Przewidywanie użycia koreceptorów HIV-1 (tropizm) za pomocą analizy sekwencji przy użyciu podejścia genotypowego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przewidzenie wykorzystania koreceptorów wirusa HIV do podawania nowej klasy leków antyretrowirusowych. Osiąga się to poprzez wyizolowanie wirusowych genomowych kwasów nukleinowych, wirusowego RNA lub prowirusowego DNA z krwi pacjenta po amplifikacji obszaru otoczki. Wirusowy region V trzy, który jest głównym wyznacznikiem tropizmu, jest amplifikowany przez zagnieżdżony PCR.

Następnie amplikon V trzy jest sekwencjonowany różnymi starterami w celu wygenerowania pliku fasta. Uzyskano wyniki, które pokazują tropizm wirusa i podatność antagonistów koreceptorów na podstawie wskaźnika wyników fałszywie dodatnich lub FPR, uzyskanych za pomocą internetowego narzędzia do interpretacji geno do fenokoreceptora. W zależności od zastosowania CORECEPTORA, wirusy HIV są klasyfikowane jako R pięć lub X cztery.

Skała Miri wiąże się przez receptor CCR pięć, hamując wnikanie wirusów R pięciu do komórki docelowej. W przebiegu choroby X mogą pojawić się cztery wirusy, które przerosną wirusy R pięć. Zaprzestanie stosowania receptora, zwanego również tropizmem, jest zatem obowiązkowe przed podaniem marawiroku, zgodnie z wymogami EMA i FDA.

Główną zaletą tej techniki jest to, że można bardzo łatwo dokonać równoległego określenia oporności na inne klasy leków przeciwretrowirusowych. Metoda ta pozwala na znacznie bardziej spersonalizowaną medycynę, ponieważ punkty odcięcia dla wyników tropizmu mogą być modyfikowane w zależności od potrzeb pacjenta. Po raz pierwszy pomysł na tę metodę pojawił się na początku lat dziewięćdziesiątych, kiedy chcieliśmy poznać molekularne podstawy różnych hodowli komórkowych szczepów HIV i progresji choroby u pacjentów demonstrujących procedurę będą dane technika z naszej grupy Przed rozpoczęciem tego protokołu.

Próbki są pobierane jako krew EDTA w miejscu klinicznym i wysyłane do laboratorium w celu rozpoczęcia izolowania kwasów nukleinowych HIV z 1000 mikrolitrów pełnej krwi, surowicy lub osocza przy użyciu systemu mag pure compact i zestawu do izolacji kwasów nukleinowych zgodnie z instrukcjami producenta. Uzyskane RNA lub DNA są następnie umieszczane w buforze TE o pojemności 50 mikrolitrów. Następnym krokiem jest amplifikacja regionu otoczki kwasu nukleinowego przez odwrotną transkrypcję PCR dla RNA lub po prostu PCR dla DNA, jak opisano w tekście, reakcja powinna wygenerować produkt o długości 1,245 pary zasad zawierający większość regionu białka otoczki w celu amplifikacji regionu V trzy białka otoczki, a następnie zagnieżdżonego PCR przy użyciu pięciu mikrolitrów z pierwszej reakcji PCR jako matrycy.

Przygotować reakcje, używając mieszanki wzorcowej do zagnieżdżonego wewnętrznego PCR, jak opisano w tekście. Są tam również przedstawione zagnieżdżone parametry uruchamiania PCR. Po amplifikacji regionu V trzy przeanalizować produkt PCR, aby zweryfikować oczekiwany produkt o długości 902 pary zasad za pomocą elektroforezy żelowej przed sekwencjonowaniem.

Oczyść produkt PCR zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Po oczyszczeniu produktu PCR należy przeprowadzić reakcję sekwencjonowania zgodnie z opisem w tekście po zakończeniu reakcji. Oczyścić próbki do sekwencjonowania za pomocą cidex G 50 superfine i wielositowej płytki filtracyjnej z membraną duraporową, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części niniejszej procedury, aby sekwencjonować oczyszczony produkt, przygotować sekwenator, sprawdzając polimer i zmieniając bufor.

Następnie załaduj próbki, ustaw warunki i rozpocznij przebieg. Po przebiegu sekwencjonowania. Program genów lasera DNA STAR może być używany do wyrównywania i edycji sekwencji.

Amplikon V trzy jest sekwencjonowany z co najmniej jednym starterem do przodu i jednym do tyłu. Gen lasera wyrównuje pliki ABI uzyskane z sekwencera z sekwencjami referencyjnymi. V trzy, gen lasera konsensusu B i obwiedni tworzy sekwencję konsensusu analizowanej próbki przy użyciu wszystkich dostępnych surowych danych, ale nie odniesień, i przechowuje ją jako plik FASTA.

Plik FASTA to plik tekstowy, który zawiera nagłówek z nazwą próbki i sekwencją nukleotydów. Aby rozpocząć interpretację danych i przewidywanie tropizmu, prześlij plik FASTA do internetowego systemu interpretacji. Koreceptor Geno Tono wybiera punkt odcięcia FPR, do którego wirus jest klasyfikowany jako R pięć.

Zgodnie z niemieckimi wytycznymi, wirus jest klasyfikowany jako R pięć. Gdy FPR jest większy lub równy 20% i jako X cztery, gdy FPR jest mniejszy niż 12,5%, wybierz dowolne dodatkowe parametry kliniczne, jeśli są dostępne, a następnie wybierz, wyrównaj i przewiduj Ten serwer tłumaczy sekwencję nukleotydów na aminokwasy, wyrównuje ją z sekwencją B konsensusu V trzy i tworzy klasyfikację podtypu. Ponadto generuje prognozę użycia koreceptorów wyrażoną jako FPR.

Dane wyjściowe pokazują stopniowaną interpretację w zależności od prawdopodobieństwa użycia koreceptora. W przypadku wysokich wartości FPR jest całkiem pewne, że wirus nie ma X czterech, a w przypadku niskich FPR nie jest się pewnym, jak wirus wygląda, jeśli interpretacja, tekst i kolor tła są zielone. Wskazane jest bezpieczne podawanie Ravi Rock, podczas gdy kolor żółty sugeruje możliwe niskie ryzyko stosowania Ravi Rock, a czerwony oznacza, że Ravi Rock nie powinien być przepisywany.

Dodatkowo serwer generuje raport w formacie PDF, który można wydrukować i wysłać do lekarza. Dodatkowe dane, takie jak imię i nazwisko pacjenta lub data pobrania krwi, można wprowadzić ręcznie za pomocą programu do zapisywania plików PDF. W zaciszu komputera użytkownika można również dodawać konkretne komentarze.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić kotlety wirusowe za pomocą narzędzia do receptora fenogenicznego Podczas próby tej procedury ważne jest, aby regularnie przeprowadzać kontrole jakości. Nie zapominaj, że praca z HIV może być bardzo niebezpieczna, dlatego zawsze należy stosować środki ostrożności i autoryzowane laboratoria biologiczne.