pożądanego etapu rozwoju.

Transfekcja poszczególnych sekwencji pre-mikroRNA do komórek HEK293T ekspresji Nel AP spowodowała znaczną supresję ekspresji Nel przez konstrukty przeciwko nukleotydom 482 do 502, 910 do 930 i 2461 do 2481. Połączenie dwóch sekwencji mikroRNA znacznie zwiększyło skuteczność knockdownu. Wszystkie trzy kombinacje wykazały zwiększoną aktywność supresyjną w porównaniu z niepołączonymi pojedynczymi sekwencjami pre-mikroRNA.

Silne zahamowanie obserwowano co najmniej 13 dni po transfekcji. Gdy konstrukt pre-mikroRNA Nel ukierunkowany na nukleotydy od 482 do 502 i 2461 do 2481 był współtransfekowany z wektorem ekspresyjnym transpozazy do siatkówki pisklęcia, ekspresja Nel w nabłonku barwnikowym siatkówki była znacznie zmniejszona w szmaragdowych komórkach eksprymujących GFP w 4,5 dniu embrionalnym. W ośmiodniowych zarodkach ekspresja Nel zmniejszyła się również w komórkach zwojowych siatkówki.

Natomiast na ekspresję Nel w siatkówce nie wpłynęło wprowadzenie kontrolnego mikroRNA. Po tej procedurze można zbadać wpływ na supresję genów docelowych przy użyciu różnych metod, takich jak badania proliferacji i różnicowania komórek, śmierć komórek oraz śledzenie komórek i aksonów.