Name: Doustne podawanie rotenonu za pomocą zgłębnika i analiza obrazu inkluzji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Poznaj metodę doustnego podawania rotenonu myszom za pomocą zgłębnika oraz analizę akumulacji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym. Technika ta umożliwia badanie neurotoksycznych efektów pestycydów w kontekście choroby Parkinsona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana przez Fundację Pedro Barrie de la Maza.

1) Podanie rotenonu drogą wewnątrzżołądkową
<ol>
<li>Zważ zwierzę.</li>
<li>Oblicz całkowitą objętość niezbędnego roztworu rotenonu/nośnika. W tym przypadku jest to 0,01 ml na gram masy ciała zwierzęcia.</li>
<li>Napełnij strzykawkę 1 mL wcześniej obliczoną objętością roztworu rotenonu (0,625 mg/mL rotenonu, 4% karboksymetylocelulozy i 1,25% chloroformu) lub roztworu nośnika (4% karboksymetylocelulozy i 1,25% chloroformu). W tym przypadku odpowiada to dawce rotenonu 5 mg/kg.</li>
<li>Chwyć mysz i, trzymając ją jedną ręką za ogon, naciągnij skórę szyi, pociągając ją dwoma pierwszymi palcami drugiej ręki.</li>
<li>Po unieruchomieniu głowy między dwoma palcami, oprzyj ją o wnętrze dłoni i odwróć do góry nogami. Unieruchom ogon za pomocą czwartego i piątego palca.</li>
<li>Trzymając głowę skierowaną do tyłu, naciśnij podniebienie, aby otworzyć pysk myszy. Delikatnie wprowadź zgłębnik do pyska. Ważne jest użycie igły do zgłębnika, a nie zwykłej igły. Powoli przesuwaj zgłębnik w kierunku żołądka na odpowiednią głębokość. Zapobiegnie to przedostaniu się materiału do płuc.</li>
<li>Podaj roztwór rotenonu lub nośnik, delikatnie naciskając tłok. Po zakończeniu powoli wyjmij zgłębnik.</li>
<li>Przenieś zwierzę z powrotem do innej klatki, aż wszystkie zwierzęta z jednej klatki zostaną poddane procedurze.</li>
</ol>
2) Procedury immunobarwienia
<ol>
<li>Po zakończeniu leczenia myszy poddaje się znieczuleniu przy użyciu Ketamin 100 mg/kg oraz Xylazin 10 mg/kg i.p., a następnie wykonuje perfuzję wewnątrzsercową z użyciem 4% Paraformaldehyde w PBS.</li>
<li>Następnie drogą sekcji wycina się jelita i umieszcza je w 15% sacharozie na noc. Następnego dnia tkankę przenosi się do 30% sacharozy i ponownie inkubuje przez noc w temperaturze 4°C.</li>
<li>Tkankę umieszcza się następnie w Tissue-tek i przechowuje w zamrażarce w temperaturze -80°C do czasu użycia.</li>
<li>Za pomocą kriotomatu wykonuje się przekroje poprzeczne jelita o grubości 20 micron i przenosi je na szkiełka Superfrost.</li>
<li>Następnie przeprowadza się procedury blokowania i immunostaining z użyciem przeciwciał anty-βIII-tubulin oraz anty-alpha-synuclein, zgodnie z wcześniejszymi opisami 9.</li>
</ol>
3) Analiza obrazów inkluzji alfa-synukleiny
Zaleca się, aby analizy dokonała osoba zewnętrzna nieznająca pochodzenia obrazów. W związku z tym dane powinny zostać zakodowane. Analiza obrazów została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania FIJI.
<ol>
<li>Otwórz plik obrazu konfokalnego. Następnie rozdziel kanały, aby umożliwić niezależną pracę na każdym z nich.</li>
<li>Zamknij kanały, które nie będą używane, wybierz Analyze&gt;Set Scale i ustaw Pixel size na 1. Ustaw known distance na 0.13 (wartość ta zależy od użytego obiektywu i rozdzielczości) i kliknij global. Rozmiar obrazu będzie teraz wyświetlany w mikronach.</li>
<li>Wybierz kanał alfa-synukleiny i zaznacz zwoj (ganglion), upewniając się, że zaznaczenie obejmuje zwoj we wszystkich warstwach (slices).</li>
<li>Wybierz Image&gt;Duplicate, aby zduplikować obraz. Przy zaznaczonym zwoju zostanie zduplikowany tylko fragment obrazu o rozmiarze zwoju.</li>
<li>Wybierz Edit&gt;Clear Outside. Część obrazu poza zaznaczonym obszarem stanie się czarna.</li>
<li>Ponownie zduplikuj obraz, aby w późniejszych krokach ocenić poprawność procedury. Obrazy o wysokim stosunku sygnału do szumu i tła nie powinny być używane do analizy obrazu.</li>
<li>Wybierz Image&gt;Adjust&gt;Threshold, a następnie wybierz MaxEntropy. Przejrzyj warstwy w przyciętym obrazie oraz w obrazie oryginalnym, aby upewnić się, że procedura przebiegła pomyślnie. Próg entropijny wybiera poziom sygnału intensywności na podstawie histogramu obrazu, a na obrazie białym na czarnym zostaną wyświetlone tylko te piksele, których intensywność przekracza ten próg.</li>
<li>Wybierz Process, a następnie kliknij Smooth. Ten krok przekształca poszarpane krawędzie obrazów w krawędzie gładkie.</li>
<li>Wybierz Process, następnie kliknij Binary i wybierz Make Binary. Obraz zostanie wyświetlony jako obraz czarno-biały.</li>
<li>Zduplikuj obraz, aby wykonać następny krok na kopii.</li>
<li>Kliknij Analyze&gt;Analyze particles. Następnie wybierz Show:Outlines i kliknij Summarize. Pozostałe ustawienia powinny pozostać domyślne. Funkcja ta rozpoznaje całkowitą liczbę pikseli z sygnałem oraz te, które są ze sobą zgrupowane. Raportowana jest całkowita powierzchnia pikseli z sygnałem, liczba grup pikseli oraz średni rozmiar.</li>
<li>Porównaj i wybierz największą warstwę, która dobrze pasuje. Warstwa zostanie zaznaczona.</li>
<li>Skopiuj tabelę danych zawierającą całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny, liczbę inkluzji i średni rozmiar cząsteczek. Wklej dane do arkusza Excel lub zapisz je w innym miejscu.</li>
<li>Wróć do FIJI, znajdź wcześniej wybraną warstwę w kanale β-tubuliny i zaznacz ją.</li>
<li>Zaznacz obszar zwoju, kliknij Analyze, a następnie wybierz Measure. Pojawi się kolejna tabela pokazująca całkowitą powierzchnię zwoju.</li>
<li>Przenieś dane z tabeli do arkusza Excel obok pomiarów alfa-synukleiny lub skopiuj je w inne miejsce.</li>
<li>W programie Excel podziel poszczególne parametry uzyskane w pomiarze alfa-synukleiny przez powierzchnię zwoju, aby otrzymać całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny oraz liczbę inkluzji znormalizowaną do wielkości zwoju.</li>
</ol>
4) Reprezentatywne wyniki
Pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia protokołu podawania przez zgłębnik, niedogodności dla zwierzęcia są minimalne. Leczenie z zastosowaniem tej koncentracji rotenonu umożliwia uzyskanie miejscowego efektu działania rotenonu na ENS bez obecności rotenonu we krwi oraz bez hamowania mitochondrialnego Kompleksu I w mięśniach lub mózgu, nawet po 1,5 miesiąca leczenia (patrz Rysunek 1). Przy prawidłowym przeprowadzeniu analizy obrazu możliwa powinna być rygorystyczna analiza wzorca alfa-synukleiny. Pozwala ona na uzyskanie wiarygodnych danych na temat całkowitej ilości alfa-synukleiny (całkowita powierzchnia), wzorca alfa-synukleiny w komórce (liczba inkluzji) oraz obecności inkluzji alfa-synukleiny (rozmiar inkluzji) (Rysunek 2).
 <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig1.jpg" alt="Chromatogramy i wykresy słupkowe; badanie poziomu i aktywności rotenonu we krwi i OUN przy różnych dawkach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Dysfunkcja motoryczna u myszy traktowanych rotenonem bez wykrycia rotenonu we krwi lub OUN. A, standard (50 ng/mL) oraz chromatogram z próbek mózgu myszy traktowanych dawkami 20, 10 i 5 mg/kg. B i C, ilościowe oznaczenie poziomu rotenonu we krwi (B) i OUN (C). B, poziomy we krwi 1, 2 i 3 godziny po traktowaniu. Myszy podzielono na trzy grupy (n=3) i podano im rotenon w dawkach 2,5, 5, 10 i 20 mg/kg (n=3); 300 μL krwi pobrano 1, 2 i 3 godziny po podaniu rotenonu, a następnie połączono próbki do analizy HPLC. C, myszy traktowano przez jeden tydzień raz dziennie dawkami 5 (n=3), 10 (n=3) i 20 (n=1) mg/kg rotenonu; mózg i pień mózgu wyizolowano 1 i 2 godziny po ostatniej aplikacji i przygotowano do analizy HPLC. D, aktywność mitochondrialnego Kompleksu I w próbkach mięśni i mózgu myszy traktowanych przez 1,5 miesiąca.
 <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig2.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna βIII-tubuliny/α-synukleiny, znakowanie Thioflaviną S, analiza wykresów słupkowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Miejscowo podawany rotenon indukuje fosforylację, akumulację i agregację alfa-synukleiny wraz z gliozą w zwojach ENS. (paski skali 20 μm). A, B, C, barwienie przeciwko βIII-tubulinie, alfa-synukleinie i DAPI w przekrojach dwunastnicy (B) i jelita krętego (A,C). Strzałka w B, 1,5-miesięczne leczenie spowodowało zwiększenie punktowego wzorca alfa-synukleiny wewnątrz zwojów jelitowego układu nerwowego w porównaniu do kontroli z 3 miesięcy (A). Strzałka w C, 3-miesięczne leczenie wywołało tworzenie się większych inkluzji alfa-synukleiny (ø&gt;6 μm). D, barwienie immunofluorescencyjne z użyciem przeciwciał przeciwko alfa-synukleinie, Thioflavine S i DAPI. Strzałka w D, tylko u myszy leczonych przez 3 miesiące stwierdzono agregację tych większych akumulacji alfa-synukleiny. E, E', E'', etapy ilościowej analizy obrazu. E, przykład obrazu użytego w kwantyfikacji przedstawiający zwój ENS przebarwiony przeciwko alfa-synukleinie z widocznymi różnymi inkluzjami. E', przykład obrazu uzyskanego po zastosowaniu protokołu analizy obrazu. E'', nakładanie się niektórych oryginalnych inkluzji (zielone) i reprezentacji uzyskanej po wykonaniu protokołu (żółte linie). F-G, kwantyfikacja eksperymentu przedstawionego w A-C została przeprowadzona przy użyciu automatycznej segmentacji i metod progowania opartych na entropii. Pojedyncza gwiazdka, P&lt;0.05, a podwójna gwiazdka, P&lt;0.01. F, każda kolumna reprezentuje całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny/powierzchnię zwoju. G, każda kolumna reprezentuje całkowitą liczbę inkluzji alfa-synukleiny/powierzchnię zwoju. Wszystkie wykresy przedstawiają średnią ± s.e.m.

<ol><li>Braak, H., de Vos, R. A., Bohl, J., Del Tredici, K., K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+alpha-synuclein+immunoreactive+inclusions+in+Meissner%27s+and+Auerbach%27s+plexuses+in+cases+staged+for+Parkinson%27s+disease-related+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology.</a> Neurosci Lett. 396, 67-72 (2006).</li>
<li>Wakabayashi, K., Takahashi, H., Ohama, E., Ikuta, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+an+immunohistochemical+study+of+Lewy+body-containing+neurons+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system.</a> Acta Neuropathol. 79, 581-583 (1990).</li>
<li>Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+occurrence+of+Lewy+bodies+in+the+dorsal+vagal+nucleus+in+a+patient+with+late-onset+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Restricted occurrence of Lewy bodies in the dorsal vagal nucleus in a patient with late-onset parkinsonism.</a> J Neurol Sci. 165, 188-191 (1999).</li>
<li>Braak, H., Sastre, M., Bohl, J. R., de Vos, R. A., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+lesions+in+dorsal+horn+layer+I%2C+involvement+of+parasympathetic+and+sympathetic+pre-+and+postganglionic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons.</a> Acta Neuropathol. 113, 421-429 (2007).</li>
<li>Braak, H., Ghebremedhin, E., Rub, U., Bratzke, H., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+in+the+development+of+Parkinson%27s+disease-related+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology.</a> Cell Tissue Res. 318, 121-134 (2004).</li>
<li>Gorell, J. M., Johnson, C. C., Rybicki, B. A., Peterson, E. L., Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+risk+of+Parkinson%27s+disease+with+exposure+to+pesticides%2C+farming%2C+well+water%2C+and+rural+living%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The risk of Parkinson's disease with exposure to pesticides, farming, well water, and rural living.</a> Neurology. 50, 1346-1350 (1998).</li>
<li>Semchuk, K. M., Love, E. J., Lee, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+exposure+to+agricultural+work+and+pesticide+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and exposure to agricultural work and pesticide chemicals.</a> Neurology. 42, 1328-1335 (1992).</li>
<li>Butterfield, P. G., Valanis, B. G., Spencer, P. S., Lindeman, C. A., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+antecedents+of+young-onset+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Environmental antecedents of young-onset Parkinson's disease.</a> Neurology. 43, 1150-1158 (1993).</li>
<li>Pan-Montojo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+Parkinson%27s+disease+pathology+is+reproduced+by+intragastric+administration+of+rotenone+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice.</a> PLoS One. 5, e8762-e8762 (2010).</li>
<li>Sherer, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+toxicity+in+rotenone+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 23, 10756-10764 (2003).</li>
<li>Bove, J., Prou, D., Perier, C., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-induced+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Toxin-induced models of Parkinson's disease.</a> NeuroRx. 2, 484-494 (2005).</li>
<li>Inden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+of+mouse+nigrostriatal+dopaminergic+system+induced+by+repeated+oral+administration+of+rotenone+is+prevented+by+4-phenylbutyrate%2C+a+chemical+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration of mouse nigrostriatal dopaminergic system induced by repeated oral administration of rotenone is prevented by 4-phenylbutyrate, a chemical chaperone.</a> J Neurochem. 101, 1491-1504 (2007).</li>
</ol>

Francisco Pan-Montojo posiada oczekujący wniosek patentowy dla tego modelu zwierzęcego (numer wniosku PCT/EP 2009/005688).

Podawanie domięśniowe było wcześniej stosowane 12. Jednakże, zgodnie z manuskryptem Indena, rotenon podawano rozpuszczony wyłącznie w 0,5% soli sodowej karboksymetylocelulozy (CMSS). Rotenon jest substancją silnie lipofilową. W związku z tym rotenonu nie można rozpuścić w samym 0,5% CMSS, gdyż uległby on wytrąceniu. Zastosowanie chloroformu pozwala na stworzenie równomiernie rozprowadzonej zawiesiny rotenonu, zapobiegając jego wytrącaniu. Ponadto, dzięki wyższym stężeniom pestycydów w CMSS, końcowa objętość po...

<table><tbody><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3313.1</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Karboksymetyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5678</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Kaniula do gavage 1,2 mm x 60 mm</td><td>Unimed</td><td></td><td>Szwajcaria</td></tr><tr><td>LSM 510</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>http://pacific.mpi-cbg.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

podawanie rotenonu drogą doustną za pomocą zgłębnika oraz analiza obrazowa inkluzji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

U pacjentów z chorobą Parkinsona (PD) powiązana z nią patologia wykazuje charakterystyczny schemat obejmujący między innymi jelitowy układ nerwowy (ENS) 1,2, opuszka węchową (OB), jądro grzbietowe nerwu błądzącego (DMV)3, jądro pośrednio-boczne rdzenia kręgowego 4 oraz istotę czarną, co stanowi podstawę neuropatologicznego stopnia zaawansowania choroby4,5. ENS i OB są najbardziej narażonymi strukturami nerwowymi i pierwszymi, które zostają dotknięte procesem chorobowym. Co ciekawe, PD wiązano z ekspozycją na pestycydy6-8. W niniejszej pracy szczegółowo przedstawiamy dwie metody wykorzystane w naszym poprzednim badaniu 9. Aby przeanalizować efekty działania rotenonu miejscowo na ENS, podawaliśmy rotenon poprzez zgłębnik jednorocznym myszom C57/BL6. Rotenon jest powszechnie stosowanym pestycydem, który silnie hamuje mitochondrialny Kompleks I 10. Jest on silnie lipofilny i słabo wchłania się w przewodzie pokarmowym 11. Nasze wyniki wykazały, że podanie 5 mg/kg rotenonu nie zahamowało aktywności mitochondrialnego Kompleksu I w mięśniach ani w mózgu. Sugeruje to, że przy zastosowaniu naszej metody podawania rotenon nie przenikał przez system hepatoportalny i działał wyłącznie na ENS. Przedstawiamy tutaj metodę podawania pestycydów za pomocą zgłębnika oraz protokół analizy obrazu wykorzystany do oceny wpływu pestycydów na akumulację alfa-synukleiny w ENS. Pierwsza część prezentuje metodę umożliwiającą dokustryczne podawanie pestycydów (rotenonu) w pożądanym, precyzyjnym stężeniu. Druga metoda przedstawia półautomatyczny protokół analizy obrazu do oceny akumulacji alfa-synukleiny w ENS przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.

Choroba Parkinsona była wiązana z ekspozycją na pestycydy. Przedstawiamy tutaj metodę podawania pestycydów za pomocą zgłębnika żołądkowego w pożądanym stężeniu oraz metodę analizy ich wpływu na gromadzenie się alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym.

Podawanie rotenonu drogą doustną za pomocą zgłębnika oraz analiza obrazowa inkluzji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym

U pacjentów z chorobą Parkinsona (PD) towarzysząca patologia wykazuje charakterystyczny wzorzec obejmujący między innymi jelitowy układ nerwowy (ENS) 1,2, ...

Objawy choroby Parkinsona, w tym zaburzenia motoryczne i mowy, wynikają z obniżonej aktywności komórek wydzielających dopaminę w mózgu. Przewodem pokarmowym oraz opuszka węchowa są najbardziej narażonymi strukturami nerwowymi i pierwszymi, które ulegają uszkodzeniu. Chorobę Parkinsona wiązano z ekspozycją na pestycydy.W celu analizy wpływu pestycydów na jelitowy układ nerwowy, myszom podaje się pestycyd roone poprzez zgłębnik dożołądkowy. Następnie u myszy przeprowadza się perfuzję wewnątrzsercową 4% paraformaldehydem, aby utrwalić mózg i jelitowy układ nerwowy. Tkanka jest pobierana, preparowana i poddawana barwieniu immunocytochemicznemu w celu wykrycia białek związanych z PD.Obrazy beta III tubuliny oraz alfa-synukleiny uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej wykazują akumulację alfa-synukleiny wewnątrz neuronów jelitowego układu nerwowego u zwierząt poddanych działaniu pestycydów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak systemiczna administracja rotenonu, jest zapewnienie, że efekt działania rotenonu jest ograniczony do jelitowego układu nerwowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące choroby Parkinsona, takie jak jej etiologia oraz mechanizmy leżące u podłoża jej progresji.Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię i diagnostykę choroby Parkinsona, ponieważ umożliwi ona opracowanie nowych celów terapeutycznych i metod diagnostycznych. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat patofizjologii choroby Parkinsona, można ją również zastosować w innych układach, takich jak badanie wpływu innych toksyn środowiskowych na jelitowy, współczulny i przywspółczulny układ nerwowy, a także na ścianę jelita. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ opanowanie techniki gavage wymaga czasu.Pomysł na te metody pojawił się u mnie po raz pierwszy, gdy przeczytałem o powiązaniach między pestycydami a chorobą Parkinsona. Pomocne było również zapoznanie się z konferencją wysokich CORA podczas World Parkinson Congress w Berlinie w 2005 roku. Konieczna jest pokojowa demonstracja tej metody.Metoda podawania ol za pomocą zgłębnika jest trudna, ponieważ myszy mają inną anatomię niż ludzie; z drugiej strony, analiza obrazu została przeprowadzona z wykorzystaniem dostosowanych kroków dla tych obrazów. Protokół należy rozpocząć od zważenia zwierzęcia. Następnie należy obliczyć odpowiednią objętość rotenonu.Wymagane jest 0,01 mililitrów na gram masy ciała zwierzęcia, co odpowiada dawce roone wynoszącej pięć miligramów na kilogram. Napełnić strzykawkę o pojemności jednego mililitra roztworem roone, a następnie drugą strzykawkę roztworem nośnikiem. Chwycić mysz, trzymając ją za ogon jedną ręką.Napiąć skórę szyi, odciągając ją dwoma pierwszymi palcami drugiej ręki. Po unieruchomieniu głowy między palcami, oprzeć ją o wnętrze dłoni i odwrócić do góry nogami. Unieruchomić ogon.Używając czwartego i piątego palca, trzymając głowę odchyloną do tyłu, uciśnij podniebienie, aby otworzyć pyszczek myszy. Delikatnie wprowadź zgłębnik do pyszczka. Powoli przesuwaj zgłębnik w kierunku żołądka, aż zostanie wprowadzony w całej swojej długości.Aby uniknąć przedostania się materiału do płuc, należy podać roztwór roone lub nośnik, delikatnie naciskając tłok. Po zakończeniu powoli wyciągnąć zgłębnik i umieścić zwierzę z powrotem w innej klatce, aż wszystkie zwierzęta z jednej klatki zostaną poddane procedurze. Po zakończeniu zabiegu myszy poddawane są perfuzji wewnątrzsercowej 4% paraformaldehydem.W PBS jelita zostają następnie wyjęte poprzez sekcję i umieszczone w 15% sacharozy na noc. Następnego dnia tkankę przenosi się do 30% sacharozy i ponownie inkubuje przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie tkanka jest umieszczana w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i przechowywana do czasu użycia. Przy użyciu kriotomu przygotowuje się 20 mikronowe przekroje jelita.Przekroje są przenoszone na szkiełka, a następnie przeprowadza się procedury blokowania i immunostainingu. Następnie stosuje się przeciwciała anty-beta three tubulin oraz Antifa synuclein. Zaleca się, aby analiza danych została przeprowadzona w sposób ślepy przez osobę zewnętrzną.Aby rozpocząć analizę, uruchom oprogramowanie Fiji. Otwórz plik obrazu konfokalnego. Następnie rozdziel kanały, aby umożliwić niezależną pracę na każdym z nich.Zamknij kanały, które nie będą używane, a następnie wybierz, przeanalizuj, ustaw i przeskaluj, ustawiając rozmiar piksela na jeden. Ustaw znaną odległość na 0,13 i kliknij global. Rozmiar obrazu zostanie teraz wyświetlony w mikronach.Wybierz kanał alfa synukleiny i zaznacz zwoj ganglion. Upewnij się, że zaznaczenie obejmuje ganglion na wszystkich przekrojach. Zduplikuj obraz z zaznaczonym jedynie ganglionem; zostanie zduplikowany obraz o rozmiarze samego ganglionu.Po naciśnięciu przycisku edycji, obszar obrazu poza wybranym regionem stanie się czarny. Powiel obraz ponownie, aby ocenić poprawność przeprowadzonej procedury. Obrazy o niskim stosunku sygnału do szumu tła nie powinny być wykorzystywane do analizy obrazu.Wybierz opcję dostosowania progu obrazu (image adjust threshold). Następnie wybierz maksymalną entropię (max entropy). Następnie przejrzyj przekroje w przyciętym obrazie oraz w obrazie oryginalnym, aby upewnić się, że procedura przebiegła pomyślnie.Próg tropikalny (tropic threshold) wybiera poziom sygnału intensywności na podstawie histogramu obrazu; w procesie selekcji obrazu w kolorze białym na czarnym wyświetlane będą tylko te piksele, których intensywność przekracza ten próg. Następnie kliknij „smooth”. Ten krok przekształca poszarpane krawędzie obrazów w krawędzie gładkie.Następnie kliknij binary i wybierz Make binary. Obraz zostanie wyświetlony jako czarno-biały duplikat; aby wykonać kolejny krok na powielonym obrazie, kliknij analyze, a następnie analyze particles. Następnie zaznacz show outlines i kliknij summarize.Pozostałe ustawienia powinny pozostać domyślne. Funkcja ta rozpoznaje całkowitą liczbę pikseli z sygnałem oraz te, które są zgrupowane, co stanowi całkowitą powierzchnię pikseli z sygnałem. Ponadto raportowana jest liczba grup pikseli oraz ich średnia wielkość.Porównaj i wybierz przekrój o największej całkowitej powierzchni, który jest odpowiednio dopasowany. Przekrój zostanie zaznaczony. Skopiuj tabelę danych zawierającą całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny, liczbę inkluzji oraz średnią wielkość cząsteczek.Wklej dane do arkusza Excel lub zapisz je w innym miejscu z odpowiednimi opisami. Powróć do programu Fiji. Znajdź poprzednio wybrany przekrój w kanale beta-tubuliny i zaznacz go.Zaznacz obszar zwoju i kliknij analizuj. Następnie wybierz pomiar. Pojawi się kolejna tabela przedstawiająca całkowitą powierzchnię zwoju.Wyodrębnij dane z tabeli do arkusza Excel w pobliżu pomiaru alfa-synukleiny lub skopiuj je w inne miejsce przy użyciu programu Excel. Podziel poszczególne parametry uzyskane w pomiarze alfa-synukleiny przez powierzchnię zwoju, aby otrzymać całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny oraz liczbę inkluzji znormalizowaną do wielkości zwoju. W celu analizy efektów miejscowego działania rotenonu na jelitowy układ nerwowy, jednorocznym myszom C 57 black six podano doustnie przez zgłębnik 5 mg/kg pestycydy rotenonu. Przedstawiony tutaj chromatogram wykazuje obecność piku rotenonu godzinę po podaniu; myszy kontrolne, myszy traktowane dawką 20 mg/kg rotenonu oraz 5 mg/kg rotenonu.Poziomy rotenonu w ekstraktach z krwi, mózgu i pnia mózgu określono za pomocą metody HPLC, jak pokazano tutaj. Podanie pięciu miligramów na kilogram rotenonu drogą zgłębnika nie skutkuje mierzalnymi poziomami w krwi jedna, dwie lub trzy godziny po podaniu leku, co określono za pomocą HPLC. Grafika przedstawia poziomy rotenonu w mózgu i pniu mózgu myszy poddanych badaniu.Godzinę po podaniu rotenonu w dawce 10 mg/kg lub mniejszej nie stwierdzono obecności rotenonu w próbkach mózgu ani pnia mózgu. Godzinę po podaniu oceniono aktywność kompleksu I mitochondriów w próbkach mięśni i mózgu myszy w wieku 1,5 miesiąca. Między grupami nie stwierdzono istotnych różnic, co wskazuje na brak inhibicji kompleksu I mitochondriów, potwierdzając tym samym brak rotenonu w tych obszarach.Analiza komponentu ciał Lewy w chorobie Parkinsona, alfa-synukleiny, po podaniu rone pozwala na wiarygodne określenie całkowitej ilości powierzchniowej alfa-synukleiny, obecności inkluzji alfa-synukleiny oraz wzorca rozmieszczenia alfa-synukleiny w komórce. Na tej ilustracji przedstawiono barwienie przeciwciałem anty-beta-III-tubulinie, alfa-synukleinie oraz DAPI w przekrojach dwunastnicy i jelita cienkiego, co widać tutaj. Półtoramiesięczna terapia roach known wywołała zwiększenie punktowego wzorca alfa-synukleiny w zwojach jelitowego układu nerwowego, nawet w porównaniu z grupą kontrolną po trzech miesiącach.Wzorzec ten można zaobserwować zarówno w jelicie krętnym, jak i w dwunastnicy. Po trzech miesiącach leczenia w barwieniu immunofluorescencyjnym z użyciem przeciwciał przeciwko alfa-synukleinie można dostrzec formowanie się większych inkluzji alfa-synukleiny; zastosowanie przeciwciał przeciwko alfa-synukleinie, theof, flawinie i DPI wykazuje agregację większych skupień alfa-synukleiny wyłącznie w trzecim miesiącu. Eksperyment ten przeanalizowano przy użyciu metod automatycznej segmentacji oraz progowania opartego na entropii.Na wykresie po lewej stronie każda kolumna przedstawia całkowity stosunek powierzchni alfa-synukleiny do powierzchni zwoju. Na wykresie po prawej stronie każda kolumna przedstawia całkowitą liczbę inkluzji alfa-synukleiny na pobraną powierzchnię zwoju. Wspólnie dane te sugerują, że miejscowe podanie rotenonu indukuje fosforylację, akumulację i agregację alfa-synukleiny wraz z gliozą w zwojach jelitowego układu nerwowego. Po opanowaniu techniki ta może zostać wykonana w ciągu jednej minuty na zwierzę, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby delikatnie wprowadzać zgłębnik do żołądka; w przypadku napotkania jakichkolwiek przeszkód lepiej go wyciągnąć i wprowadzić ponownie, postępując zgodnie z opisanymi krokami. Można zastosować inne metody, takie jak HPLC, barwienie immunologiczne oraz analiza obrazu. Pozwoli to na analizę innych obszarów, efektów działania substancji, a nawet obecności substancji we krwi po jej podaniu.Technika ta utorowała drogę neurobiologom do badania wpływu neurotoksyn środowiskowych na jelitowy układ nerwowy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie prawidłowo zastosować wzornik oraz przeanalizować obrazy uzyskane z immunochemii. Pamiętaj, że praca z zepsutymi materiałami może być niezwykle niebezpieczna.W związku z tym zalecamy stosowanie rękawiczek i maseczek podczas wykonywania tej procedury.

oral-administration-rotenone-using-gavage-image-analysis-alpha

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Podawanie doustne rotenonu za pomocą żołędzi i analiza obrazów wtrętów alfa-synucleiny w układzie nerwowym jelitowym

Ten film pokazuje wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny myszowi w celu wywołania zapalenia nerwów. Włókienka są wstrzykiwane dootrzewnowo transgenicznej myszy wykazującej ekspresję zmutowanych białek alfa-synukleiny. Po dotarciu do ośrodkowego układu nerwowego fibryle wnikają do neuronów i indukują agregację zmutowanych białek. Agregaty rozprzestrzeniają się na sąsiednie neurony, mikroglej i astrocyty. Rozpoznanie agregatów powoduje, że mikroglej indukuje zapalenie nerwów, uszkadzając neurony.

Indukcja zapalenia nerwów u myszy poprzez wstrzyknięcie włókien alfa-synukleiny

Opisano zostało ELISA oferujące nowatorskie podejście ilościowe. Specyficznie wykrywa związane z chorobą α-synukleina (αSD) w transgennym modelu myszym (M83) synucleinopatii za pomocą kilku przeciwciał skierowanych albo przeciw fosforylowanej w Ser129 formie αS, albo przeciwko C-końcowej części białka.

Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób lokalne dostarczanie genów za pośrednictwem wektorów wirusowych zapewnia atrakcyjny sposób ekspresji transgenów w ośrodkowym układzie nerwowym.  Protokół określa wszystkie kluczowe kroki w celu wykonania wstrzyknięcia wektora wirusowego w istotę czarną szczura w celu opracowania opartego na wektorze wirusowym modelu zwierzęcego dla choroby Parkinsona.

Opracowanie szczurzego modelu choroby Parkinsona opartego na alfa-synukleinie poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie rekombinowanego wektora wirusowego związanego z adenowirusem

Obwodowe wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny do otrzewnej lub języka myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-), które wykazują ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny z rodzinną mutacją A53T i lucyferazą świetlika, może wywołać neuropatologię, w tym zapalenie nerwów, w ich ośrodkowym układzie nerwowym.

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.

Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu

W tym artykule pokazujemy, jak używać siedmiopunktowego systemu punktacji do konsekwentnego ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. System ten jest przeznaczony do analiz testów neurodegeneracji dopaminergicznej z wykorzystaniem genetycznych, chemicznych i opartych na wieku modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans

Ta praca analizuje dawkę wektora i czas ekspozycji wymagane do wywołania zapalenia nerwów, neurodegeneracji i upośledzenia motorycznego w tym przedklinicznym modelu choroby Parkinsona. Te wektory kodujące ludzką α-synukleinę są dostarczane do istoty czarnej w celu podsumowania patologii synukleiny związanej z chorobą Parkinsona.

Analiza mysiego modelu choroby Parkinsona indukowanego przez wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące ludzką α-synukleinę

Prezentowana jest wygodna metoda perfuzji grawitacyjnej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy. Immunofluorescencyjne wykrywanie fosforylowanej α-synukleiny wykazano w mysim modelu choroby Parkinsona. Praca ta kompleksowo opisuje również etapy perfuzji przezsercowej, rozwarstwienia, zamrażania/osadzania tkanek i zamrażania sekcji.

Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy

Obecny protokół opisuje metodę donosowego podawania agregatów α-synukleiny. Metoda ta dostarcza informacji na temat propagacji α-synukleiny z błony śluzowej węchu do opuszki węchowej w chorobie Parkinsona.

Technika donosowego podawania agregatów α-synukleiny

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowia oraz hipokampa u myszy w stadium E14.5. Wykazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców dendrytycznych w tych dwóch obszarach mózgu.

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Poznaj metodę doustnego podawania rotenonu myszom za pomocą zgłębnika oraz analizę akumulacji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym. Technika ta umożliwia badanie neurotoksycznych efektów pestycydów w kontekście choroby Parkinsona.

Podawanie rotenonu drogą doustną za pomocą zgłębnika oraz analiza obrazowa inkluzji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym

Przeglądaj więcej filmów