Name: Doustne podawanie rotenonu za pomocą zgłębnika i analiza obrazu inkluzji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Poznaj metodę doustnego podawania rotenonu myszom za pomocą zgłębnika oraz analizę akumulacji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym. Technika ta umożliwia badanie neurotoksycznych efektów pestycydów w kontekście choroby Parkinsona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana przez Fundację Pedro Barrie de la Maza.

1) Podanie rotenonu drogą wewnątrzżołądkową
<ol>
<li>Zważ zwierzę.</li>
<li>Oblicz całkowitą objętość niezbędnego roztworu rotenonu/nośnika. W tym przypadku jest to 0,01 ml na gram masy ciała zwierzęcia.</li>
<li>Napełnij strzykawkę 1 mL wcześniej obliczoną objętością roztworu rotenonu (0,625 mg/mL rotenonu, 4% karboksymetylocelulozy i 1,25% chloroformu) lub roztworu nośnika (4% karboksymetylocelulozy i 1,25% chloroformu). W tym przypadku odpowiada to dawce rotenonu 5 mg/kg.</li>
<li>Chwyć mysz i, trzymając ją jedną ręką za ogon, naciągnij skórę szyi, pociągając ją dwoma pierwszymi palcami drugiej ręki.</li>
<li>Po unieruchomieniu głowy między dwoma palcami, oprzyj ją o wnętrze dłoni i odwróć do góry nogami. Unieruchom ogon za pomocą czwartego i piątego palca.</li>
<li>Trzymając głowę skierowaną do tyłu, naciśnij podniebienie, aby otworzyć pysk myszy. Delikatnie wprowadź zgłębnik do pyska. Ważne jest użycie igły do zgłębnika, a nie zwykłej igły. Powoli przesuwaj zgłębnik w kierunku żołądka na odpowiednią głębokość. Zapobiegnie to przedostaniu się materiału do płuc.</li>
<li>Podaj roztwór rotenonu lub nośnik, delikatnie naciskając tłok. Po zakończeniu powoli wyjmij zgłębnik.</li>
<li>Przenieś zwierzę z powrotem do innej klatki, aż wszystkie zwierzęta z jednej klatki zostaną poddane procedurze.</li>
</ol>
2) Procedury immunobarwienia
<ol>
<li>Po zakończeniu leczenia myszy poddaje się znieczuleniu przy użyciu Ketamin 100 mg/kg oraz Xylazin 10 mg/kg i.p., a następnie wykonuje perfuzję wewnątrzsercową z użyciem 4% Paraformaldehyde w PBS.</li>
<li>Następnie drogą sekcji wycina się jelita i umieszcza je w 15% sacharozie na noc. Następnego dnia tkankę przenosi się do 30% sacharozy i ponownie inkubuje przez noc w temperaturze 4°C.</li>
<li>Tkankę umieszcza się następnie w Tissue-tek i przechowuje w zamrażarce w temperaturze -80°C do czasu użycia.</li>
<li>Za pomocą kriotomatu wykonuje się przekroje poprzeczne jelita o grubości 20 micron i przenosi je na szkiełka Superfrost.</li>
<li>Następnie przeprowadza się procedury blokowania i immunostaining z użyciem przeciwciał anty-βIII-tubulin oraz anty-alpha-synuclein, zgodnie z wcześniejszymi opisami 9.</li>
</ol>
3) Analiza obrazów inkluzji alfa-synukleiny
Zaleca się, aby analizy dokonała osoba zewnętrzna nieznająca pochodzenia obrazów. W związku z tym dane powinny zostać zakodowane. Analiza obrazów została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania FIJI.
<ol>
<li>Otwórz plik obrazu konfokalnego. Następnie rozdziel kanały, aby umożliwić niezależną pracę na każdym z nich.</li>
<li>Zamknij kanały, które nie będą używane, wybierz Analyze&gt;Set Scale i ustaw Pixel size na 1. Ustaw known distance na 0.13 (wartość ta zależy od użytego obiektywu i rozdzielczości) i kliknij global. Rozmiar obrazu będzie teraz wyświetlany w mikronach.</li>
<li>Wybierz kanał alfa-synukleiny i zaznacz zwoj (ganglion), upewniając się, że zaznaczenie obejmuje zwoj we wszystkich warstwach (slices).</li>
<li>Wybierz Image&gt;Duplicate, aby zduplikować obraz. Przy zaznaczonym zwoju zostanie zduplikowany tylko fragment obrazu o rozmiarze zwoju.</li>
<li>Wybierz Edit&gt;Clear Outside. Część obrazu poza zaznaczonym obszarem stanie się czarna.</li>
<li>Ponownie zduplikuj obraz, aby w późniejszych krokach ocenić poprawność procedury. Obrazy o wysokim stosunku sygnału do szumu i tła nie powinny być używane do analizy obrazu.</li>
<li>Wybierz Image&gt;Adjust&gt;Threshold, a następnie wybierz MaxEntropy. Przejrzyj warstwy w przyciętym obrazie oraz w obrazie oryginalnym, aby upewnić się, że procedura przebiegła pomyślnie. Próg entropijny wybiera poziom sygnału intensywności na podstawie histogramu obrazu, a na obrazie białym na czarnym zostaną wyświetlone tylko te piksele, których intensywność przekracza ten próg.</li>
<li>Wybierz Process, a następnie kliknij Smooth. Ten krok przekształca poszarpane krawędzie obrazów w krawędzie gładkie.</li>
<li>Wybierz Process, następnie kliknij Binary i wybierz Make Binary. Obraz zostanie wyświetlony jako obraz czarno-biały.</li>
<li>Zduplikuj obraz, aby wykonać następny krok na kopii.</li>
<li>Kliknij Analyze&gt;Analyze particles. Następnie wybierz Show:Outlines i kliknij Summarize. Pozostałe ustawienia powinny pozostać domyślne. Funkcja ta rozpoznaje całkowitą liczbę pikseli z sygnałem oraz te, które są ze sobą zgrupowane. Raportowana jest całkowita powierzchnia pikseli z sygnałem, liczba grup pikseli oraz średni rozmiar.</li>
<li>Porównaj i wybierz największą warstwę, która dobrze pasuje. Warstwa zostanie zaznaczona.</li>
<li>Skopiuj tabelę danych zawierającą całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny, liczbę inkluzji i średni rozmiar cząsteczek. Wklej dane do arkusza Excel lub zapisz je w innym miejscu.</li>
<li>Wróć do FIJI, znajdź wcześniej wybraną warstwę w kanale β-tubuliny i zaznacz ją.</li>
<li>Zaznacz obszar zwoju, kliknij Analyze, a następnie wybierz Measure. Pojawi się kolejna tabela pokazująca całkowitą powierzchnię zwoju.</li>
<li>Przenieś dane z tabeli do arkusza Excel obok pomiarów alfa-synukleiny lub skopiuj je w inne miejsce.</li>
<li>W programie Excel podziel poszczególne parametry uzyskane w pomiarze alfa-synukleiny przez powierzchnię zwoju, aby otrzymać całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny oraz liczbę inkluzji znormalizowaną do wielkości zwoju.</li>
</ol>
4) Reprezentatywne wyniki
Pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia protokołu podawania przez zgłębnik, niedogodności dla zwierzęcia są minimalne. Leczenie z zastosowaniem tej koncentracji rotenonu umożliwia uzyskanie miejscowego efektu działania rotenonu na ENS bez obecności rotenonu we krwi oraz bez hamowania mitochondrialnego Kompleksu I w mięśniach lub mózgu, nawet po 1,5 miesiąca leczenia (patrz Rysunek 1). Przy prawidłowym przeprowadzeniu analizy obrazu możliwa powinna być rygorystyczna analiza wzorca alfa-synukleiny. Pozwala ona na uzyskanie wiarygodnych danych na temat całkowitej ilości alfa-synukleiny (całkowita powierzchnia), wzorca alfa-synukleiny w komórce (liczba inkluzji) oraz obecności inkluzji alfa-synukleiny (rozmiar inkluzji) (Rysunek 2).
 <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig1.jpg" alt="Chromatogramy i wykresy słupkowe; badanie poziomu i aktywności rotenonu we krwi i OUN przy różnych dawkach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Dysfunkcja motoryczna u myszy traktowanych rotenonem bez wykrycia rotenonu we krwi lub OUN. A, standard (50 ng/mL) oraz chromatogram z próbek mózgu myszy traktowanych dawkami 20, 10 i 5 mg/kg. B i C, ilościowe oznaczenie poziomu rotenonu we krwi (B) i OUN (C). B, poziomy we krwi 1, 2 i 3 godziny po traktowaniu. Myszy podzielono na trzy grupy (n=3) i podano im rotenon w dawkach 2,5, 5, 10 i 20 mg/kg (n=3); 300 μL krwi pobrano 1, 2 i 3 godziny po podaniu rotenonu, a następnie połączono próbki do analizy HPLC. C, myszy traktowano przez jeden tydzień raz dziennie dawkami 5 (n=3), 10 (n=3) i 20 (n=1) mg/kg rotenonu; mózg i pień mózgu wyizolowano 1 i 2 godziny po ostatniej aplikacji i przygotowano do analizy HPLC. D, aktywność mitochondrialnego Kompleksu I w próbkach mięśni i mózgu myszy traktowanych przez 1,5 miesiąca.
 <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig2.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna βIII-tubuliny/α-synukleiny, znakowanie Thioflaviną S, analiza wykresów słupkowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Miejscowo podawany rotenon indukuje fosforylację, akumulację i agregację alfa-synukleiny wraz z gliozą w zwojach ENS. (paski skali 20 μm). A, B, C, barwienie przeciwko βIII-tubulinie, alfa-synukleinie i DAPI w przekrojach dwunastnicy (B) i jelita krętego (A,C). Strzałka w B, 1,5-miesięczne leczenie spowodowało zwiększenie punktowego wzorca alfa-synukleiny wewnątrz zwojów jelitowego układu nerwowego w porównaniu do kontroli z 3 miesięcy (A). Strzałka w C, 3-miesięczne leczenie wywołało tworzenie się większych inkluzji alfa-synukleiny (ø&gt;6 μm). D, barwienie immunofluorescencyjne z użyciem przeciwciał przeciwko alfa-synukleinie, Thioflavine S i DAPI. Strzałka w D, tylko u myszy leczonych przez 3 miesiące stwierdzono agregację tych większych akumulacji alfa-synukleiny. E, E', E'', etapy ilościowej analizy obrazu. E, przykład obrazu użytego w kwantyfikacji przedstawiający zwój ENS przebarwiony przeciwko alfa-synukleinie z widocznymi różnymi inkluzjami. E', przykład obrazu uzyskanego po zastosowaniu protokołu analizy obrazu. E'', nakładanie się niektórych oryginalnych inkluzji (zielone) i reprezentacji uzyskanej po wykonaniu protokołu (żółte linie). F-G, kwantyfikacja eksperymentu przedstawionego w A-C została przeprowadzona przy użyciu automatycznej segmentacji i metod progowania opartych na entropii. Pojedyncza gwiazdka, P&lt;0.05, a podwójna gwiazdka, P&lt;0.01. F, każda kolumna reprezentuje całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny/powierzchnię zwoju. G, każda kolumna reprezentuje całkowitą liczbę inkluzji alfa-synukleiny/powierzchnię zwoju. Wszystkie wykresy przedstawiają średnią ± s.e.m.

<ol><li>Braak, H., de Vos, R. A., Bohl, J., Del Tredici, K., K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+alpha-synuclein+immunoreactive+inclusions+in+Meissner%27s+and+Auerbach%27s+plexuses+in+cases+staged+for+Parkinson%27s+disease-related+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology.</a> Neurosci Lett. 396, 67-72 (2006).</li>
<li>Wakabayashi, K., Takahashi, H., Ohama, E., Ikuta, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+an+immunohistochemical+study+of+Lewy+body-containing+neurons+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system.</a> Acta Neuropathol. 79, 581-583 (1990).</li>
<li>Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+occurrence+of+Lewy+bodies+in+the+dorsal+vagal+nucleus+in+a+patient+with+late-onset+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Restricted occurrence of Lewy bodies in the dorsal vagal nucleus in a patient with late-onset parkinsonism.</a> J Neurol Sci. 165, 188-191 (1999).</li>
<li>Braak, H., Sastre, M., Bohl, J. R., de Vos, R. A., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+lesions+in+dorsal+horn+layer+I%2C+involvement+of+parasympathetic+and+sympathetic+pre-+and+postganglionic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons.</a> Acta Neuropathol. 113, 421-429 (2007).</li>
<li>Braak, H., Ghebremedhin, E., Rub, U., Bratzke, H., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+in+the+development+of+Parkinson%27s+disease-related+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology.</a> Cell Tissue Res. 318, 121-134 (2004).</li>
<li>Gorell, J. M., Johnson, C. C., Rybicki, B. A., Peterson, E. L., Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+risk+of+Parkinson%27s+disease+with+exposure+to+pesticides%2C+farming%2C+well+water%2C+and+rural+living%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The risk of Parkinson's disease with exposure to pesticides, farming, well water, and rural living.</a> Neurology. 50, 1346-1350 (1998).</li>
<li>Semchuk, K. M., Love, E. J., Lee, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+exposure+to+agricultural+work+and+pesticide+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and exposure to agricultural work and pesticide chemicals.</a> Neurology. 42, 1328-1335 (1992).</li>
<li>Butterfield, P. G., Valanis, B. G., Spencer, P. S., Lindeman, C. A., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+antecedents+of+young-onset+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Environmental antecedents of young-onset Parkinson's disease.</a> Neurology. 43, 1150-1158 (1993).</li>
<li>Pan-Montojo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+Parkinson%27s+disease+pathology+is+reproduced+by+intragastric+administration+of+rotenone+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice.</a> PLoS One. 5, e8762-e8762 (2010).</li>
<li>Sherer, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+toxicity+in+rotenone+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 23, 10756-10764 (2003).</li>
<li>Bove, J., Prou, D., Perier, C., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-induced+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Toxin-induced models of Parkinson's disease.</a> NeuroRx. 2, 484-494 (2005).</li>
<li>Inden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+of+mouse+nigrostriatal+dopaminergic+system+induced+by+repeated+oral+administration+of+rotenone+is+prevented+by+4-phenylbutyrate%2C+a+chemical+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration of mouse nigrostriatal dopaminergic system induced by repeated oral administration of rotenone is prevented by 4-phenylbutyrate, a chemical chaperone.</a> J Neurochem. 101, 1491-1504 (2007).</li>
</ol>

Francisco Pan-Montojo posiada oczekujący wniosek patentowy dla tego modelu zwierzęcego (numer wniosku PCT/EP 2009/005688).

Podawanie domięśniowe było wcześniej stosowane 12. Jednakże, zgodnie z manuskryptem Indena, rotenon podawano rozpuszczony wyłącznie w 0,5% soli sodowej karboksymetylocelulozy (CMSS). Rotenon jest substancją silnie lipofilową. W związku z tym rotenonu nie można rozpuścić w samym 0,5% CMSS, gdyż uległby on wytrąceniu. Zastosowanie chloroformu pozwala na stworzenie równomiernie rozprowadzonej zawiesiny rotenonu, zapobiegając jego wytrącaniu. Ponadto, dzięki wyższym stężeniom pestycydów w CMSS, końcowa objętość po...

<table><tbody><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3313.1</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Karboksymetyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5678</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Kaniula do gavage 1,2 mm x 60 mm</td><td>Unimed</td><td></td><td>Szwajcaria</td></tr><tr><td>LSM 510</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>http://pacific.mpi-cbg.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

podawanie rotenonu drogą doustną za pomocą zgłębnika oraz analiza obrazowa inkluzji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

U pacjentów z chorobą Parkinsona (PD) powiązana z nią patologia wykazuje charakterystyczny schemat obejmujący między innymi jelitowy układ nerwowy (ENS) 1,2, opuszka węchową (OB), jądro grzbietowe nerwu błądzącego (DMV)3, jądro pośrednio-boczne rdzenia kręgowego 4 oraz istotę czarną, co stanowi podstawę neuropatologicznego stopnia zaawansowania choroby4,5. ENS i OB są najbardziej narażonymi strukturami nerwowymi i pierwszymi, które zostają dotknięte procesem chorobowym. Co ciekawe, PD wiązano z ekspozycją na pestycydy6-8. W niniejszej pracy szczegółowo przedstawiamy dwie metody wykorzystane w naszym poprzednim badaniu 9. Aby przeanalizować efekty działania rotenonu miejscowo na ENS, podawaliśmy rotenon poprzez zgłębnik jednorocznym myszom C57/BL6. Rotenon jest powszechnie stosowanym pestycydem, który silnie hamuje mitochondrialny Kompleks I 10. Jest on silnie lipofilny i słabo wchłania się w przewodzie pokarmowym 11. Nasze wyniki wykazały, że podanie 5 mg/kg rotenonu nie zahamowało aktywności mitochondrialnego Kompleksu I w mięśniach ani w mózgu. Sugeruje to, że przy zastosowaniu naszej metody podawania rotenon nie przenikał przez system hepatoportalny i działał wyłącznie na ENS. Przedstawiamy tutaj metodę podawania pestycydów za pomocą zgłębnika oraz protokół analizy obrazu wykorzystany do oceny wpływu pestycydów na akumulację alfa-synukleiny w ENS. Pierwsza część prezentuje metodę umożliwiającą dokustryczne podawanie pestycydów (rotenonu) w pożądanym, precyzyjnym stężeniu. Druga metoda przedstawia półautomatyczny protokół analizy obrazu do oceny akumulacji alfa-synukleiny w ENS przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.

Choroba Parkinsona była wiązana z ekspozycją na pestycydy. Przedstawiamy tutaj metodę podawania pestycydów za pomocą zgłębnika żołądkowego w pożądanym stężeniu oraz metodę analizy ich wpływu na gromadzenie się alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym.

Podawanie rotenonu drogą doustną za pomocą zgłębnika oraz analiza obrazowa inkluzji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym

U pacjentów z chorobą Parkinsona (PD) towarzysząca patologia wykazuje charakterystyczny wzorzec obejmujący między innymi jelitowy układ nerwowy (ENS) 1,2, ...

Objawy choroby Parkinsona, w tym zaburzenia motoryczne i mowy, wynikają z obniżonej aktywności komórek wydzielających dopaminę w mózgu. Przewodem pokarmowym oraz opuszka węchowa są najbardziej narażonymi strukturami nerwowymi i pierwszymi, które ulegają uszkodzeniu. Chorobę Parkinsona wiązano z ekspozycją na pestycydy.W celu analizy wpływu pestycydów na jelitowy układ nerwowy, myszom podaje się pestycyd roone poprzez zgłębnik dożołądkowy. Następnie u myszy przeprowadza się perfuzję wewnątrzsercową 4% paraformaldehydem, aby utrwalić mózg i jelitowy układ nerwowy. Tkanka jest pobierana, preparowana i poddawana barwieniu immunocytochemicznemu w celu wykrycia białek związanych z PD.Obrazy beta III tubuliny oraz alfa-synukleiny uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej wykazują akumulację alfa-synukleiny wewnątrz neuronów jelitowego układu nerwowego u zwierząt poddanych działaniu pestycydów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak systemiczna administracja rotenonu, jest zapewnienie, że efekt działania rotenonu jest ograniczony do jelitowego układu nerwowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące choroby Parkinsona, takie ja

oral-administration-rotenone-using-gavage-image-analysis-alpha

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Podawanie doustne rotenonu za pomocą żołędzi i analiza obrazów wtrętów alfa-synucleiny w układzie nerwowym jelitowym

Ten film pokazuje wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny myszowi w celu wywołania zapalenia nerwów. Włókienka są wstrzykiwane dootrzewnowo transgenicznej myszy wykazującej ekspresję zmutowanych białek alfa-synukleiny. Po dotarciu do ośrodkowego układu nerwowego fibryle wnikają do neuronów i indukują agregację zmutowanych białek. Agregaty rozprzestrzeniają się na sąsiednie neurony, mikroglej i astrocyty. Rozpoznanie agregatów powoduje, że mikroglej indukuje zapalenie nerwów, uszkadzając neurony.

Indukcja zapalenia nerwów u myszy poprzez wstrzyknięcie włókien alfa-synukleiny

Opisano zostało ELISA oferujące nowatorskie podejście ilościowe. Specyficznie wykrywa związane z chorobą α-synukleina (αSD) w transgennym modelu myszym (M83) synucleinopatii za pomocą kilku przeciwciał skierowanych albo przeciw fosforylowanej w Ser129 formie αS, albo przeciwko C-końcowej części białka.

Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób lokalne dostarczanie genów za pośrednictwem wektorów wirusowych zapewnia atrakcyjny sposób ekspresji transgenów w ośrodkowym układzie nerwowym.  Protokół określa wszystkie kluczowe kroki w celu wykonania wstrzyknięcia wektora wirusowego w istotę czarną szczura w celu opracowania opartego na wektorze wirusowym modelu zwierzęcego dla choroby Parkinsona.

Opracowanie szczurzego modelu choroby Parkinsona opartego na alfa-synukleinie poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie rekombinowanego wektora wirusowego związanego z adenowirusem

Obwodowe wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny do otrzewnej lub języka myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-), które wykazują ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny z rodzinną mutacją A53T i lucyferazą świetlika, może wywołać neuropatologię, w tym zapalenie nerwów, w ich ośrodkowym układzie nerwowym.

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.

Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu

W tym artykule pokazujemy, jak używać siedmiopunktowego systemu punktacji do konsekwentnego ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. System ten jest przeznaczony do analiz testów neurodegeneracji dopaminergicznej z wykorzystaniem genetycznych, chemicznych i opartych na wieku modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans

Ta praca analizuje dawkę wektora i czas ekspozycji wymagane do wywołania zapalenia nerwów, neurodegeneracji i upośledzenia motorycznego w tym przedklinicznym modelu choroby Parkinsona. Te wektory kodujące ludzką α-synukleinę są dostarczane do istoty czarnej w celu podsumowania patologii synukleiny związanej z chorobą Parkinsona.

Analiza mysiego modelu choroby Parkinsona indukowanego przez wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące ludzką α-synukleinę

Prezentowana jest wygodna metoda perfuzji grawitacyjnej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy. Immunofluorescencyjne wykrywanie fosforylowanej α-synukleiny wykazano w mysim modelu choroby Parkinsona. Praca ta kompleksowo opisuje również etapy perfuzji przezsercowej, rozwarstwienia, zamrażania/osadzania tkanek i zamrażania sekcji.

Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy

Obecny protokół opisuje metodę donosowego podawania agregatów α-synukleiny. Metoda ta dostarcza informacji na temat propagacji α-synukleiny z błony śluzowej węchu do opuszki węchowej w chorobie Parkinsona.

Technika donosowego podawania agregatów α-synukleiny

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowia oraz hipokampa u myszy w stadium E14.5. Wykazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców dendrytycznych w tych dwóch obszarach mózgu.

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Poznaj metodę doustnego podawania rotenonu myszom za pomocą zgłębnika oraz analizę akumulacji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym. Technika ta umożliwia badanie neurotoksycznych efektów pestycydów w kontekście choroby Parkinsona.

Podawanie rotenonu drogą doustną za pomocą zgłębnika oraz analiza obrazowa inkluzji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym

Przeglądaj więcej filmów