Postęp w obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości zespołów wirusów w cieczach i lodzie

Tutaj opisane są protokoły przygotowania zestawów wirusów odpowiednich do analizy ciekłego EM i krio-EM w nanoskali przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zainteresowanie mikroskopią ciekłych elektronów gwałtownie wzrosło w ostatnich latach, ponieważ możemy teraz wizualizować procesy w czasie rzeczywistym w nanoskali. Poszerzona wiedza na temat tych elastycznych struktur może pomóc nam w opracowaniu nowych odczynników do zwalczania pojawiających się patogenów, takich jak SARS-CoV-2. Oglądanie białek w płynnym środowisku pomaga naśladować systemy biologiczne i daje nam możliwość spojrzenia na białka w bardziej dynamiczny sposób.

Ten eksperyment pokaże Ci nowe techniki używania i wizualizacji białek zarówno w środowisku ciała szklistego, jak i w środowisku płynnym. Najnowsze wyniki obejmują dynamiczne spostrzeżenia na temat kandydatów na szczepionki w terapiach opartych na przeciwciałach obrazowanych w płynie. Korelacyjne zastosowania cieczy i krio-EM zwiększają naszą zdolność do wizualizacji dynamiki molekularnej, zapewniając unikalny kontekst dla ludzkiego zdrowia i chorób.

Czytelnicy korzystający z konwencjonalnych technologii TEM lub cryo-EM mogą rozważyć wdrożenie przepływów pracy z płynnym EM, aby zapewnić nowe dynamiczne obserwacje swoich próbek w sposób, który uzupełnia ich obecne strategie. Dostępne na rynku systemy ciekłego EM mogą zapewniać przepływ, mieszanie, bodźce elektrochemiczne i kontrolę temperatury, które są niezbędne w wielu zastosowaniach obrazowania w czasie rzeczywistym. Przedstawiona tutaj metoda kanapkowa z mikroczipem opisuje prosty sposób na poziomie podstawowym, polegający na pierwszym obejrzeniu próbek w cieczy przed przejściem do bardziej złożonego systemu komercyjnego do eksperymentów in situ.

Na początek wyczyść mikrochipy z azotku krzemu, inkubując każdy chip w 150 mililitrach acetonu przez dwie minuty, a następnie inkubując w 150 mililitrach metanolu przez dwie minuty. Pozostaw wióry do wyschnięcia w laminarnym przepływie powietrza. Plazmowo oczyść wysuszone wióry za pomocą przyrządu do wyładowań jarzeniowych działającego w standardowych warunkach przez 45 sekund przy użyciu argonu.

Następnie załaduj mikroczip z suchą bazą do końcówki uchwytu próbki i dodaj około 0,2 mikrolitra próbki do chipa bazowego. Po inkubacji trwającej od jednej do dwóch minut, umieść górny wiór na mokrym chipsie podstawowym zawierającym próbkę. Umieść zespół razem, aby utworzyć hermetycznie zamkniętą obudowę utrzymywaną mechanicznie za pomocą trzech mosiężnych.

Przepompuj końcówkę do 10 do minus sześciu torów za pomocą turbopompowanej suchej przepompowni. Uchwyt jest teraz gotowy do włożenia do TEM. Plazma czyści mikroczipy i siatki węglowe za pomocą przyrządu do wyładowań jarzeniowych przez 45 sekund.

I dodaj około dwóch mikrolitrów próbki do rozżarzonego mikroczipa umieszczonego na opakowaniu żelowym. Usunąć nadmiar roztworu za pomocą bibuły filtracyjnej lub pipety i inkubować przez jedną do dwóch minut. Następnie dodaj rozżarzoną siatkę węglową do mokrego mikrochipa zawierającego próbkę.

Umieść zespół razem za pomocą pojedynczego uchylnego uchwytu na próbkę w temperaturze pokojowej, aby utworzyć hermetycznie zamkniętą obudowę. Alternatywnie użyj klipsów siatkowych automatycznego ładowacza i umieść zespół kanapkowy na dolnym zacisku C. Umieść górny zacisk na górze zespołu i użyj standardowego clampnarzędzie, aby uszczelnić zespół.

Próbka jest teraz gotowa do włożenia do TEM. Badaj próbki umieszczone w automatycznych podajnikach w warunkach kriogenicznych lub w temperaturze pokojowej. W przypadku obrazowania cieczą EM należy załadować uchwyt próbki do TEM wyposażonego w pistolet do emisji w terenie i pracować pod napięciem 200 kilowoltów.

Włączyć pistolet i wyregulować eucentryczną wysokość stolika mikroskopu w stosunku do próbki za pomocą funkcji woblera, przechylając próbkę od minus 15 stopni do plus 15 stopni w kolumnie. Ta procedura dostosowuje stolik w kierunku Z, aby dostosować go do grubości próbki i pomaga zapewnić dokładne powiększenie podczas nagrywania obrazu. Rejestruj obrazy w postaci długich filmów w klatkach lub pojedynczych obrazów za pomocą pakietu oprogramowania do szeregowego gromadzenia danych, wdrażając zautomatyzowane procedury obrazowania.

Uzyskuj obrazy w warunkach niskiej dawki przy powiększeniach w zakresie od 28 000X do 92 000X i 40 klatkach na sekundę. Dostosuj czasy ekspozycji, aby zminimalizować uszkodzenia wiązki próbki i użyj zakresu rozmycia od minus jednego do czterech mikrometrów przy określonym powiększeniu. Jeśli napotkasz gęsty roztwór, użyj wyższych wartości rozmycia lub wybierz inny obszar zainteresowania.

Upewnij się, że roztwór jest obecny w próbkach przez cały czas trwania sesji obrazowania, skupiając wiązkę elektronów na obszarze protektorowym, który nie jest używany do zbierania danych, dopóki nie utworzą się pęcherzyki. Analizuj filmy pod kątem cząstek SARS-CoV-2 za pomocą programu RELION-3.0.8 lub dowolnego innego oprogramowania do przetwarzania obrazu. Wykonaj korekcję ruchu za pomocą programu MotionCor2.

Po skorygowaniu wyodrębnij cząstki za pomocą narzędzia do automatycznego wybierania w pakiecie oprogramowania programu. Typowe rozmiary pudełek to 330 pikseli dla próbek płynnych i 350 pikseli dla próbek lodu. Oblicz początkowe rekonstrukcje przy użyciu symetrii C1 z procedurą wstępnego modelu 3D programu i opcjami modelu ab initio w pakiecie oprogramowania do przetwarzania danych.

Następnie wykonaj protokoły udoskonalające w oprogramowaniu do przetwarzania danych. Analizuj wyniki za pomocą pakietu oprogramowania do analizy struktury molekularnej, oceniając dynamiczne zmiany. Porównanie struktur ciekłego EM i krio-EM w podtypie trzeciego wirusa związanego z adenowirusem lub AAV przedstawiono tutaj.

Reprezentatywne obrazy pokazują strukturę AAV w roztworze i w lodzie. Widoki obrotowe podjednostki AAV VP1 wyodrębnionej ze struktur cieczy i lodu są pokazane tutaj. Obrazy te reprezentują wartości dynamiczne w strukturach ciekłych wygenerowane za pomocą funkcji mapy morfów w oprogramowaniu do analizy struktury molekularnej.

Średnie struktury z wielu zespołów wirusów wykazują zmiany konformacyjne z prawie 5% zmianą średnicy mierzoną przy użyciu danych EM. Pokazano tutaj obraz zespołów subwirusowych SARS-CoV-2 wyizolowanych z frakcji surowicy pacjentów z COVID-19. Te białe pęcherzyki wskazują na obecność cieczy w próbce.

Rekonstrukcja EM tych subwirusowych zespołów jest pokazana tutaj z kolorowymi gęstościami radialnymi w pięcionanometrowych warstwach mapy. Reprezentatywny obraz przedstawia analizę dwuwarstwowych cząstek rotawirusa przygotowanych w szklistym lodzie przy użyciu techniki kanapkowej z mikroczipem. Należy zminimalizować lub unikać stosowania detergentów, glicerolu, polietylenu, glikoli i wysokich poziomów cukrów w przypadku obrazowania ciekłym EM.

Odczynniki te mogą wprowadzać artefakty, powodować nadmierne bulgotanie, produkty hydrolizy i wolne rodniki z powodu uszkodzenia wiązki. Zastosowanie tych protokołów pozwoli naukowcom na badanie dynamicznych procesów z najdrobniejszymi szczegółami atomowymi. Obejmuje to wiele dziedzin nauki, w tym medycynę, nauki przyrodnicze i badania materiałowe.

Przedstawione tutaj protokoły opisują, w jaki sposób najnowocześniejsze narzędzia mogą zapewnić ekscytujący sposób wizualizacji makrocząsteczek biologicznych za pomocą nowych oczu. Mikroskopia ciekłych elektronów może poprawić sposób, w jaki badamy te nowe wirusy, które stanowią zagrożenie dla zdrowia ludzkiego, być może nawet przyczyniając się do naszych środków gotowości na wypadek pandemii.