Oznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczki HIV za pomocą tomografii krioelektronowej i automatycznego uśredniania subtomogramu

Ponad 60 milionów osób zostało zarażonych wirusem HIV, który powoduje AIDS. HIV AIDS jest globalnym kryzysem zdrowotnym i chociaż intensywne wysiłki badawcze w dramatyczny sposób przyczyniły się do tego, że osoby zakażone znacznie przyjęły życie, prawdziwa szczepionka pozostaje nieuchwytna. Głównym celem badań nad szczepionką przeciwko HIV jest glikoproteina otoczkowa, której HIV używa do wnikania do komórek docelowych.

W tym filmie pokazujemy, w jaki sposób uzyskujemy struktury tego ważnego białka za pomocą techniki obrazowania zwanej kriotomografią elektronową. Zaczynając od oczyszczonego wirusa HIV, pokazujemy etapy przygotowania zamrożonych próbek, kroki w rejestrowaniu obrazów mikroskopowych elektronów z tych zamrożonych próbek oraz etapy przekształcania tych obrazów w modele strukturalne, które mogą być przydatne do projektowania szczepionki przeciwko HIV AIDS. Unikalnym aspektem tego, co prezentujemy w tym filmie, jest to, że praca zostanie zademonstrowana przez członków jej laboratorium w szerokim przedziale wiekowym, od uczniów gimnazjów i liceów, przez studentów i absolwentów college'u, aż po stypendystów podoktoranckich i starszych naukowców.

Przygotowanie zeszklonych próbek wirusów nadających się do tomografii krioelektronowej odbywa się poprzez rozprowadzenie wodnej zawiesiny wirusów przez małe otwory w folii węglowej wspartej na miedzianej siatce, a następnie szybkie zamrożenie wirusów. Celem tego etapu jest przygotowanie zamrożonej próbki nienaruszonych wirusów schwytanych w stanie zbliżonym do rodzimego. Na początek siatki są umieszczane wewnątrz jednostki wyładowczej jarzeniowej.

To urządzenie czyści kratki, wystawiając je na działanie zjonizowanego gazu. Teraz, gdy siatki są gotowe do użycia, przygotowuje się zawiesinę wirusów zmieszaną z małymi cząsteczkami złota. Cząstki te są niezbędne do gromadzenia i przetwarzania danych.

Następnie kroplę zawiesiny wirusa umieszcza się na świeżo oczyszczonej plazmowo siatce. Siatka jest następnie ładowana do robota, który osusza ją bibułą filtracyjną, redukując kroplę do cienkiej warstwy cieczy. Próbka jest następnie zanurzana w ciekłym etanie, który szybko zamraża wirusy z szybkością przekraczającą 100 000 kelwinów na sekundę.

Zamrożona siatka wgłębna jest następnie przenoszona do schowka w celu transportu do mikroskopu. Powtarza się to, aż żądana liczba siatek zostanie zamrożona. Teraz, gdy siatki próbek wirusa są gotowe, następnym krokiem jest załadowanie ich do mikroskopu.

W przypadku obrazowania można to zrobić ręcznie lub z pomocą robota. Gdy siatki próbek są ładowane ręcznie, użytkownik siedzi na specjalistycznej stacji, na której próbki mogą być manipulowane pod wpływem ciekłego azotu, próbki są umieszczane w przenośnej komorze chłodzonej azotem, która jest uszczelniana, opróżniana, a następnie mocowana do mikroskopu. Nowsze mikroskopy są w stanie bardziej zautomatyzowane ładowanie próbek.

W mikroskopie Titan Cryos zamrożone próbki są dostarczane do mikroskopu przez użytkownika, a następnie ładowane automatycznie za pomocą siatek próbek załadowanych do mikroskopu. Każda siatka może być zbadana przez użytkownika przed rozpoczęciem obrazowania. Parametry mikroskopu są ustawiane dla każdego obszaru na siatce próbki, który ma interesujące cechy.

W tym przypadku cechami są wirusy HIV. Gdy każdy nowy obszar jest definiowany, komputer mikroskopu zapisuje parametry obrazowania specyficzne dla obszaru. Gdy użytkownik zdefiniuje wszystkie interesujące go pozycje, komputer automatycznie ponownie odwiedza każdą pozycję i zbiera zestaw danych.

Każdy zestaw danych jest zbierany przez przechylenie siatki próbki w stosunku do wiązki elektronów, przy jednoczesnym zapewnieniu, że wiązka pozostaje skupiona w tym samym miejscu na siatce. Gromadzenie danych w mikroskopii elektronowej tradycyjnie wymagało od użytkowników siedzenia przy mikroskopie i fizycznej interakcji ze sprzętem. Ten styl interakcji mikroskopu jest tutaj pokazany podczas wizyty prezydenta Obamy w fabryce wywiadu.

Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie interfejsów komputerowych mikroskopów pozwalają użytkownikom monitorować i dostosowywać zbieranie danych w czasie rzeczywistym ze zdalnego komputera w laboratorium lub w innym miejscu. Aby zobrazować kształty otoczki, skoki glikoproteiny, informacje z setek pojedynczych obrazów muszą zostać uśrednione, aby wzmocnić sygnał. Jest to proces wymagający dużej mocy obliczeniowej, który jest tutaj realizowany za pomocą klastra komputerów o nazwie Bio Wolf.

Zlokalizowane w NIH, opracowano potężne metody wyodrębniania pojedynczych objętości i uśredniania informacji za pomocą algorytmów, które mogą pracować przy wysokich poziomach szumów. Nieodłącznie związane z tego typu danymi, mapy gęstości uzyskane zarówno z rodzimych wirusów, jak i wirusów złożonych z biologicznie ważnych cząsteczek stanowią bogatą bazę danych informacji na temat biologii strukturalnej HIV. Mapy gęstości ożywają przy szczegółach molekularnych, gdy dane są połączone z informacjami z krystalografii rentgenowskiej poszczególnych podjednostek, które tworzą skok glikoproteiny otoczki.

Dane pochodzące z tych tomosów mogą być bardzo gęste i trudne do interpret. 3D oprogramowanie dla przemysłu rozrywkowego może być używane do wizualizacji modeli 3D poprzez dodawanie kolorów, tekstur i oświetlenia, co ułatwia ich analizę. Powszechnie używane oprogramowanie do wizualizacji to Mirror, 3D, Studio Max i Maya.

Właśnie zademonstrowaliśmy krok po kroku procedury, w jaki sposób można uzyskać modele molekularne dla struktury otoczki. Glikoproteina, począwszy od oczyszczonego wirusa HIV. Za pomocą tej metody określiliśmy również struktury glikoproteiny otoczki w kompleksie z różnymi cząsteczkami, które mogą wiązać i wykorzystywać wirusa.

Tutaj pokazujemy przykład struktury glikoproteiny otoczki w kompleksie z przeciwciałem o nazwie B12. Zrozumienie, dlaczego niektóre cząsteczki mogą wiązać się i wykorzystywać wirusa, a inne nie, jest bardzo ważne dla racjonalnego projektowania szczepionek. Określenie struktur molekularnych glikoprotein otoczki wirusa HIV lub innych wirusów, takich jak grypa i Ebola, jest kluczem do zrozumienia wnikania i wykorzystywania wirusa.

Jak widzieliście, krioelektronowa tomografia staje się obecnie potężnym narzędziem do osiągnięcia tego celu.