Name: Przewidywanie użycia koreceptorów HIV-1 (tropizm) za pomocą analizy sekwencji przy użyciu podejścia genotypowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj metodę przewidywania użycia koreceptorów HIV-1 poprzez analizę sekwencji regionu V3 genu env. Technika ta umożliwia spersonalizowane leczenie antyretrowirusowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy otrzymali finansowanie z projektów Corus, MedSys Cell Entry, CHAIN oraz Resina.

Protokół został podsumowany na Rys. 4.
1. Pobieranie próbek krwi
<ol>
 <li>Pobrać co najmniej 3 ml krwi do probówek z EDTA w ośrodku klinicznym.</li>
 <li>Próbki można przechowywać do tygodnia w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Próbki krwi z EDTA należy jak najszybciej wysłać do laboratorium pocztą zwykłą.</li>
</ol>
2. Izolacja RNA i/lub DNA HIV
<ol>
 <li>Wyizolować wirusowe RNA i/lub DNA z 1000 μl krwi pełnej, surowicy lub osocza, wykorzystując zestaw MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation I oraz system MagNA Pure Compact System.</li>
 <li>Eluować otrzymane RNA lub DNA w 50 μl buforu TE. Alternatywnie można zastosować inne procedury oczyszczania kwasów nukleinowych.</li>
</ol>
3. Amplifikacja regionu env
Przeprowadź amplifikację regionu env (Ryc. 2 i 4) z RNA plazmy lub prowiralnego DNA. Powstanie produkt o długości 1245 bp, obejmujący większość białka Env (nt 6556-7811 zgodnie z HXB2).
<ol>
 <li>Próbki RNA: reakcja RT-PCR
 <ol>
 <li>Wirusowe RNA posiada bardzo złożoną strukturę drugorzędową (Rys. 4), która może utrudniać reakcję RT. Aby uniknąć tego problemu, inkubować 10 μl RNA w temperaturze 65°C przez 10 minut (bezpośrednio w probówce PCR i w termocyklerze), a następnie obniżyć temperaturę do 50°C.</li>
 <li>Dodać 40 μl PCR Master Mix zawierającego startery Env-F i Env-R.
 Master Mix dla systemu RT-PCR In-House: 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>objętość/reakcja (μl)</td>
 <td>stężenie końcowe</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-free H2O</td>
 <td>14.4</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5x Buffer (Qiagen OneStep RT-PCR Kit)</td>
 <td>10</td>
 <td>1x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5x Q-Solution</td>
 <td>10</td>
 <td>1x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTP Mix (10 mM each)</td>
 <td>2</td>
 <td>400 μM każdego dNTP</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Enzym-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit)</td>
 <td>2</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primer Env-F (100 μM)</td>
 <td>0.3</td>
 <td>0.6 μM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primer Env-R (100 μM)</td>
 <td>0.3</td>
 <td>0.6 μM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase Inhibitor (RNasin)</td>
 <td>1</td>
 <td>5 jednostek/reakcja</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 Env-F: 5'- CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3' (nt 6556→6586 zgodnie z HXB2)
 Env-R: 5'- AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3' (nt 7785←7811)</li>
 <li>Przeprowadzić reakcję RT w temperaturze 50°C przez 30 minut.</li>
 <li>Przeprowadzić pierwszą reakcję PCR zgodnie z poniższymi parametrami:
 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>95°C, 15min</td>
 <td>1 x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>95°C, 30 sec 
 50°C, 30 sec 
 72°C, 2 min</td>
 <td>1 x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>95°C, 30 sec 
 56°C, 30 sec 
 72°C, 2 min</td>
 <td>38 x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>72°C, 10 min 
 4°C ∞</td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Próbki DNA: reakcja PCR
 W przypadku próbek prowirusowego DNA wstępna reakcja RT nie jest wymagana i można bezpośrednio rozpocząć reakcję PCR.
 <ol>
 <li>Dodać 40 μl PCR Master Mix do 10 μl prowirusowego DNA. 
 Master Mix dla systemu PCR In-House: 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>objętość/reakcja (μl)</td>
 <td>stężenie końcowe</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-free H2O</td>
 <td>15.4</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5x Buffer (HotStarTaq DNA Polymerase)</td>
 <td>10</td>
 <td>1x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5x Q-Solution</td>
 <td>10</td>
 <td>1x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTP Mix (10 mM each)</td>
 <td>2</td>
 <td>400 μM każdego dNTP</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Enzym-Mix (HotStarTaq DNA Polymerase)</td>
 <td>2</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primer Env-F (100 μM)</td>
 <td>0.3</td>
 <td>0.6 μM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primer Env-R (100 μM)</td>
 <td>0.3</td>
 <td>0.6 μM</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 Env-F: 5'- CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3' (nt 6556→6586)
 Env-R: 5'- AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3' (nt 7785←7811)</li>
 <li>Zastosować warunki PCR opisane wcześniej dla próbek RNA (Krok 3.1.4).</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. Amplifikacja regionu V3: PCR zagnieżdżony
<ol>
 <li>Do reakcji nested PCR należy użyć 5 μl produktu z pierwszej reakcji PCR (bez wcześniejszej analizy w żelu agarozowym) jako matrycy i dodać 95 μl Master Mixu do PCR.
 Master Mix do Nested-In-House PCR
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>objętość/reakcja (μl)</td>
 <td>stężenie końcowe</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H2O</td>
 <td>61.9</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x PCR Buffer</td>
 <td>10</td>
 <td>1x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5x Q-Solution</td>
 <td>20</td>
 <td>1x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTP Mix (10 mM each)</td>
 <td>2</td>
 <td>200 μM każdego dNTP</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Starter Env-2F (100 μM)</td>
 <td>0.3</td>
 <td>0.6 μM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Starter Env-2R (100 μM)</td>
 <td>0.3</td>
 <td>0.6 μM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HotStarTaq DNA Polymerase</td>
 <td>0.5</td>
 <td>2,5 jednostek/reakcja</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 Env-2F: 5'- GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3' (nt 6838→6864)
 Env-2R: 5'- CACCACTCTTCTCTTTGCCTTGGTGGGTGC -3' (nt 7712←7742)</li>
 <li>Reakcję PCR należy przeprowadzić zgodnie z następującymi parametrami:
 <table border="0">
 <tbody>
 <tr>
 <td> 
 93°C, 15 min</td>
 <td>1 x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>95°C, 30 s 
 50°C, 30 s 
 72°C, 90 s</td>
 <td>1 x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>95°C, 30 s 
 56°C, 30 s 
 72°C, 90 s</td>
 <td>43 x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>72°C, 10 min 
 4°C ∞</td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>Produkt PCR należy przeanalizować w 1% żelu agarozowym (Rys. 4). Oczekiwany produkt ma długość 902 bp.</li>
 <li>Oczyszczanie próbek do sekwencjonowania.
 <ol>
 <li>Produkt PCR należy oczyścić za pomocą zestawu Qiagen PCR-Purification, stosując protokół, roztwory i mikrokolumny dostarczone przez producenta. Elucję przeprowadza się w 30-100 μl buforu PE, w zależności od intensywności prążka.</li>
 <li>Alternatywnie próbki można oczyścić przy użyciu egzonukleazy I i Fast AP (fosfatazy alkalicznej Thermo). W tym celu do 15 μl produktu PCR dodaje się 6 μl mieszaniny Exo-AP Mix i inkubuje przez 15 minut w temperaturze 37°C.
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>580 μl H2O</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>66 μl fast AP</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>13.4 μl Exo I</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. Reakcja sekwencjonowania amplikonu V3
<ol>
 <li>Reakcja sekwencjonowania polega na przeprowadzeniu reakcji PCR z użyciem tylko jednego z poniższych starterów:
 Env-2: 5'- GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (nt 6959→6980) 
 Env-5: 5'- AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3' (nt 7352←7371) 
 Env-6: 5'- GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3' (nt 6979→7000) 
 Env-7: 5'- TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3' (nt 7530←7549) 
 Env-10: 5' - GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (nt 7478←7507) 
 Env-11: 5' - TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (nt 7638←7664) 
 Startery pierwszego wyboru to: Env-2, Env-6 lub Env-7, Env-11</li>
 <li>Użyć 1 μl oczyszczonego amplikonu V3 jako matrycy i dodać 9 μl master-mixu do PCR.
 Master Mix do sekwencjonowania:
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>4 μl mieszaniny do sekwencjonowania (HIV-Genotyping Kit)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 μl H2O</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 μl startera (100 pmol/μl)</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>Reakcję sekwencjonowania przeprowadzić zgodnie z poniższymi parametrami:
 <table border="0">
 <tbody>
 <tr>
 <td>96°C, 10 sec</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50°C, 10 sec</td>
 <td>36 x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60°C, 45 sec</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4°C ∞</td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
</ol>
6. Oczyszczanie próbek do sekwencjonowania
Oczyść sekwencje, wykorzystując Sephadex G-50 superfine.
<ol>
 <li>Wypełnij odpowiednią liczbę dołków w „loaderze kolumn” żywicą Sephadex G-50 superfine. Przenieś Sephadex na płytkę filtrującą MAHVN4510, odwracając ją.</li>
 <li>Dodaj 300 μl wody Milli-Q H2O do każdego dołka w płytce filtrującej i inkubuj przez co najmniej 3h w temperaturze 2-8°C.</li>
 <li>Wiruj płytki przez 5 min przy 910Xg w temperaturze 4-15°C. Usuń filtrat.</li>
 <li>Dodaj 10 μl H2O do produktu sekwencjonowania, a następnie nanieś produkt na płytkę z napęczniałym Sephadexem.</li>
 <li>Aby uzyskać oczyszczony produkt, wiruj płytkę przez 5 min przy 910Xg w temperaturze 4-15°C i zbierz filtrat.</li>
</ol>
7. Sekwencjonowanie oczyszczonych próbek na sekwenconversorze ABI Prism 3130 XL
<ol>
 <li>Przed każdym uruchomieniem należy wymienić bufor i sprawdzić objętość polimeru (POP7). W razie potrzeby należy zastąpić zużytą kolbę z polimerem nową.</li>
 <li>Należy zastosować zapisane warunki analizy, w tym czas wstrzyknięcia wynoszący 18 sekund.</li>
 <li>W tym urządzeniu zbieranie danych sygnałowych z jednego przebiegu dla 16 próbek sekwencyjnych trwa około 60 min (kapilara 36 cm) lub 150 min (kapilara 50 cm).</li>
</ol>
8. Edycja sekwencji
<ol>
 <li>Do wyrównania i edycji sekwencji należy użyć programu Lasergene (DNA-Star) (Ryc. 5). Można zastosować również inne programy do edycji sekwencji. Jako referencje należy wykorzystać "V3-Consensus B" oraz sekwencję konsensusową env.</li>
 <li>Program Lasergene tworzy sekwencję konsensusową analizowanej próbki, wykorzystując wszystkie dostępne surowe dane, i zapisuje ją w formacie pliku FASTA. Plik FASTA jest plikiem tekstowym, który zawiera nagłówek z nazwą próbki oraz sekwencję nukleotydową.</li>
</ol>
9. Interpretacja danych sekwencjonowania i przewidywanie tropizmu
<ol>
 <li>Interpretacja danych sekwencjonowania jest wykonywana za pomocą internetowego systemu interpretacyjnego geno2pheno[coreceptor] (<a href="http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php">http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php</a>). W celu przewidzenia tropizmu można wybrać różne ustawienia FPR. Ustawienie domyślne jest zgodne z niemiecko-austriackimi wytycznymi terapeutycznymi. W przypadku FPR ≥ 20%, wirus jest klasyfikowany jako R5, gdy FPR ≥ 20%, oraz jako X4 dla FPR &lt; 12,5%.</li>
 <li>Prześlij plik FASTA na serwer. Serwer ten transluduje sekwencję nukleotydową na aminokwasy, dopasowuje ją do sekwencji V3-Consensus B i dokonuje klasyfikacji podtypu. Ponadto generuje prognozę wykorzystania koreceptora (Rys. 4) wyrażoną jako wskaźnik wyników fałszywie dodatnich (FPR).</li>
</ol>
10. Reprezentatywne wyniki
Wynik geno2pheno[coreceptor] przedstawia stopniowaną interpretację tropizmu. W zależności od prawdopodobieństwa wykorzystania koreceptora, tekst interpretacji i kolor tła zmieniają się od zielonego (&lt;20% FPR), sugerującego bezpieczne podanie MVC, przez żółty, sugerujący możliwe, niskie ryzyko, aż po czerwony. Kolor czerwony sugeruje, aby nie przepisywać MVC. Dodatkowo serwer generuje raport w formacie pdf, który można wydrukować, uzupełnić o dane pacjenta i próbki, a następnie przesłać do lekarza. Przykłady wyników geno2pheno[coreceptor] przedstawiono na Rys. 6.
<img alt="Schemat cyklu życiowego HIV z celami leków antyretrowirusowych: fuzja wirusa, odwrotna transkrypcja, integracja." src="/files/ftp_upload/3264/3264fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat replikacji HIV. Wirion musi związać się z komórkowym receptorem CD4 oraz z koreceptorem CCR5 lub CXCR4. Koreceptor CCR5 może zostać zablokowany przez antagonisty CCR5, takie jak Maraviroc (MVC, Celsentri, Selzentry). Po fuzji błony wirusowej i komórkowej nukleokapsyd wirusa zostaje uwolniony do cytoplazmy. Nukleokapsyd ulega rozpadowi, a kompleks RNA wirusa zostaje uwolniony do cytoplazmy. Wirusowa odwrotna transkryptaza (RT) przepisuje genomowy RNA na DNA prowirusowe, które jest następnie transportowane do jądra i włączane do genomu gospodarza przez integrazę HIV. Komórkowe polimerazy RNA przepisują wirusowe RNA genomowe i mRNA z genomu prowirusowego. Białka wirusowe są produkowane w cytoplazmie i transportowane na powierzchnię komórki. Cząsteczki wirusa wypączkowują z komórek jako niedojrzałe, niezakaźne wiriony. Proteaza HIV rozcina białka, tworząc zakaźne cząsteczki. Zahamowanie jednego z tych etapów prowadzi do przerwania cyklu replikacyjnego.
Leki antyretrowirusowe oraz etapy replikacji, które one hamują, są zaznaczone na czerwono.
Wirusowe RNA oraz prowirusowe DNA (materiał używany do analizy tropizmu lub oporności) są zaznaczone na zielono.


<img alt="Mapa genomu HIV-1, schemat produktów genów, wizualizacja produktów RT-PCR i PCR zagnieżdżonego." src="/files/ftp_upload/3264/3264fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Genom prowirusowy HIV. Cząsteczka HIV zbudowana jest z różnych białek strukturalnych i zawiera różnorodne enzymy oraz białka pochodzenia zarówno wirusowego, jak i komórkowego. Na rycinie przedstawiono rozmieszczenie genów w genomie wirusa. Białka powierzchniowe gp120 i gp41 tworzą wypustki na powierzchni wirionu i kontaktują się z komórką ludzką, aby przeprowadzić fuzję błon. W dolnej części ryciny przedstawiono produkty amplifikacji PCR oraz startery użyte w naszym protokole.
<img alt="Wykres redukcji ładunku wirusowego (1998-2010) przedstawiający trendy procentowe niskiego ładunku wirusowego w czasie." src="/files/ftp_upload/3264/3264fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Odsetek pacjentów z pomiarami niskiego ładunku wirusowego (VL) analizowanych pod kątem określenia oporności na leki lub tropizmu w Instytucie Wirusologii Uniwersytetu w Kolonii (Niemcy).


<img alt="Proces izolacji DNA/RNA z próbki krwi; PCR, nested PCR w sekwencjonowaniu genetycznym; schemat analizy żelu agarozowego." src="/files/ftp_upload/3264/3264fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Ogólny schemat eksperymentu.. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3264/3264fig4_lg.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
<img alt="Chromatogram sekwencjonowania DNA, przedstawiający dane o sekwencji par zasad do analizy genetycznej." src="/files/ftp_upload/3264/3264fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Edycja sekwencji w programie Lasergene. Amplikony V3 są sekwencjonowane z użyciem co najmniej jednego primera forward i jednego primera reverse. Program Lasergene dopasowuje pliki „.abi” uzyskane z sekwenatora do sekwencji referencyjnych „V3-Consensus B” oraz env. Lasergene tworzy sekwencję konsensusową, wykorzystując wszystkie dostępne dane surowe. Sekwencje referencyjne mogą zostać oznaczone (wtedy są wyświetlane w kolorze szarym), aby nie miały wpływu na sekwencję konsensusową próbki.
<img alt="wyniki analizy geno2pheno, genotyp i interpretacja, porównanie i wizualizacja danych eksperymentalnych." src="/files/ftp_upload/3264/3264fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Raporty z predykcji tropizmu wygenerowane przez narzędzie geno2pheno[coreceptor]. Raporty są generowane jako pliki pdf, które można zapisać i uzupełnić na komputerze. Dodatkowe dane, takie jak imię i nazwisko pacjenta, data pobrania krwi itp., mogą zostać wprowadzone ręcznie za pomocą programu do edycji pdf. Można również dodać szczegółowe uwagi. Dane te znajdują się wyłącznie na komputerze użytkownika, a nie na serwerze geno2pheno[coreceptor]. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3264/3264fig6_lg.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

<ol><li>Heger, E., Schuelter, E., Klimkait, T., Lengauer, T., Kaiser, R., Walter, H., Sierra, S. European coreceptor proficiency panel test. 9th European Workshop on HIV & Hepatitis Treatment Strategies & Antiviral Drug Resistance, Paphos, Cyprus, , (2011).</li>
<li>Lengauer, T., Sander, O., Sierra, S., Thielen, T., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+prediction+of+HIV+coreceptor+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotech%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic prediction of HIV coreceptor usage.</a> Nature Biotech. 25 (12), 1407-1410 (2007).</li>
<li>McGovern, R., Dong, W., Zhong, X., Knapp, D., Thielen, A., Chapman, D., Lewis, M., James, I., Valdez, H., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-based+Sequencing+of+the+V3-loop+Is+Comparable+to+the+Enhanced+Sensitivity+Trofile+Assay+in+Predicting+Virologic+Response+to+Maraviroc+of+Treatment-na+ve+Patients+in+the+MERIT+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Population-based Sequencing of the V3-loop Is Comparable to the Enhanced Sensitivity Trofile Assay in Predicting Virologic Response to Maraviroc of Treatment-na ve Patients in the MERIT Trial.</a> 17th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).</li>
<li>Reuter, S., Braken, P., Jensen, B., Sierra-Aragon, S., Oette, M., Balduin, M., Kaiser, R., Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+in+treatment-experienced+patients+with+HIV-1+infection+-+experience+from+routine+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Maraviroc in treatment-experienced patients with HIV-1 infection - experience from routine clinical practice.</a> Eur. J. Med. Res. 15 (6), 231-237 (2010).</li>
<li>Recordon-Pinson, P., Soulie, C., Flandre, P., Descamps, D., Lazrek, M., Charpentier, C., Montes, B., Trabaud, M. A., Cottalorda, J., Schneider, V., Morand-Joubert, L., Tamalet, C., Desbois, D., Mace, M., Ferre, V., Vabret, A., Ruffault, A., Pallier, C., Raymond, S., Izopet, J., Reynes, J., Marcelin, A. G., Masquelier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+genotypic+prediction+of+HIV-1+coreceptor+use+versus+a+phenotypic+assay+and+correlation+with+the+virological+response+to+maraviroc%3A+the+ANRS+GenoTropism+study%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the genotypic prediction of HIV-1 coreceptor use versus a phenotypic assay and correlation with the virological response to maraviroc: the ANRS GenoTropism study.</a> Antimicrob. Agents. Chemother. 54 (8), 3335-3340 (2010).</li>
<li>Swenson, L. C., Knapp, D., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+and+accuracy+of+the+geno2pheno+co-receptor+algorithm+for+predicting+HIV+tropism+for+single+and+triplicate+measurements+of+V3+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Calibration and accuracy of the geno2pheno co-receptor algorithm for predicting HIV tropism for single and triplicate measurements of V3 genotype.</a> 10th International Congress on Drug Therapy in HIV Infection, Glasgow, UK, , (2010).</li>
<li>Macartney, M. J., Cameron, J., Strang, A., García, A., Booth, C., Marshall, N., Johnson, M., Geretti, A. M. Use of a genotypic assay for the prediction of HIV-1 coreceptor tropism and guiding the use of CCR5 antagonists in clinical practice. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).</li>
<li>Sierra, S., Thielen, A., Reuter, S., Jensen, B., Esser, S., Fätkenheuer, G., Lengauer, T., Pfister, H., Sichtig, N., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+determination+and+clinical+outcome+of+61+patients+under+MVC+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Tropism determination and clinical outcome of 61 patients under MVC treatment.</a> 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).</li>
<li>Obermeier, M., Carganico, A., Bieniek, B., Schleehauf, D., Dupke, S., Fischer, K., Freiwald, M., Neifer, S., Schuler, C., Mayr, C., Klausen, G., Köppe, S., üünsche, T., Berg, T., Baumgarten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+testing+from+proviral+DNA+-+analysis+of+a+subgroup+from+the+Berlin+Maraviroc+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Tropism testing from proviral DNA - analysis of a subgroup from the Berlin Maraviroc cohort.</a> 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).</li>
<li>Vandekerckhove, L. P., Wensing, A. M., Kaiser, R., Brun-Vezinet, F., Clotet, B., De Luca, A., Dressler, S., Garcia, F., Geretti, A. M., Klimkait, T., Korn, K., Masquelier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+guidelines+on+the+clinical+management+of+HIV-1+tropism+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">European guidelines on the clinical management of HIV-1 tropism testing.</a> Lancet Infect Dis. 11 (5), 394-407 (2011).</li>
<li>Walter, H., Eberle, J., Möller, H., Noah, C., Wolf, E., St rmer, M., Braun, P., Krn, K., D umer, M., Berg, T., Obermeier, M., Thielen, A., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empfehlung+zur+Bestimmung+des+HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs+%28DAIG+Recommendations+for+the+HIV-1+tropism+testing%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Empfehlung zur Bestimmung des HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs (DAIG Recommendations for the HIV-1 tropism testing).</a> , (2011).</li>
<li>Obermeier, M. J., Carganico, A., Dupke, S., Schranz, D., Cordes, C., Freiwald, M., Klausen, G., Köppe, S., Schuler, C., Mayr, C., Schleehauf, D., Berg, T., Krznaric, I., Baumgarten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+genotypic+co-receptor+tropism+testing+from+viral+RNA+and+proviral+DNA%3A+week+24+analysis+of+the+Berlin+maraviroc+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+International+AIDS+Society%22%5BJournal%5D)">Clinical application of genotypic co-receptor tropism testing from viral RNA and proviral DNA: week 24 analysis of the Berlin maraviroc cohort.</a> Journal of the International AIDS Society. 13, Suppl . 4. 129-129 (2010).</li>
<li>Toma, J., Frantzell, A., Hoh, R., Martin, J., Deeks, S., Petropoulos, C., Huang, W. Determining HIV-1 Co-receptor Tropism Using PBMC Proviral DNA Derived from Aviremic Blood Samples. 18th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).</li>
</ol>

Niniejszy artykuł wideo jest sponsorowany przez ViiV Healthcare oraz GlaxoSmithKline.

Sekwencja V3 umożliwia wiarygodne przewidywanie tropizmu wirusowego, co wykazano w badaniach klinicznych3-9. W rzeczywistości oznaczenie genotypowe jest uwzględnione w aktualnych wytycznych europejskich oraz niemiecko-austriackich10.
W porównaniu z badaniami fenotypowymi, nie tylko czas oczekiwania na wynik jest krótszy (porównywalny z testami oporności), ale również koszty są niższe. Ponadto główną zaletą badań genotypowych jest to, że wyniki są klasyfikowane jako FPR, a zatem mogą być dostosowane do potrzeb pacjentów. Z kolei wyniki Trofile to po prostu raporty R5 lub X4, a dostęp do surowych danych nie jest zapewniony.
Obecnie europejskie wytyczne sugerują wartość graniczną FPR na poziomie 20%10, podczas gdy wytyczne austriacko-niemieckie dopuszczają dostosowanie wartości granicznej FPR konkretnie do potrzeb każdego pacjenta11. W związku z tym w przypadku pacjentów z szerokim wachlarzem opcji leków antyretrowirusowych zaleca się wyższe wartości graniczne FPR (&gt; 20%). Z kolei u pacjentów z rozległą historią wcześniejszego leczenia i ograniczonymi opcjami terapeutycznymi można stosować niższe wartości graniczne FPR (&gt; 5%). Tego rodzaju prowadzenie terapii opiera się obecnie na badaniu oporności na NRTI, NNRTI, PI oraz INI, gdzie leki częściowo aktywne mogą zostać włączone do leczenia pacjentów z ograniczonymi opcjami terapeutycznymi. Dodatkowo, ze względu na rosnącą liczbę zmian w terapii kierowanych genotypowo, klinicznie istotne wartości graniczne FPR są stale korygowane przez panel bioinformatyków, wirusologów i klinicystów.
Kolejną istotną zaletą testowania tropizmu genotypowego jest możliwość analizy próbek klinicznych z bardzo niską lub nawet niewykrywalną wiremią (VL). W przypadkach, gdy RNA z osocza nie nadaje się do amplifikacji, można zsekwencjonować prowiralne DNA i wykorzystać je do wiarygodnych przewidywań9,12. Należy zauważyć, że liczba pacjentów z niską lub niewykrywalną wiremią gwałtownie wzrosła w ostatnich latach. Do chwili obecnej test Trofile umożliwia analizę próbek jedynie u pacjentów z VL&lt;1000 kopii/ml. Jednak wstępne badania wykazały, że prowiralne DNA może być również odpowiednie do badania za pomocą metody Trofile13.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do izolacji kwasów nukleinowych MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I</td><td>Roche Group</td><td>04 802 993 001</td><td></td></tr><tr><td>System MagNA Pure Compact System</td><td>Roche Group</td><td>03731146001</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler T3000 Thermocycler</td><td>Biometra</td><td>050-723</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw One Step RT-PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>210215</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw HotStarTaq Master Mix Kit</td><td>Qiagen</td><td>203445</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania produktów PCR QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Egzonukleaza I (Exo I)</td><td>Fermentas</td><td>EN0582</td><td></td></tr><tr><td>Termolabilna fosfataza alkaliczna FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase</td><td>Fermentas</td><td>EF0651</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do sekwencjonowania cyklicznego BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337457</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 Superfine</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0041-01</td><td></td></tr><tr><td>Sekwenator kapilarny ABI Prism &lt;em&gt;3130 XL&lt;/em&gt;</td><td>Applied Biosystems</td><td>3130XL</td><td></td></tr></tbody></table>

przewidywanie wykorzystania koreceptora hiv-1 (tropizmu) poprzez analizę sekwencji z zastosowaniem podejścia genotypowego

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Marawirok (MVC) jest pierwszym licencjonowanym lekiem antyretrowirusowym z grupy antagonistów koreceptorów. Wiąże się on z koreceptorem gospodarza CCR5, który jest wykorzystywany przez większość szczepów HIV w celu zakażenia ludzkich komórek odpornościowych (Ryc. 1). Inne izolaty HIV wykorzystują inny koreceptor, CXCR4. To, który receptor jest wykorzystywany, jest determinowane w wirusie przez białko Env (Ryc. 2). W zależności od wykorzystywanego koreceptora wirusy klasyfikowane są odpowiednio jako R5 lub X4. MVC wiąże się z receptorem CCR5, hamując wniknięcie wirusów R5 do komórki docelowej. W przebiegu choroby mogą pojawić się wirusy X4 i zdominować wirusy R5. Wyznaczenie wykorzystania koreceptora (zwanego również tropizmem) jest zatem obowiązkowe przed podaniem MVC, zgodnie z wymogami EMA i FDA.
Badania nad efektywnością MVC w ramach projektów MOTIVATE, MERIT i 1029 zostały przeprowadzone z wykorzystaniem testu Trofile firmy Monogram, San Francisco, USA. Jest to wysokiej jakości analiza oparta na zaawansowanych testach rekombinacyjnych. Akceptacja tego testu w codziennej rutynie diagnostycznej jest poza USA raczej niska, ponieważ lekarze w Europie mają tendencję do współpracy z zdecentralizowanymi laboratoriami specjalistycznymi, które zapewniają również towarzyszące badania w kierunku oporności. Laboratoria te przeszły kilka ewaluacji zapewnienia jakości, z których ostatnia została przedstawiona w 2011 roku1.
Od kilku lat przeprowadzamy oznaczenia tropizmu w oparciu o analizę sekwencji regionu genu env-V3 wirusa HIV (V3)2. Region ten zawiera wystarczającą ilość informacji, aby przeprowadzić wiarygodną predykcję. 
Genotypowe oznaczenie wykorzystania koreceptora oferuje takie zalety jak: krótszy czas oczekiwania na wynik (porównywalny z badaniem oporności), niższe koszty, możliwość dostosowania wyników do potrzeb pacjentów oraz możliwość analizy próbek klinicznych z bardzo niską lub nawet niewykrywalną wiremią (VL), szczególnie że w ostatnich latach liczba analizowanych próbek z VL&lt;1000 kopii/μl uległa znacznemu zwiększeniu (Rys. 3).
Główne etapy badania tropizmu (Ryc. 4) zaprezentowane w tym filmie: 
1. Pobranie próbki krwi 
 2. Izolacja RNA HIV z osocza i/lub prowiralnego DNA HIV z mononuklearnych komórek krwi 
 3. Amplifikacja regionu env 
 4. Amplifikacja regionu V3 
 5. Reakcja sekwencjonowania amplikonu V3 
 6. Oczyszczanie próbek do sekwencjonowania 
 7. Sekwencjonowanie oczyszczonych próbek 
 8. Edycja sekwencji 
 9. Interpretacja danych sekwencjonowania i przewidywanie tropizmu

Przewidywanie wykorzystania koreceptora przez HIV-1 jest niezbędne do podania nowej klasy leków antyretrowirusowych, mianowicie antagonistów koreceptorów. Można to przeprowadzić poprzez analizę sekwencji genu env i późniejszą interpretację za pomocą internetowego systemu interpretacyjnego (geno2pheno[coreceptor]).

Przewidywanie wykorzystania koreceptora HIV-1 (tropizmu) poprzez analizę sekwencji z zastosowaniem podejścia genotypowego

Marawirok (MVC) jest pierwszym licencjonowanym lekiem antyretrowirusowym z grupy antagonistów koreceptorów. Wiąże się on z koreceptorem gospodarza CCR5, który jest wykorzystywany przez...

<a class="grey_button" href="http://www.jove.com/video/4153"> Hiszpański </a>

prediction-hiv-1-coreceptor-usage-tropism-sequence-analysis-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przewidywanie użycia koreceptora HIV-1 (tropizmu) poprzez analizę sekwencji przy użyciu podejścia genotypowego

Region korony różnych sekwencji pętli V3 powierzchniowego glikoproteiny otoczki (gp120) HIV-1 może w wielu przypadkach zostać scharakteryzowany strukturalnie poprzez zwijanie in silico pozycji od 10 do 22 pętli przy użyciu nowoczesnego algorytmu zwijania ab initio. W niniejszej pracy prezentujemy zwijanie i ocenę tego regionu pętli V3 szczepu R2 HIV-1, który jest wyjątkowo wrażliwym na neutralizację szczepem o zagadkowych właściwościach funkcjonalnych.

Ocena immunologicznie istotnych dynamicznych cech struktury trzeciorzędowej sekwencji R2 korony pętli V3 HIV-1 za pomocą zwijania ab initio

Tropizm HIV można wywnioskować z regionu V3 otoczki wirusa. Region V3 jest amplifikowany w trzech powtórzeniach metodą zagnieżdżonej RT-PCR, sekwencjonowany, a następnie interpretowany przy użyciu oprogramowania bioinformatycznego. Próbki zawierające jedną lub więcej sekwencji z niskimi wartościami g2P są klasyfikowane jako wirusy non-R5.

Genotypowe wnioskowanie o tropizmie HIV-1 z wykorzystaniem sekwencjonowania populacyjnego pętli V3

Ilościowe oznaczenie poziomu RNA HIV-1 w osoczu oraz sekwencjonowanie pojedynczych genomów HIV-1 u osób z wiremią poniżej granicy wykrywalności (50-75 kopii/ml) jest trudne. W niniejszym materiale opisujemy sposób izolacji i oznaczania ilościowego wirusowego RNA z osocza przy użyciu testu real-time PCR, który wiarygodnie mierzy poziom RNA HIV-1 aż do 0,3 kopii/ml, a także metodę amplifikacji genomów wirusowych poprzez sekwencjonowanie pojedynczych genomów z próbek o bardzo niskiej ładunku...

Amplifikacja i kwantyfikacja RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV z ładunkiem wirusowym poniżej granicy wykrywalności standardowych testów klinicznych

Testy oporności na leki dla osób zakażonych wirusem HIV-1, u których nie powiodła się terapia antyretrowirusowa (ART), mogą ukierunkować przyszłe terapie i poprawić wyniki leczenia. Optymalizacja indywidualnych i populacyjnych wyników zdrowotnych w warunkach wysokiego rozpowszechnienia HIV, ale ograniczonych zasobów, będzie ostatecznie wymagała przystępnych cenowo i dostępnych metod genotypowania i interpretacji oporności na leki.

Przystępna cenowo metoda monitorowania oporności na leki HIV-1 w warunkach ograniczonych zasobów

Patogeneza HIV-1 jest definiowana zarówno przez cechy wirusa, jak i czynniki genetyczne gospodarza. W tym miejscu opisujemy solidną metodę, która pozwala na powtarzalne pomiary w celu oceny wpływu zmienności sekwencji genu gag na zdolność replikacji wirusa in vitro.

Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4

Konkurencja wzrostu między prawie izogenicznymi wirusami dostarcza czułego pomiaru do określenia względnej zdolności replikacji. Opisane tutaj protokoły obejmują budowę rekombinowanych klonów HIV-1, rozmnażanie wirusa i konkurencję wzrostu oraz metody analizy zoptymalizowane w celu uzyskania czułych i spójnych wyników.

Test konkurencji wzrostu parami do określania zdolności replikacji ludzkich wirusów niedoboru odporności

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Indywidualne sekwencjonowanie prowirusowe o pełnej długości (FLIPS) zapewnia efektywną i wysokoprzepustową metodę amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych, prawie pełnej długości (nienaruszonych i wadliwych) prowirusów HIV-1 i pozwala na określenie ich potencjalnej zdolności replikacyjnej. Projekt FLIPS pozwala przezwyciężyć ograniczenia poprzednich testów zaprojektowanych do sekwencjonowania utajonego rezerwuaru HIV-1.

Amplifikacja prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości do sekwencjonowania nowej generacji

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Spinki i pętle RNA mogą funkcjonować jako startery do odwrotnej transkrypcji (RT) w przypadku braku starterów specyficznych dla sekwencji, zakłócając badanie nakładających się na siebie transkryptów antysensownych. Opracowaliśmy technikę zdolną do identyfikacji swoistego dla nici RNA i wykorzystaliśmy ją do badania białka antysensownego HIV-1 ASP.

Wykrywanie transkryptów RNA białka antysensownego (ASP) ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) u pacjentów za pomocą RT-PCR swoistego dla nici

Poznaj metodę przewidywania użycia koreceptorów HIV-1 poprzez analizę sekwencji regionu V3 genu env. Technika ta umożliwia spersonalizowane leczenie antyretrowirusowe.

Przewidywanie wykorzystania koreceptora HIV-1 (tropizmu) poprzez analizę sekwencji z zastosowaniem podejścia genotypowego

Przeglądaj więcej filmów