Porównawcze badanie in vivo adiuwantyczności gp96 u żaby Xenopus laevis

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie ewolucyjnej zdolności konserwatywnej białka szoku cieplnego G 96 do promowania specyficznych dla antygenu odpowiedzi limfocytów T CD 8 w rękawach ksenopusa żaby. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie leukocytów otrzewnej przez płukanie otrzewnowe. Drugim etapem procedury jest pulsowanie leukocytów otrzewnowej GP 96 pochodzącym z guza, który chaperon minor i antygeny nowotworowe po inkubacji i przemyciu.

Leukocyty otrzewnowe są adoptywnie przenoszone przez wstrzyknięcie dootrzewnowe do nieleczonych żab w celu przygotowania tych żab przeciwko nowemu lub drobnym antygenom zgodności tkankowej. Trzecim etapem procedury jest przeszczep skóry lub nowotwór prowokacyjny przygotowanych żab i monitorowanie początku przeszczepu skóry, odrzucenia lub pojawienia się guza. Ostatnim etapem zabiegu jest uzyskanie krwi obwodowej w celu scharakteryzowania limfocytów T biorących udział w odrzucaniu skóry i reakcjach przeciwnowotworowych.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na znaczne przyspieszenie odrzucenia przeszczepu skóry, a także opóźnienia w pojawianiu się guza u żab przygotowanych do GP 96 odpowiednio poprzez przeszczep skóry i testy prowokacji guza. Cześć, nazywam się Christina Koska i pracuję w laboratorium dr Jacque'a Roberta na Wydziale Mikrobiologii i Immunologii w Centrum Medycznym Uniwersytetu Rochester. Nazywam się Tanya Cruz i również pracuję w laboratorium doktora Rivera.

Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę przygotowania żab klonów poprzez adoptywny transfer leukocytów otrzewnej, a następnie przeszczep skóry i testy przeszczepu guza. Ponadto pokażemy Ci również, jak uzyskać krew obwodową od tego zwierzęcia. Używamy tej procedury w naszym atorium do zbadania zdolności podgrzewania białka GP 96 do promowania komórek CDAT specyficznych dla antygenu w Salla, a także do badania typów komórek zaangażowanych w badanie.

Dobra, więc zacznijmy. Żaby użyte w naszych eksperymentach są genetycznymi klonami ISO z naszej kolonii hodowlanej na Uniwersytecie w Rochester. Aby uzyskać leukocyty otrzewnowe lub pls do zbioru, użyj igły o rozmiarze 25 x pięć osiem, aby wstrzyknąć znieczuloną żabę dootrzewnową za pomocą zabitego cieplnie preparatu e coli Trzy dni po wstrzyknięciu pls są zbierane przez płukanie dootrzewnowe.

Aby rozpocząć tę procedurę, zdezynfekuj brzuch znieczulonej żaby niewielką ilością 70% etanolu. Następnie za pomocą igły 1,5 o rozmiarze 18 wstrzyknij pięć mililitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub przedwojennego PBS w temperaturze pokojowej do jamy otrzewnej. Wyjąć igłę i delikatnie masować żabę przez minutę, aby upewnić się, że wstrzyknięty bufor jest równy płynowi w jamie ciała.

Następnie włóż nową igłę 1,5 G 18 bez strzykawki do brzucha żaby. Omijając naczynia krwionośne, zbierz płyn otrzewnowy, który będzie kapał z tyłu igły, do czystej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Upewnij się, że odzyskałeś jak najwięcej początkowej wstrzykniętej objętości po zebraniu pls.

Umieść żabę w pojemniku z płytką wodą, aż się obudzi, po czym można ją umieścić z powrotem w klatce. Po zebraniu pls odwirować z prędkością 1000 obr./min przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, usunąć sup, natant i resus. Zawieś pls w zimnym PBS.

Przenieś RESUSPENDED pls do 1,5-mililitrowej mikrorurki na śmieci. Aby pulsować PLS za pomocą GP 96. Dodaj odpowiednią ilość GP 96 do pls i mieszaj, pipetując, inkubować na lodzie przez godzinę po jednej godzinie.

Odwirować komórki z prędkością 14 000 obr./min przez jedną minutę. Aby usunąć niezwiązany GP 96, należy usunąć supernatant. Dodaj zimny A PBS i resus.

Ponownie zawiesić wirówkę PLS. Umyj S zimnym A-P-B-S-A łącznie trzy razy, aby upewnić się, że po ostatnim praniu nie pozostały żadne resztki G 96. Resus zawiesza pulsacyjne pls w stężeniu pięć razy 10 do pięciu pls na 300 mikrolitrów PBS, aby adoptywnie przenieść pls do naiwnych sześciu odbiorców LG.

Dootrzewnowo wstrzyknąć 300 mikrolitrów pulsacyjnego pls na zwierzę. Żaby muszą być przygotowane co najmniej trzy dni przed eksperymentem z przeszczepem skóry lub badaniem nowotworu, które zostaną pokazane w następnej kolejności. Skóra do przeszczepu pozyskiwana jest ze znieczulonej żaby dawcy LG 15.

Użyj nożyczek, aby wyciąć i usunąć mały kawałek skóry brzusznej, czyli skóry brzucha, która wydaje się srebrzysta. Ze względu na obecność ARI cztery pigmentowane komórki podczas obsługi przeszczepu. Bardzo ważne jest, aby jak najmniej manipulować tkanką, ponieważ spowoduje to uszkodzenie przeszczepu.

Przytrzymaj skórę bardzo delikatnie kleszczami i umieść ją na szalce Petriego zawierającej zimny A PBS. Trzymaj szalkę Petriego na sobie. Umieść skórę na świeżym szkiełku podstawowym i za pomocą brzytwy pokrój poszczególne przeszczepy na kawałki o wymiarach pięć milimetrów na pięć milimetrów.

Trzymaj fragmenty w PBS na lodzie, aby przeszczepić skórę żabie biorcy LG six. Najpierw wykonaj małe nacięcie na skórze grzbietowej znieczulonego biorcy. Następnie włóż przeszczep o wymiarach pięć milimetrów na pięć milimetrów pod skórę srebrzystą stroną do góry.

Pamiętaj, aby zwrócić uwagę na oznaczenia nożyczek i kleszczy na przeszczepach, ponieważ nie są one liczone jako odrzucenie przeszczepu. Gdy ocenianie rozpocznie się 24 godziny później, część skóry nakładającego się gospodarza musi zostać usunięta z przeszczepu. Użyj nożyczek, aby wyciąć okno wokół przeszczepu, aby przeszczep można było swobodnie wizualizować.

Należy uważać, aby nie dotknąć skóry dawcy ani nie wywołać krwawienia. Zacznij oceniać przeszczep od razu, wykonując szkic. Przeszczep skóry.

Odrzucenie określa się na podstawie procentu zniszczenia aridolu na przeszczepionej skórze. Przeszczep należy sprawdzać co dwa do trzech dni pod mikroskopem stereoskopowym. Przygotuj komórki nowotworowe do przeszczepu przez resus, zawieszając je w pożywce do hodowli nowotworów o gęstości pięć razy 10 do pięciu komórek na 300 mikrolitrów.

Przeszczep komórki przez wstrzyknięcie podskórne po jednej stronie grzbietowej zwierzęcia. Pięć razy 10 do pięciu komórek w objętości 300 mikrolitrów wstrzykuje się na żabę. Wzrost guza rozpocznie się w ciągu dwóch do trzech tygodni po wykryciu nowotworu.

Zwróć uwagę na początkowy wygląd guza. Użyj suwmiarki, aby zmierzyć wymiary guza i rejestruj jego objętość co dwa do trzech dni przed pobraniem leukocytów krwi od żaby. Przygotuj szklane igły, przeciągając makaron peppes nad płomieniem.

Po naostrzeniu cienkiego końca pipety pod mikroskopem stereoskopowym podłączyć pipetę do plastikowej rurki aspiracyjnej. Aby rozpocząć pobieranie krwi, przeciąć skórę powyżej tylnej stopy znieczulonej żaby, aby odsłonić żyłę grzbietową stępu. Napełnij szklaną igłę jednym do dwóch mililitrów lodowatego roztworu PBS i heparyny.

Następnie włóż szklaną igłę do żyły i zacznij pobierać krew, powoli zasysając ustami. Od jednego przeciętnego żaba można uzyskać od jednego do dwóch mililitrów krwi. Małe nacięcie na nodze żaby nie musi być szyte.

Rana zagoi się w ciągu tygodnia. Wyniki stereomikroskopowej analizy odrzucenia przeszczepu skóry po 12 dniach od przeszczepu przedstawiono tutaj. Sklonowana żaba LG Six, która otrzymała przeszczep skóry od dawcy LG Six identycznego z MHC, nie wykazała odrzucenia.

Gwiazdka oznacza, że kleszcze markerowe nie są spowodowane odrzuceniem. Natomiast sklonowana żaba LG Six, która otrzymała przeszczep skóry od dawcy niekrewniaczego MHC, wykazuje 80% odrzucenia. Na obu obrazach strzałki wskazują srebrzyste tęczówki cztery pigmentowane komórki oznaczające zdrową, nieodrzuconą przeszczepioną tkankę.

W tym następnym eksperymencie LG 15 pl poddano pulsacyjnemu badaniu PBS jako rekombinowany GP 96 z kontroli ujemnej oczyszczony z kultury E. coli lub GP 96 oczyszczony z 15 komórek tkanki nowotworowej o zerowym zasięgu, następnie adoptywnie przeniesiono do LG 15 dorosłych biorców, a trzy dni później żywe 15 komórek nowotworowych zero przeszczepiono za pomocą guzów iniekcyjnych podskórnych, które pojawiły się po raz pierwszy kilka dni po prowokacji, monitorowano, a wielkość guza mierzono okresowo w Te wykresy, każda krzywa przedstawia kinetykę wzrostu guza u jednej żaby. Wyniki pokazują, że zwierzęta, którym podawano 0,5 lub jeden mikrogram GP 96, miały znacznie opóźnione pojawienie się guza w porównaniu z grupami kontrolnymi. Dlatego GP 96 ułatwia krzyżową prezentację antygenów nowotworowych w ksenopu.

Właśnie pokazaliśmy, jak zbadać zdolność GP 96 do reprezentowania zarówno drobnych, jak i nowotworowych antygenów w żabie xap lavis za pomocą testów przeszczepu skóry i przeszczepu guza. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby unikać zbierania się płukania otrzewnej, jeśli naczynie krwionośne zostało uszkodzone, ponieważ większość komórek w erytrocytach, a nie makrofagi. Ważne jest również, aby unikać ściskania tkanki kleszczami podczas manipulowania przeszczepem skóry, aby uniknąć uszkodzenia.

Więc to wszystko. Dzięki za umycie i powodzenia w eksperymentach.