Przewidywanie wykorzystania koreceptora HIV-1 (tropizmu) poprzez analizę sekwencji z zastosowaniem podejścia genotypowego

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przewidzenie wykorzystania koreceptora przez HIV-1 w celu podania nowej klasy leków przeciwretrowirusowych. Osiąga się to poprzez izolację wirusowych kwasów nukleinowych genomowych, wirusowego RNA lub prowirusowego DNA z krwi pacjenta po amplifikacji regionu otoczki. Region V3 wirusa, który jest głównym determinantem tropizmu, jest amplifikowany za pomocą nested PCR.

Następnie amplikon V3 jest sekwencjonowany z użyciem różnych starterów w celu wygenerowania pliku fasta. Otrzymane wyniki wskazują na tropizm wirusa oraz podatność na antagonistów koreceptorów na podstawie wskaźnika wyników fałszywie dodatnich (FPR), wyznaczonego za pomocą internetowego narzędzia interpretacyjnego geno to pheno coreceptor. W zależności od wykorzystywanego koreceptora wirusy HIV są klasyfikowane jako R5 lub X4.

Marawirok wiąże się z receptorem CCR5, hamując wnikanie wirusów R5 do komórki docelowej. W przebiegu choroby X mogą pojawić się i zdominować wirusy X4. Określenie wykorzystywanego receptora, nazywane tropizmem, jest zatem obowiązkowe przed podaniem marawiroku, zgodnie z wymogami EMA i FDA.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość bardzo łatwego, równoległego oznaczenia oporności na inne klasy leków antiretroviralnych. Metoda ta pozwala na znacznie bardziej spersonalizowaną medycynę, ponieważ wartości odcięcia dla wyników tropizmu mogą być modyfikowane zgodnie z potrzebami pacjenta. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas na początku lat dziewięćdziesiątych, kiedy chcieliśmy poznać podstawy molekularne różnic w wzroście szczepów HIV w hodowlach komórkowych oraz progresji choroby u pacjentów; procedura ta zostanie zademonstrowana przez technika z naszej grupy przed rozpoczęciem niniejszego protokołu.

Próbki są pobierane w formie krwi z EDTA w ośrodku klinicznym i przesyłane do laboratorium w celu rozpoczęcia izolacji kwasów nukleinowych HIV z 1000 µL serum lub osocza krwi pełnej przy użyciu systemu mag pure compact oraz zestawu do izolacji kwasów nukleinowych zgodnie z instrukcjami producenta. Uzyskane RNA lub DNA jest następnie rozpuszczane w 50 µL buforu TE. Kolejnym krokiem jest amplifikacja regionu otoczki kwasu nukleinowego za pomocą reakcji RT-PCR w przypadku RNA lub zwykłego PCR w przypadku DNA, zgodnie z opisem w tekście; reakcja powinna wygenerować produkt o długości 1 245 par zasad, obejmujący większość regionu białka otoczki. Aby amplifikować region V3 białka otoczki, należy przeprowadzić nested PCR, wykorzystując 5 µL z pierwszej reakcji PCR jako matrycę.

Przygotuj reakcje, używając master mixu do wewnętrznej metody nested PCR, zgodnie z opisem w tekście. Parametry prowadzenia nested PCR są również tam określone. Po amplifikacji regionu V3 przeanalizuj produkt PCR za pomocą elektroforezy żelowej, aby zweryfikować obecność oczekiwanego produktu o długości 902 par zasad przed przystąpieniem do sekwencjonowania.

Oczyść produkt PCR zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Po oczyszczeniu produktu PCR przeprowadź reakcję sekwencjonowania zgodnie z opisem w tekście. Po zakończeniu reakcji oczyść próbki do sekwencjonowania, używając cidex G 50 superfine oraz wielościeżkowej płytki filtrującej z membraną durapore, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części tej procedury. Aby zsekwencjonować oczyszczony produkt, przygotuj sekwenator, sprawdzając polimer i wymieniając bufor.

Następnie należy załadować próbki, ustawić warunki i rozpocząć bieg. Po zakończeniu sekwencjonowania program DNA STAR laser gene może zostać użyty do wyrównania i edycji sekwencji.

Amplikon V3 sekwencuje się z użyciem co najmniej jednego primera bezpośredniego i jednego primera odwrotnego. Program LaserGene dopasowuje pliki ABI otrzymane z sekwenatora do sekwencji referencyjnych. LaserGene tworzy sekwencję konsensusową analizowanej próbki dla regionu V3, consensus B i envelope, wykorzystując wszystkie dostępne surowe dane (z pominięciem sekwencji referencyjnych) i zapisuje ją jako plik FASTA.

Plik FASTA to plik tekstowy zawierający nagłówek z nazwą próbki oraz sekwencję nukleotydową. Aby rozpocząć interpretację danych i przewidywanie tropizmu, prześlij plik FASTA do internetowego systemu interpretacyjnego. W sekcji Geno Tono co-receptor wybierz wartość odcięcia FPR, poniżej której wirus zostanie zaklasyfikowany jako R five.

Zgodnie z niemieckimi wytycznymi, wirus jest klasyfikowany jako R5, gdy FPR wynosi 20% lub więcej, oraz jako X4, gdy FPR jest mniejszy niż 12,5%. Wybierz dodatkowe parametry kliniczne, jeśli są dostępne, a następnie wybierz opcję „align and predict”. Serwer ten tłumaczy sekwencję nukleotydową na aminokwasy, dopasowuje ją do sekwencji konsensusowej V3 i określa klasyfikację podtypu. Dodatkowo generuje prognozę wykorzystania koreceptora wyrażoną jako FPR.

Wynik przedstawia stopniowaną interpretację zależną od prawdopodobieństwa wykorzystania koreceptora. Przy wysokich wartościach FPR można z dużym prawdopodobieństwem stwierdzić, że wirus nie jest X four, natomiast przy niskich wartościach FPR nie ma pewności co do charakteru wirusa, jeżeli interpretacja, tekst i kolor tła są zielone. Wskazuje to na bezpieczne podawanie Ravi Rock, podczas gdy kolor żółty sugeruje możliwe niskie ryzyko stosowania Ravi Rock, a kolor czerwony oznacza, że Ravi Rock nie powinien być przepisywany.

Dodatkowo serwer generuje raport w formacie PDF, który można wydrukować i przesłać do lekarza. Dodatkowe dane, takie jak imię i nazwisko pacjenta lub data pobrania krwi, mogą zostać wprowadzone ręcznie za pomocą programu do edycji plików PDF. Na komputerze użytkownika, z zachowaniem prywatności, można również dodać szczegółowe uwagi.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób określania tropizmu wirusowego za pomocą narzędzia geno-pheno receptor. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest regularne przeprowadzanie kontroli jakości. Pamiętaj, że praca z HIV może być niezwykle niebezpieczna, dlatego zawsze należy stosować odpowiednie środki ostrożności i korzystać z autoryzowanych laboratoriów biologicznego bezpieczeństwa.