Name: Ocena immunologicznie istotnych dynamicznych trzeciorzędowych cech strukturalnych sekwencji R2 korony pętli HIV-1 V3 metodą fałdowania ab initio (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Poznaj metodę fałdowania ab initio wykorzystywaną do analizy dynamicznych preferencji strukturalnych pętli V3 szczepu R2 HIV-1. Symulacje komputerowe pozwalają skorelować cechy strukturalne z wrażliwością na neutralizację wirusa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była finansowana z grantów przyznanych przez Bill and Melinda Gates Foundation (#38631) oraz NIH, w tym DP2 OD004631 i R01 AI084119.

1. Metodyka
<ol>
	<li>Pierwszym krokiem protokołu jest wybór sekwencji korony V3, którą chcemy sfałdemować in silico. Dla szczepu R2 sekwencja tego fragmentu to KSIPMGPGRAFYT.</li>
	<li>Trójwymiarowa struktura atomowa peptydu odpowiadającego tej sekwencji powinna zostać zbudowana w wirtualnej przestrzeni komputerowej. Komenda ICM służąca do tego celu to: buildpep "KSIPMGPGRAFYT" lub można wybrać opcję File:New:Peptide z menu rozwijanego</li>
	<li>Następnie ustawia się kilka parametrów procedury, w tym liczbę kroków przeszukiwania (długość wyszukiwania), temperaturę symulacji, parametry strategii wyszukiwania, w tym zmienne ograniczenia w celu skierowania wyszukiwania w stronę obszarów prawdopodobnych, człony energii, wybór różnych metod obliczania energii oraz parametry określające sposób zapisu wyszukiwania, takie jak decyzja o nagraniu filmu i liczba zapisywanych pośrednich konformacji z oceną scoringową. Wszystkie te parametry zostały zoptymalizowane w poprzednich publikacjach (patrz www.molsoft.com).</li>
	<li>Fałdowanie inicjuje się następnie komendą: montecarlo lub można wybrać opcję File:New:Peptide z menu rozwijanego Molecular Mechanics:Minimize:Global W pierwszym przypadku parametry z kroku 3 należy wprowadzać pojedynczo w linii komend. W drugim przypadku w panelu przed wykonaniem komendy dostępne są pola wyboru dla najczęściej wybieranych parametrów. Dla wygody przedstawiono tutaj ten sam skrypt ICM do fałdowania, który został wykorzystany w tym doświadczeniu oraz w wcześniej opublikowanych badaniach: <img src="/files/ftp_upload/2118/2118output.jpg" alt="Skrypt fałdowania białek przedstawiający zmienne ustawienia; metoda Monte Carlo do przewidywania struktury." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Wynik"> Skrypt ten można zapisać w pliku tekstowym i szybko uruchomić z linii komend systemu operacyjnego komputera (zazwyczaj LINUX) za pomocą polecenia: icm _foldingscript </li>
</ol>
2. Klucze do sukcesu
<ol>
	<li>Pętla V3 ma niemal w każdym znanym szczepie stałą długość 35 aminokwasów, dlatego pozycje aminokwasów numeruje się od 1 do 35, zaczynając od początkowej cysteiny tworzącej mostek dwusiarczkowy w pozycji 1, a kończąc na odpowiadającej jej cysteinie w pozycji 35. Ponieważ jest to część pętli, granice korony V3 powinny zostać starannie dobrane. Jeśli wybrany fragment będzie zbyt duży, mało prawdopodobne jest, aby zachowywał się on jak swobodnie elastyczny segment, podobnie jak w przypadku wolnego peptydy, co spowoduje, że symulacja zwijania nie oceni poprawnie struktury. Jeśli natomiast wybrany fragment będzie zbyt mały, w symulacji może nie powstać informatywna struktura trzeciorzędowa. Nasze wcześniejsze badanie wykazało, że fragment od pozycji 10 do pozycji 22 korelował z konformacjami krystalograficznymi związanymi z przeciwciałami, dlatego jest to fragment każdej pętli V3, który należy wybrać do symulacji zwijania.</li>
	<li>Choć korzystanie z graficznego interfejsu użytkownika i menu rozwijanych jest wygodne, wcześniejsze udane prace nad zwijaniem peptydów ogólnie z wykorzystaniem ICM, a w szczególności nad zwijaniem korony pętli V3, opierały się na powyższym skrypcie; zaleca się zatem prostą modyfikację sekwencji w linii buildpep i uruchomienie powyższego skryptu z wiersza poleceń.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Wyniki dla zwijania R2 są reprezentatywne dla wyników dla dowolnej pętli V3. Aby ocenić wyniki, należy otworzyć plik projektu (nazwany „newProject1.icb” przez powyższy skrypt) i wybrać opcję „Molecular Mechanics, Stack, View”. Pojawi się tabela konformacji stosu. Konformacje stosu można zwizualizować graficznie, klikając ikonę Plot/Histogram. Opcja „Molecular Mechanics, Stack, Play” utworzy film ze stosu, aby wizualnie ocenić preferencje konformacyjne ujawnione podczas zwijania. Dla sekwencji R2 konformacja przypomina beta-spinkę, co jest oczekiwane dla pętli V32 – szczególnie w fragmencie na pozycjach od 12 do 14, gdzie w całym stosie widoczna jest wyraźna preferencja dla nici β, a bardzo niewiele konformacji alfa-helikalnych. Co więcej, między konformacją o najniższej energii a konformacją o drugiej najniższej energii widoczna jest przerwa energetyczna wynosząca prawie 3 jednostki. Z punktu widzenia energetycznego oznacza to, że struktura opuszcza konformację o najniższej energii przez mniej niż jeden procent czasu: wyniki zwijania sugerują zatem, że korona R2 V3 jest strukturą sztywną, a nie elastyczną. W ansamblu konformacji mogą występować dodatkowe istotne cechy strukturalne, jednak ich systematyczna ocena jest trudna.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>JRFL</td>
			<td>SF162_V3JRFL</td>
			<td>SF162_V3R2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>447-52D GMT50</td>
			<td>15</td>
			<td>0.00061</td>
			<td>0.00078</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Względna neutralizacja pętli V3 JRFL i R2 w warunkach maskowania i braku maskowania. Dane zostały wcześniej opublikowane w Cardozo T., et al. ARHR (2008) oraz Pinter, A., et al J. Virol (2004). W skrócie, aktywność neutralizacyjną określono za pomocą testu zakaźności jednocyklowej przy użyciu psV wytworzonych z plazmidu pNL4-3.Luc.R-E- wykazującego ekspresję lucyferazy i pozbawionego białka env, pseudotypowanego białkiem Env JRFL lub wariantami V3 SF162 opisanymi powyżej: SF162_V3JRFL zawiera sekwencję pętli V3 JRFL w miejsce sekwencji pętli V3 SF162, natomiast SF162_V3R2 zawiera sekwencję pętli V3 R2 w miejsce sekwencji pętli V3 SF162. psV inkubowano z rozcieńczeniami seryjnymi przeciwciała mAb 447-52D przez 1,5 h w temperaturze 37°C, a następnie dodano do komórek docelowych CD4+CCR5+ U87 wysianych na płytkach 96-dołkowych w obecności polybrene (10 mg=mL). Po 24 h komórki ponownie podkarmienie medium RPMI zawierającym 10% FBS i 10 mg=mL polybrene, po czym zastosowano dodatkową inkubację przez 24-48 h. Aktywność lucyferazy oznaczono 48-72 h po zakażeniu za pomocą luminometru do płytek mikrotiterowych (HARTA, Inc.) przy użyciu odczynników testowych od Promega, Inc. Geometryczne średnie miana dla 50% neutralizacji (GMT50) przez 447-52D wyznaczono poprzez interpolację z krzywych neutralizacji i stanowią one średnie z co najmniej trzech niezależnych testów.

<ol><li>Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &amp, Cardozo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+characterization+of+the+V3+loop+crown%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Therapy%22%5BJournal%5D)">Dynamic characterization of the V3 loop crown.</a> Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).</li>
<li>Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+conservation+predominates+over+sequence+variability+in+the+crown+of+HIV+type+1%27s+V3+loop%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).</li>
<li>Abagyan, R., Totrov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+probability+Monte+Carlo+conformational+searches+and+electrostatic+calculations+for+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins.</a> J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).</li>
<li>Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+HIV+type+1+envelope+protein+associated+with+a+broadly+reactive+neutralizing+antibody+response%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).</li>
<li>Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variable+region+3+%28V3%29+mutation+determines+a+global+neutralization+phenotype+and+CD4-independent+infectivity+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+associated+with+a+broadly+cross-reactive%2C+primary+virus-neutralizing+antibody+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response.</a> J Virol. 76, 644-655 (2002).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Ab initio folding ujawnia trzeciorzędowe właściwości strukturalne, których efekty mogą nie być widoczne podczas sekwencyjnego badania poszczególnych aminokwasów. Symulacja zwijania ujawniła kilka wcześniej nieznanych właściwości strukturalnych korony pętli R2 V3. Zaobserwowane preferencje strukturalne mogą korelować z odnotowanymi właściwościami funkcjonalnymi szczepu R2, a mianowicie z wrażliwością na neutralizację i hiperzakaźnością5.
Po pierwsze, w N-końcowej połowie ko...

<table><tbody><tr><td>ICM-Pro</td><td>Molsoft LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena immunologicznie istotnych dynamicznych cech struktury trzeciorzędowej sekwencji r2 korony pętli v3 hiv-1 za pomocą zwijania ab initio

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

Różnorodność antygenowa HIV-1 od dawna stanowi przeszkodę w projektowaniu szczepionek, a zmienność ta jest szczególnie wyraźna w pętli V3 glikoproteiny otoczki powierzchniowej wirusa. Wcześniej zasugerowaliśmy, że korona pętli V3, mimo swojej dynamiki i zmienności sekwencji, jest ograniczona w całej populacji wirusów HIV-1 do immunologicznie istotnej trzeciorzędowej struktury β-spinki. Co ważne, w krążących wirusach HIV-1 występują tysiące różnych sekwencji korony pętli V3, co sprawia, że trójwymiarowa charakterystyka trendów strukturalnych w obrębie tej różnorodności wirusów jest trudna lub niemożliwa do przeprowadzenia za pomocą krystalografii lub NMR. Nasze poprzednie udane badania nad zwijaniem korony V31, 2 wykorzystywały algorytm ab initio 3 dostępny w pakiecie oprogramowania do modelowania molekularnego ICM-Pro (Molsoft LLC, La Jolla, CA) i wykazały, że korona pętli V3, a konkretnie pozycje od 10 do 22, korzysta w stopniu wystarczającym z elastyczności i długości flankujących ją łodyżek, aby w znacznym stopniu zachowywać się tak, jakby była nieograniczonym peptydem swobodnie zwijającym się w roztworze. W związku z tym szybkie zwijanie ab initio tylko tej części pętli V3 każdego z ponad 60 000 krążących szczepów HIV-1 może być informacyjne. W niniejszej pracy przeprowadziliśmy zwijanie pętli V3 szczepu R2, aby uzyskać wgląd w strukturalne podstawy jego unikalnych właściwości. R2 posiada rzadką sekwencję pętli V3, która prawdopodobnie odpowiada za wyjątkową wrażliwość tego szczepu na neutralizację przez sera pacjentów oraz przeciwciała monoklonalne4, 5. Szczep ten pośredniczy w infekcji niezależnej od CD4 i wydaje się wywoływać szeroko neutralizujące przeciwciała. Demonstrujemy, w jaki sposób ocena wyników zwijania może być pomocna w powiązaniu struktur zaobserwowanych podczas zwijania z aktywnością immunologiczną obserwowaną dla szczepu R2.

Region korony różnych sekwencji pętli V3 powierzchniowego glikoproteiny otoczki (gp120) HIV-1 może w wielu przypadkach zostać scharakteryzowany strukturalnie poprzez zwijanie in silico pozycji od 10 do 22 pętli przy użyciu nowoczesnego algorytmu zwijania ab initio. W niniejszej pracy prezentujemy zwijanie i ocenę tego regionu pętli V3 szczepu R2 HIV-1, który jest wyjątkowo wrażliwym na neutralizację szczepem o zagadkowych właściwościach funkcjonalnych.

Ocena immunologicznie istotnych dynamicznych cech struktury trzeciorzędowej sekwencji R2 korony pętli V3 HIV-1 za pomocą zwijania ab initio

Różnorodność antygenowa HIV-1 od dawna stanowi przeszkodę w projektowaniu szczepionek, a zmienność ta jest szczególnie wyraźna w pętli V3 wirusa...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena dynamicznych preferencji strukturalnych sekwencji peptydowej korony V3 szczepu R2 wirusa HIV za pomocą zwijania AR oraz skorelowanie wyników ze znaną wrażliwością szczepu R2 na neutralizację. Osiąga się to poprzez wybór odpowiedniego fragmentu korony pętli V3 szczepu R2 w celu wykonania zwijania AR bonni. W drugim kroku przeprowadzana jest symulacja zwijania, która przeszukuje wszystkie możliwe konformacje fragmentu korony R2 i zapisuje najbardziej prawdopodobne konformacje w pliku stosu.Następnie przeanalizowano zapisane konformacje, aby określić dynamiczne preferencje strukturalne korony R2V3, które mogłyby wyjaśnić jej wrażliwość na neutralizację. Uzyskano wyniki wskazujące na preferencję dla sztywnej beta-nici w pozycjach 12–14 pętli V3, w oparciu o strukturę drugorzędową, preferencje oraz rozkład energii zestawu przeszukanych konformacji. Witam, jestem Timothy Cardozo, mówię do Państwa z mojego laboratorium w Departamencie Farmakologii w New York University School of Medicine.Dzisiaj przedstawimy procedurę zwijania białka in vitro w obrębie elastycznej pętli immunogennego białka wirusowego HIV-1, znanego jako gp120. Elastyczna pętla ta jest znana jako pętla V3 powierzchniowej glikoproteiny otoczki wirusa HIV-1, a jej wierzchołek nazywany jest koroną pętli V3. Jest to region, który będziemy zwijać.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę, aby pomóc nam w identyfikacji produktywnych ścieżek prowadzących do projektowania skutecznych szczepionek przeciwko HIV. Zatem zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wybrać sekwencję V3 crown do zwinięcia in silico.Poprzednie badania przeprowadzone w tym laboratorium wskazują, że pozycje od 10 do 22 dowolnej sekwencji pętli V3 dają najlepsze wyniki; przeprowadź eksperymenty foldingowe armenio, korzystając z intuicyjnych menu rozwijanych w interfejsie graficznym (GUI) oprogramowania do modelowania molekularnego ICM Pro. Najpierw w wirtualnej przestrzeni komputera należy zbudować trójwymiarową strukturę atomową peptydu odpowiadającego tej sekwencji. Aby zbudować trójwymiarową strukturę atomową, przejdź do menu Plik i wybierz Nowy.Wyświetli się ekran z kilkoma kartami. Wybierz kartę peptydów i wklej lub wpisz sekwencję w polu tekstowym. Kliknij OK, aby zbudować trójwymiarową strukturę peptydu.Struktura pojawi się w oknie graficznym programu ICM. Po zbudowaniu struktury trójwymiarowej należy przejść do menu mechaniki molekularnej i wybrać opcję minimize, która otworzy menu boczne. Z menu bocznego należy wybrać opcję global.Wyświetli się ekran z kilkoma polami wprowadzania danych oraz polami wyboru zaznaczonymi zgodnie z parametrami domyślnymi. W razie potrzeby zmień wybór, aby wskazać peptyd do sfałdowania. Dostosuj długość i precyzję symulacji, zmieniając odpowiednio liczbę ruchów globalnych (global moves) oraz liczbę wywołań lokalnego minimum (local min calls).Wybierz opcję „all” dla zwijania wszystkich atomów peptydu. Następnie wybierz „save movie”, aby utworzyć plik filmowy z procesu zwijania. Na koniec kliknij „apply”, aby rozpocząć zwijanie w oknie graficznym.Algorytm rozpoczyna zwijanie peptydu w różne konformacje, obliczając i zapisując energię peptydu dla każdej z nich. Po zakończeniu procesu zostanie zidentyfikowana i zwizualizowana na komputerze najbardziej stabilna energetycznie konformacja peptydu, a także konformacje alternatywne o niemal identycznej energii. Wykonywanie zwijania peptydu. Użycie interfejsu graficznego pokazuje, jak wygląda zwijanie, ale nie pozwala na optymalny dobór parametrów dla zwijania pętli V3.W tym celu najlepiej wykonać zwijanie z niegraficznego wiersza poleceń przy użyciu skryptu. Skrypt to po prostu seria poleceń tekstowych zapisanych linijka po linijce w dokumencie lub pliku tekstowym, które są automatycznie wprowadzane do programu ICM i wykonywane jedna po drugiej w celu zwinięcia pętli V3. Najpierw należy utworzyć plik tekstowy i zapisać go na dysku twardym komputera w lokalnym katalogu. Podobnie jak wcześniej, należy zacząć od zbudowania peptydy w wirtualnej przestrzeni komputera.Następnie nadaj nazwę symulacji i określ liczbę zmiennych swobodnych, którymi są wiązania chemiczne w peptydzie pozostawione w stanie swobodnej rotacji podczas zwijania. Dalej określ czas trwania symulacji niezbędny do optymalnego zwijania pętli V3. Wartość ta będzie zależeć od liczby zmiennych swobodnych zidentyfikowanych w poprzednim kroku; aby określić precyzję poszukiwania konformacyjnego w eksperymencie, ustaw liczbę kroków przeszukiwania, które mają zostać wykonane w każdym minimum lokalnym.Następnie należy ustawić pozostałe parametry zoptymalizowane dla symulacji na podstawie wcześniejszych badań, w tym minimalizację temperatury, gradient oraz rozkład prawdopodobieństwa. Po ustawieniu parametrów eksperymentalnych należy wskazać, które obliczenia energii będą wykorzystywane podczas zwijania. W tym przypadku energia Vander Waalsa jest określona jako VW internal peptide.Energia jest określana przez 14, energia wiązań wodorowych jest określana przez HB, energia elektrostatyczna przez El, energia solwatacji przez SF, a entropia przez EN. Określ ustawienia końcowe, w tym preferowane kąty szkieletu i łańcuchów bocznych do przeszukania oraz konformację początkową.Na koniec należy wpisać polecenie uruchomienia i zapisania obliczeń. Po napisaniu skryptu i zapisaniu go jako plik tekstowy, należy go uruchomić z wiersza poleceń systemu operacyjnego komputera. Podobnie jak poprzednio, zostanie zidentyfikowana i zapisana w pliku projektu najstabilniejsza energetycznie konformacja peptydu, a także konformacje alternatywne o porównywalnej energii, w celu ich późniejszej wizualizacji na komputerze.Po zakończeniu obliczeń otwórz plik, wybierając opcję file open z rozwijanego menu EE. Wyświetl cząsteczkę, zaznaczając pole wyboru obok niej w panelu obszaru roboczego, a następnie wybierz widok molecular mechanics stack view. Aby wyświetlić uporządkowany według energii stos najlepszych konformacji peptydów z procesu zwijania, kliknij narzędzie wykresowania w prawym dolnym rogu panelu stosu, aby przedstawić wyniki.Najpierw kliknij OK w wyświetlonym oknie, a następnie wybierz środkową zakładkę wykresu o nazwie best confo. Następnie kliknij pierwszy wiersz tabeli wyników, który odpowiada konformacji o najniższej energii znalezionej podczas wyszukiwania. Struktura peptydu zostanie przekształcona w jej konformację o najniższej energii w oknie graficznym.Przeanalizuj tę konformację pod kątem cech charakterystycznych dla pasm beta lub helis alfa, szczególnie w obrębie pierwszych pięciu pozycji peptydowych. Wybierz ten region w sekwencji, a następnie kliknij ikonę pręta w lewym górnym rogu ekranu, aby wyświetlić wszystkie atomy. Następnie należy przeanalizować zestaw wyników energetycznych, aby wykreślić najlepsze konformacje.Jeśli konformacja o najniższej energii jest oddzielona znaczną luką od pozostałych konformacji, wskazuje to na tendencję do tworzenia sztywnej struktury. Aby ocenić wyniki, otwórz fiolkę projektu i wybierz widok stosu mechaniki molekularnej (molecular mechanics stack view), co spowoduje wyświetlenie tabeli konformacji w stosie. Zwizualizuj konformacje stosu, klikając ikonę histogramu wykresu.Na koniec kliknij przycisk odtwarzania stosu mechaniki molekularnej, aby utworzyć animację stosu i zwizualizować preferencje konformacyjne ujawnione podczas zwijania. Przedstawiono wyniki dla zwijania R two. Konformacja nie jest helisą alfa i stanowi przypadkową kłębkową strukturę, co jest oczekiwane dla koron pętli V three, zwłaszcza w fragmencie od reszty 12 do 14.W pętli V3 widoczna jest wyraźna preferencja konformacyjna dla pasm beta w całym stosie, natomiast zaobserwowano bardzo mało konformacji helikalnych alfa. Lokalna konformacja pasma beta rozpoznawana jest po rozciągniętym, liniowym kształcie. W tym miejscu znajduje się nietypowa sekwencja izoleucyna-prolina-metionina szczepu R2, która jest rzadka w szczepach HIV w tej pozycji i której przypisuje się odpowiedzialność za niezwykłe cechy R2.Ponadto, między konformacją o najniższej energii a konformacją o drugiej najniższej energii widoczna jest przerwa energetyczna wynosząca prawie trzy jednostki. Zatem struktura przyjmuje konformację o najniższej energii przez ponad 99% czasu, co sugeruje, że korona R two V three oraz jej lokalna konformacja beta strain w pozycjach od 12 do 14 mają strukturę bardziej sztywną, a nie całkowicie elastyczną. Przedstawiliśmy właśnie sposób fałdowania sekwencji korony pętli V three przy użyciu algorytmu abio zaimplementowanego w oprogramowaniu ICM oraz sposób analizy wyników na przykładzie szczepu R two wirusa HIV.Przykładowo, podczas wykonywania tej procedury ważne jest uważne dobranie tożsamości peptydu fałdującego odpowiadającego fragmentowi korony V3, a także właściwa interpretacja wyników w odniesieniu do preferencji konformacyjnej i energii, w oparciu o konsultacje z ekspertem w dziedzinie modelowania molekularnego. To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.

assessment-immunologically-relevant-dynamic-tertiary-structural

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ocena immunologicznie istotnych dynamicznych cech struktury trzeciorzędowej sekwencji korony pętli V3 wirusa HIV-1 R2 poprzez fałdowanie ab initio

Protokół opisuje wysokoprzepustowe podejście do wyznaczania struktur białek błonowych z wykorzystaniem krio-tomografii elektronowej oraz trójwymiarowego przetwarzania obrazów. Obejmuje on szczegóły przygotowania preparatów, gromadzenia danych, ich przetwarzania i interpretacji, a kończy się opracowaniem reprezentatywnego celu dla tej metody, jakim jest glikoproteina otoczki HIV-1. Procedury obliczeniowe zostały zaprojektowane w sposób umożliwiający badaczom i studentom pracę zdalną oraz wkład w...

Wyznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczki HIV z wykorzystaniem krioelektronowej tomografii i zautomatyzowanego uśredniania subtomogramów

Niniejszy artykuł opisuje metodę uzyskiwania trójwymiarowej (3D) struktury cząsteczek zmontowanych helikalnie przy użyciu krio-mikroskopii elektronowej. W niniejszym protokole wykorzystujemy zgromadzenia kapsydów HIV-1, aby zilustrować szczegółową procedurę rekonstrukcji 3D w celu uzyskania mapy gęstości za pomocą iteracyjnej metody rekonstrukcji helikalnej w przestrzeni rzeczywistej.

Struktura zgromadzeń kapsydu HIV-1 określona za pomocą kriomikroskopii elektronowej i iteracyjnej helikalnej rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej

Przewidywanie wykorzystania koreceptora przez HIV-1 jest niezbędne do podania nowej klasy leków antyretrowirusowych, mianowicie antagonistów koreceptorów. Można to przeprowadzić poprzez analizę sekwencji genu env i późniejszą interpretację za pomocą internetowego systemu interpretacyjnego (geno2pheno[coreceptor]).

Przewidywanie wykorzystania koreceptora HIV-1 (tropizmu) poprzez analizę sekwencji z zastosowaniem podejścia genotypowego

Wysokoprzepustowa selektywna acylacja hydroksylowa 2' analizowana przez rozszerzenie startera (SHAPE) wykorzystuje nowatorską technologię sondowania chemicznego, odwrotną transkrypcję, elektroforezę kapilarną i oprogramowanie do przewidywania struktury drugorzędowej do określenia struktur RNA od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Zrozumienie konformacji antygenów powierzchniowych wirusa jest niezbędne do oceny neutralizacji przeciwciał i kierowania projektem skutecznych immunogenów szczepionkowych. W tym miejscu opisujemy komórkowy test ELISA, który umożliwia badanie rozpoznawania trimerycznego HIV-1 Env ulegającego ekspresji na powierzchni transfekowanych komórek przez specyficzne przeciwciała anty-Env.

Ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA

Przedstawiono protokół do badania online relacji sekwencja-struktura-dynamika białek za pomocą Bio3D-web.

Badanie zależności między sekwencją, strukturą i dynamiką białek za pomocą Bio3D-web

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Tutaj opisane są protokoły przygotowania zestawów wirusów odpowiednich do analizy ciekłego EM i krio-EM w nanoskali przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Postęp w obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości zespołów wirusów w cieczach i lodzie

Tropizm HIV można wywnioskować z regionu V3 otoczki wirusa. Region V3 jest amplifikowany w trzech powtórzeniach metodą zagnieżdżonej RT-PCR, sekwencjonowany, a następnie interpretowany przy użyciu oprogramowania bioinformatycznego. Próbki zawierające jedną lub więcej sekwencji z niskimi wartościami g2P są klasyfikowane jako wirusy non-R5.

Genotypowe wnioskowanie o tropizmie HIV-1 z wykorzystaniem sekwencjonowania populacyjnego pętli V3

Poznaj metodę fałdowania ab initio wykorzystywaną do analizy dynamicznych preferencji strukturalnych pętli V3 szczepu R2 HIV-1. Symulacje komputerowe pozwalają skorelować cechy strukturalne z wrażliwością na neutralizację wirusa.

Ocena immunologicznie istotnych dynamicznych trzeciorzędowych cech strukturalnych sekwencji R2 korony pętli HIV-1 V3 metodą fałdowania ab initio (Wideo) | JoVE Journal

Ocena immunologicznie istotnych dynamicznych cech struktury trzeciorzędowej sekwencji R2 korony pętli V3 HIV-1 za pomocą zwijania ab initio

Przeglądaj więcej filmów