Doustne podawanie rotenonu za pomocą zgłębnika i analiza obrazu inkluzji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym

Objawy choroby Parkinsona, w tym dysfunkcja motoryczna i mowa, wynikają ze zmniejszonej aktywności komórek wydzielających dopaminę w mózgu. Jelitowy układ nerwowy i opuszka węchowa są najbardziej narażonymi strukturami nerwowymi i pierwszymi, które są dotknięte chorobą. Choroba Parkinsona jest związana z narażeniem na pestycydy.

W celu przeanalizowania wpływu pestycydów na jelitowy układ nerwowy, pestycyd roone podaje się myszom przez zgłębnik doustny. Myszy są następnie perfundowane dosercowo za pomocą 4% paraformu, aldehydu mózgu i jelitowego układu nerwowego. Tkanka jest ekstrahowana, przygotowywana i barwiona immunologicznie dla białek związanych z chorobą Parkinsona.

Obrazy beta trzech tubuliny i alfa synukleiny uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej wykazują akumulację alfa synukleiny w neuronach jelitowego układu nerwowego u zwierząt narażonych na pestycydy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ogólnoustrojowe podawanie rotenonu, jest to, że przy użyciu tej techniki zapewnia się, że działanie rotenonu jest ograniczone do jelitowego układu nerwowego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące choroby Parkinsona, takie jak jej etiologia i mechanizmy leżące u podstaw jej progresji.

Implikacje tej techniki rozszerzają terapię wieżową i diagnostykę choroby Parkinsona, ponieważ pozwolą na opracowanie nowych celów terapeutycznych i metod diagnostycznych. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w patofizjologię choroby Parkinsona, może być również stosowana do innych systemów, takich jak badanie wpływu innych toksyn środowiskowych na jelitowy, współczulny i przywspółczulny układ nerwowy, a także ścianę jelita. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały problemy, ponieważ opanowanie zgłębnika zajmuje trochę czasu.

Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tych metod, kiedy przeczytałem o związku między pestycydami a chorobą Parkinsona. Pomocne było również zobaczenie konferencji o wysokim poziomie CORA na Światowym Kongresie Parkinsona w Berlinie w 2005 roku. Konieczna jest pokojowa demonstracja tej metody.

Metoda podawania ol za pomocą zgłębnika jest trudna, ponieważ myszy mają inną anatomię niż ludzie po drugiej stronie, analiza obrazu została przeprowadzona z dostosowanymi krokami dla tych obrazów. Rozpocznij protokół od zważenia zwierzęcia. Oblicz odpowiednią objętość rotenonu.

Potrzeba 0,01 mililitra na gram masy ciała zwierzęcia, co odpowiada dawce pięciu miligramów na kilogram. Napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra roztworem roone, a następnie naładuj drugą strzykawkę roztworem pojazdu. Podnieś mysz i przytrzymaj ogon myszy jedną ręką.

Rozciągnij skórę szyi, ciągnąc ją pierwszymi dwoma palcami drugiej ręki. Gdy głowa zostanie zamocowana między dwoma palcami, oprzyj ją o dłoń i odwróć do góry nogami. Napraw ogon.

Używając czwartego i piątego palca, trzymając głowę do tyłu, naciśnij podniebienie, aby otworzyć usta myszy. Delikatnie wprowadź zgłębnik do ust. Powoli przesuwaj zgłębnik w kierunku żołądka, aż zostanie włożony na całą długość.

Aby uniknąć przedostania się materiału do płuc, należy podać roztwór roone lub nośnik, delikatnie naciskając zator na zator. Po zakończeniu powoli wyjmij zgłębnik, umieść zwierzę z powrotem w innej klatce, aż wszystkie zwierzęta z jednej klatki będą gotowe. Po leczeniu myszy są obficie obficie nasycone 4% aldehydem paraformowym.

W PBS jelita są następnie ekstrahowane przez sekcję i umieszczane na noc w 15% sacharozy. Następnego dnia tkanka jest przenoszona do 30% sacharozy i ponownie inkubowana przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Tkankę umieszcza się następnie w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i przechowuje do czasu użycia za pomocą kriostatu 20 mikronów jelita.

Przekroje poprzeczne są przenoszone na szkiełka rostowe, procedury blokujące i immunobarwienia. Następnie wykonuje się stosowanie przeciwciał anty beta three tubuliny i synukleiny Antifa. Zaleca się, aby osoba zewnętrzna przeprowadziła ślepą analizę danych.

Aby rozpocząć analizę, otwórz oprogramowanie Fiji. Otwórz plik obrazu konfokalnego. Następnie podziel kanały tak, aby w miarę możliwości pracować na każdym kanale niezależnie.

Zamknij te kanały, które nie będą używane, i wybierz, przeanalizuj, ustawij, przeskaluj i ustaw rozmiar piksela na jeden. Ustaw znaną odległość na 0,13 i kliknij globalny. Rozmiar obrazu będzie teraz wyświetlany w mikronach.

Wybierz kanał alfa synukleiny i wybierz ganglion. Upewnij się, że zaznaczenie obejmuje ganglion we wszystkich plasterkach. Zduplikuj obraz z wybranym ganglionem, tylko obraz o rozmiarze ganglionu zostanie zduplikowany.

Naciśnij edytuj wyczyść poza częścią obrazu poza wybranym obszarem, który stanie się. Ponownie zduplikuj obraz, aby określić, jak dobrze przebiegła procedura. Obrazy, które mają niski stosunek sygnału do szumu tła, nie powinny być używane do analizy obrazu.

Wybierz próg regulacji obrazu. Następnie wybierz maksymalną entropię. Następnie przesuń się po plasterkach na przyciętym obrazie i oryginalnym, aby upewnić się, że procedura przebiegła pomyślnie.

Próg zwrotnikowy wybiera poziom sygnału intensywności na podstawie histogramu obrazu i tylko te piksele o intensywności wyższej niż ten próg będą wyświetlane w procesie wyboru obrazu z białym na czarnym. Następnie kliknij gładkie. Ten krok przekształca pikselowane krawędzie obrazów w proces wyboru gładkich krawędzi.

Następnie kliknij binarny i wybierz Utwórz binarny. Obraz zostanie wyświetlony jako zduplikowany obraz czarno-biały, aby wykonać następny krok na zduplikowanym obrazie, kliknij analizuj, analizuj cząstki. Następnie wybierz pokaż kontury i kliknij podsumowanie.

Reszta ustawień powinna pozostać domyślna. Ta funkcja rozpoznaje całkowitą liczbę pikseli z sygnałem, a te, które są zgrupowane razem, całkowitą powierzchnię pikseli z sygnałem. Ponadto podawana jest liczba grup pikseli i średni rozmiar.

Porównaj i wybierz plasterek o największej powierzchni całkowitej, który dobrze się dopasowuje. Wycinek zostanie oznaczony. Skopiuj tabelę danych z całkowitą powierzchnią synukleiny alfa, liczbą inkluzji i średnią wielkością cząstek.

Wklej dane do arkusza kalkulacyjnego programu Excel lub z adnotacjami w innym miejscu. Powrót na Fidżi. Znajdź poprzednio wybrany wycinek w kanale beta tubuliny i wybierz go.

Wybierz obszar ganglionu i kliknij analizuj. Następnie wybierz miarę. Pojawi się kolejna tabela pokazująca całkowitą powierzchnię ganglionu.

Wyodrębnij dane z tabeli do arkusza kalkulacyjnego programu Excel w pobliżu pomiaru synukleiny alfa lub skopiuj je w inne miejsce za pomocą programu Excel. Podziel różne parametry uzyskane w pomiarze synukleiny alfa przez powierzchnię zwoju, aby uzyskać całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny i liczbę inkluzji znormalizowaną przez rozmiar zwoju w celu analizy wpływu roonu działającego miejscowo na jelitowy układ nerwowy, pięć miligramów na kilogram znanej zgnilizny pestycydu podawano przez zgłębnik doustny 1-rocznym czarnym myszom C 57. Pokazany tutaj chromatogram pokazuje obecność znanego piku rotanowego godzinę po podaniu kontrolnym myszom leczonym 20 miligramami na kilogram rotenonu 10 i pięcioma miligramami na kilogram rotenonu.

Poziomy rotenonu określono dla ekstrakcji krwi i mózgu oraz pnia mózgu za pomocą HPLC, jak pokazano tutaj. Podanie pięciu miligramów na kilogram zgniłego przez zgłębnik doustny nie powoduje mierzalnych poziomów we krwi jednej, dwóch lub trzech godzin po leczeniu, jak określono przez H plc. Ta grafika pokazuje poziomy zgnilizny w mózgu i pniu mózgu leczonych myszy.

Godzinę po ekstrakcji podanie 10 miligramów na kilogram lub mniej rotenonu nie wykazuje żadnych poziomów rotonu w próbkach mózgu lub pnia mózgu. Godzinę po podaniu kompleksu mitochondrialnego oceniano jedną aktywność w próbkach mięśni i mózgu myszy leczonych przez 1,5 miesiąca. Nie ma istotnej różnicy między grupami wykazującymi brak hamowania mitochondrialnego kompleksu jeden, co potwierdza, że w tych regionach nie było ronu.

Analiza choroby Parkinsona, składnika ciała Lewy'ego alfa synukleiny po podaniu rone pozwala na wiarygodne określenie całkowitej powierzchniowej ilości alfa synukleiny, obecności inkluzji alfa synukleiny oraz wzoru alfa synukleiny w komórce. Ten rysunek pokazuje barwienie tubuliny anty beta trzy, alfa synukleiny i DAPI w odcinkach dwunastnicy i jelita krętego, jak widać tutaj. 1,5-miesięczne leczenie karaluchem Known wywołało zwiększony punktowy wzór alfa synukleiny w zwojach jelitowego układu nerwowego, nawet jeden w porównaniu z trzymiesięczną kontrolą.

Ten wzór można zaobserwować zarówno w jelicie krętym, jak i dwunastnicy. Po trzech miesiącach leczenia można zaobserwować tworzenie większych inkluzji alfa synukleiny, barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu anty alfa synukleiny, theof, flawiny i DPI wykazuje agregację większych nagromadzeń alfa synukleiny dopiero po trzech miesiącach. Eksperyment ten został przeanalizowany przy użyciu metod automatycznej segmentacji i progowania opartych na entropii.

Na wykresie po lewej stronie każda kolumna reprezentuje całkowitą powierzchnię synukleiny alfa do powierzchni zwoju. Na wykresie po prawej stronie każda kolumna reprezentuje całkowitą liczbę inkluzji alfa synukleiny na pobraną powierzchnię zwoju. Łącznie dane te sugerują, że miejscowe podawanie rotenonu indukuje fosforylację, akumulację i agregację alfa synukleiny z glejozą w zwojach jelitowego układu nerwowego Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu jednej minuty na zwierzę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby delikatnie wprowadzić zgłębnik, a jeśli zostaną znalezione jakiekolwiek przeszkody, lepiej go wyjąć i wprowadzić ponownie, postępując zgodnie z tymi procedurami. Można wykonać inne metody, takie jak HPLC, barwienie immunologiczne i analiza obrazu. Umożliwi to analizę innych regionów, działania substancji, a nawet obecności substancji we krwi po jej powstaniu.

Technika ta utorowała drogę neurobiologom do zbadania wpływu neurotoksyn środowiskowych na jelitowy układ nerwowy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie prawidłowo nałożyć miernik i przeanalizować obrazy pochodzące z immunochemii. Nie zapominaj, że praca ze zgniłymi może być bardzo niebezpieczna.

Dlatego podczas wykonywania tego zabiegu zalecamy stosowanie rękawiczek i maseczek. Ten.