Ekstrakcja krążącego miRNA: metoda izolowania miRNA z próbek osocza poprzez ekstrakcję organiczną i wzbogacanie małego RNA

- MikroRNA lub miRNA to małe niekodujące RNA, które regulują ekspresję genów poprzez degradację mRNA lub blokowanie ich translacji do funkcjonalnych białek. Krążące miRNA są potencjalnymi biomarkerami raka i można je wyodrębnić z płynów ustrojowych, takich jak osocze. Na początek wymieszaj osocze z roztworem denaturującym, który jednocześnie homogenizuje próbkę i hamuje rybonukleazy rozkładające RNA.

Potraktować kwaśnym fenolem-chloroformem i odwirować w celu rozdzielenia próbki na dwie fazy, dolną fazę organiczną zawierającą DNA i białka oraz górną fazę wodną zawierającą RNA. Odzyskaj fazę wodną. Dodaj absolutny etanol, aby wytrącić RNA z roztworu.

Doprowadzić stężenie etanolu w próbce do 25%, aby ustalić warunki początkowe sprzyjające separacji dużych ilości RNA. Przenieś mieszaninę do wstępnie zmontowanego wkładu filtracyjnego i odwirówki. Duże RNA selektywnie unieruchamiają się na filtrze, podczas gdy mniejsze miRNA gromadzą się w filtracie.

Następnie zwiększ stężenie etanolu do 55%, aby sprzyjać izolacji miRNA. Przenieś filtrat do nowego wkładu filtracyjnego i odwiruj w celu wychwycenia miRNA. Umieścić wkład w probówce zbiorczej i dodać odpowiedni bufor elucyjny. Odwirować w celu wylucowania miRNA do probówki. W poniższym protokole pokażemy krążącą izolację miRNA z osocza pacjentów z rakiem jelita grubego.

Aby rozpocząć, przenieś 400 mikrolitrów próbki osocza do probówki o pojemności 2 mililitrów wolnej od RNaz. Następnie dodaj 400 mikrolitrów roztworu denaturującego do probówki. Dodaj 4 mikrolitry 1 nanogolaowego kolca.

Po wymieszaniu roztworu dodać 800 mikrolitrów kwaśnego fenolu-chloroformu. Wiruj roztwór przez 60 sekund i wiruj z maksymalną prędkością przez 15 minut. Następnie przenieść lizat zawarty w górnej fazie wodnej do czystej probówki, uważając, aby nie zakłócić interfazy.

Zmierzyć objętość odzyskanej fazy wodnej i dodać 1/3 objętości etanolu do lizatu. Następnie umieść wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej. Przenieś do 700 mikrolitrów mieszaniny lizatu etanolu do wkładu filtracyjnego. Odwirowywać wkład filtra przez 30 sekund przy 10 000 x g.

Następnie zmierz całkowitą objętość przepływu. Następnie dodaj 2/3 objętości etanolu do filtratu i dobrze wymieszaj. Umieść drugi wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej. Następnie przenieś do 700 mikrolitrów próbki do wkładu i odwiruj przy 10 000 x g przez 30 sekund przed odrzuceniem przepływu.

Dodaj 700 mikrolitrów roztworu płuczącego mikroRNA do wkładu filtracyjnego i odwiruj go z probówką zbiorczą o stężeniu 10 000 x g przez 15 sekund. Wyrzuć przepływ i włóż wkład filtra z powrotem do tej samej rurki.

Następnie przenieś wkład filtra do nowej rurki zbiorczej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów podgrzanego roztworu elucyjnego do wkładu. Odwiruj wkład filtra przy 10 000 x g przez 30 sekund, aby odzyskać mikroRNA.

• MicroRNAs - Small non-coding RNAs that regulate gene expression.
• Circulating miRNAs - miRNAs in body fluids used as possible cancer biomarkers.
• Denaturing Solution - Homogenizes the sample and inhibits RNA-degrading ribonucleases.
• Acid phenol-chloroform - Used to separate the sample into distinct phases.
• Elution Buffer - A solution added to elute miRNAs into a collection tube.

• Introduce MicroRNAs - Small molecules regulating gene expression (e.g., mirna).
• Key Concepts – Summarize the roles and potential of miRNAs in cancer research (e.g., mirna plasma kit).
• Underlying Mechanisms – miRNAs are isolated using specific procedures (e.g., mirvana isolation kit).
• Connect to Experiment – The study utilizes miRNA isolation from plasma samples.

• What are MicroRNAs and how to extract them (using mirna extraction kits)?
• How does the process of miRNA isolation work (using mirvana paris kit)?
• What is the role of circulating miRNAs in cancer research?

• Practical Applications – miRNAs in diagnostics, research, and treatment (e.g., micro rna isolation).
• Industry Impact – Impacting biotech, healthcare sectors (e.g., s1122-1830).
• Societal Importance – Potential benefits in early disease detection (e.g., miRNA isolation protocol).
• Link to Scientific Advancements – Emergence of advanced extraction kits (e.g., mirna plasma extraction kit).