Test fluorescencyjny na bazie gramicydyny; do określania potencjału małych cząsteczek do modyfikowania właściwości dwuwarstw lipidowych

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar wywołanych przez lek zmian we właściwościach dwuwarstwowych, wykrywanych przez białka obejmujące dwie warstwy. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw dużych, jednostronnych slesów obciążonych fluorem. Drugim etapem zabiegu jest domieszkowanie pęcherzyków graminą.

Trzecim krokiem procedury jest dodanie zewnętrznego wygaszacza i zmierzenie szybkości hartowania wewnętrznego fluoro. Cztery. Ostatnim etapem procedury jest ilościowe określenie zmiany w wygaszaniu fluoru na aktywność graminy poprzez dopasowanie rozciągniętej funkcji wykładniczej do przebiegu czasu fluorescencji. Ostatecznie można uzyskać wyniki, aby ocenić, czy pliki amfi mogą zmieniać właściwości dwuwarstwowych lipidów.

Cześć, nazywam się Ola Anderson. Cześć, jestem Helson. Cześć, nazywam się Richie Kapo.

Nazywam się Leah Sanford i pracuję w laboratorium doktora Olafa Andersona na Wydziale Fizjologii i Biofizyki w Weill Cornell Medical College. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę pomiaru zmian właściwości biowarstwy lipidowej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania wpływu leków i małych cząsteczek na właściwości dwuwarstwowe lipidów.

Więc zacznijmy Pierwszego dnia tej procedury wyjmij lipid z zamrażarki i pozwól mu zrównoważyć się do temperatury pokojowej. Po zrównoważeniu dodać 0,6 mililitra 25 miligramów na mililitr, roztwór lipidów i chloroformu do 25-mililitrowej kolby okrągłodennej. Następnie osuszyć roztwór pod gazowym azotem, ciągle obracając kolbę, aż cały chloroform odparuje.

Cienka biała warstwa lipidów pokrywa całą dolną połowę kolby, susząc lipid dalej w wysuszeniu w próżni przez noc. Przygotować roztwór 100 milimolowych azotanów sodu, 25 milimolowych, A NTS i 10 milimolowych HEP o pH siedem. Dostosowując pH tego roztworu, należy unikać roztworów zawierających chlorki.

Ponieważ tal Quencher tworzy nierozpuszczalny kompleks z chlorkiem drugiego dnia, należy ponownie nawodnić lipidy w 1,67. Jeden mililitr tego roztworu elektrolitu, aby uzyskać 10-milimolową zawiesinę lipidów. Po osiągnięciu właściwego stężenia przykryj folią par i dokładnie zmieszaj zawiesinę, dokładnie zabezpiecz próbkę przed światłem folią i pozwól jej leżakować w temperaturze pokojowej przez noc.

Trzeciego dnia należy poddać mieszaninę sonikacji przez jedną minutę w sonikacie o niskiej mocy. Następnie zamrażać, rozmrażać próbkę przez pięć minut na suchym lodzie, a następnie przez pięć minut w ciepłej wodzie, powtórzyć cykl zamrażania i rozmrażania cztery do pięciu razy. Wytłaczaj zawiesinę lipidową za pomocą mini ekstrudera Avanti.

Ustaw mini wytłaczarkę z filtrem poliwęglanowym 0,1 mikrona, a wsporniki filtrów wytłaczają zawieszenie w przód iw tył 21 razy, tak aby prawie przezroczysta zawiesina znalazła się w przeciwległej strzykawce, co spowodowało powstanie dużego pęcherzyka lub zawiesiny LUV. Usunąć zewnętrzny A NTS, przesuwając wytłaczaną zawiesinę po kolumnie dulującej PD 10, która została zrównoważona buforem sodu. Dodać 1,5 mililitra zawiesiny LUV plus jeden mililitr buforu sodowego do kolumny.

Po całkowitym włączeniu roztworu do kolumny, wymyj liposomy trzema mililitrami buforu sodowego i zbierz eluat. Otrzymany roztwór podstawowy LUV wypełniony NTS powinien zawierać około czterech do pięciu milimolowych lipidów i wydawać się półprzezroczysty. Mlecznobiały.

Chronić roztwór przed światłem folią i przechowywać w temperaturze 13 stopni Celsjusza na 24 godziny przed użyciem dokładnie zwirować. Roztwór podstawowy LUV wypełniony A NTS. Ponieważ UUV mają gęstość większą niż jeden gram na mililitr i/lub osad.

Następnie rozcieńczyć roztwór podstawowy LUV wypełniony A NTS. Jeden do 20 z buforem sodowym inkubować trzy czwarte liposomów z 260 nanogramami abidyny w DMSO. Dodaj tę samą objętość DMSO bez graminy do pozostałej jednej ćwiartki.

Aby utrzymać stałe stężenie rozpuszczalnika we wszystkich próbkach, należy pozwolić graminie na zrównoważenie między wewnętrznymi i zewnętrznymi monowarstwami pęcherzyków lipidowych przez 24 godziny w temperaturze 13 stopni Celsjusza. W tym przypadku do pomiaru szybkości wygaszania fluorescencji stosuje się spektrofluorymetr SX z zatrzymanymi przepływami SX punkt 20 z kontrolą temperatury. Aby rozpocząć, włącz instrumenty z godzinnym wyprzedzeniem, aby umożliwić rozgrzewkę instrumentu.

Szczelina ze sprawozdawcami do wzbudzenia powinna być równa jednemu ukośnikowi, a do rejestracji emisji za pomocą oprogramowania pro data SX należy użyć filtra górnoprzepustowego o długości 4 55 nanometrów. Najpierw ustaw warunki nagrywania, ustaw długości fal wzbudzenia monochromatora na 3 52 nanometry. Użyj ustawienia utrzymywania ciśnienia.

Ustaw czas na jedną sekundę i wskazuje na 5 000. Dostosuj liczbę powtórzeń do dziewięciu dla przebiegów buforowych i do 13 dla przebiegów wygaszania. Monitoruj temperaturę w oprogramowaniu Essex sprawdź profil napędu.

Objętość napędu powinna być ustawiona na 120 mikrolitrów, co powoduje wymieszanie 60 mikrolitrów z każdej strzykawki. Daje to czas martwy wynoszący około 1,2 milisekundy. Dostosuj wysokie napięcie lub wzmocnienie detektora fluorescencji na około 420 woltów.

Celem jest uzyskanie odczytu fluorescencji na poziomie około ośmiu, zrównoważenie wcześniej przygotowanych UUV załadowanych A NTS przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności. Po zrównoważeniu należy odwirować próbkę, a następnie załadować ją do lewej strzykawki. W odpowiedniej strzykawce albo bufor sodu, albo tal. Gaszenie.

Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, popychając strzykawki do przodu i do tyłu. Obie strzykawki powinny być załadowane jednakowo. Przed zamknięciem zaworów dla pierwszej próbki należy zarejestrować fluorescencję za pomocą buforu sodu.

Powtórz cztery razy i w razie potrzeby dostosuj wzmocnienie. Następnie powtórzyć czynności dodatkowe pięć razy dla pozostałych próbek. Nagrać dziewięć powtórzeń z buforem sodu.

Zastąp bufor sodowy środkiem wygaszającym tal i zapisz 13 powtórzeń. Spłukać wodą i kontynuować kolejne kontrole próbki. Uwzględnić próbki bez graminy i z rozpuszczalnikiem, bez graminy i o maksymalnym stężeniu związku.

A gdy zarówno gramina, jak i rozpuszczalnik są zgodne z testem fluorescencji, odczytaj dane do oprogramowania MATLAB w celu analizy. Dla każdej próbki odczytanej we wszystkich powtórzeniach bufora i wygaszania, pierwsze cztery powtórzenia zostaną zanieczyszczone tym, co wcześniej znajdowało się w przewodach. W tym przypadku sygnał pochodzi z próbki buforu sodowego zmieszanej z wodą z poprzedniego płukania.

Powtórzenia od pięciu do dziewięciu reprezentują sygnał z samej próbki. Dlatego zawsze wykluczamy pierwsze cztery powtórzenia w każdym przypadku. Aby uniknąć artefaktów mieszania, ręcznie przejrzyj ślady i usuń wszelkie złe powtórzenia, takie jak czerwony ślad zawierający skoki lub odchylenia spowodowane artefaktami mieszania i/lub pęcherzykami.

Następnie znormalizuj powtórzenia wygaszania do średniej wartości początkowej powtórzeń bufora dla każdej próbki dla każdego warunku doświadczalnego, połącz średnie ze wszystkich próbek w jeden wykres wizualizacji próbek bez graminy, wszystkie powinny być podobne i prawie nie wykazywać wygaszania fluorescencji. Następuje powolna redukcja sygnału fluorescencyjnego z powodu powolnego przenikania jonu talu do pęcherzyków w przypadku próbek z Gram sydyną. Jeśli przebieg czasu fluorescencji jest widocznie zmieniony przez związek, to związek zmienia właściwości dwuwarstwy lipidowej przy badanym stężeniu, a następnie dopasowuje się do rozciągniętego wykładnika do pierwszych dwóch do 100 milisekund znormalizowanych krzywych wygaszania fluorescencji.

Dla poszczególnych powtórzeń i oblicz szybkość na dwie milisekundy. Następnie oblicz średnie i odchylenia standardowe dla danej próbki od poszczególnych Powtórzenia wpływ kapsaicyny oznaczonej tutaj jako cap zaobserwowano na przebieg czasowy wygaszania fluorescencyjnego przy braku lub obecności graminy oznaczonej jako ga, znormalizowany sygnał fluorescencyjny jest tutaj pokazany w ciągu jednej sekundy. Szare kropki reprezentują wyniki ze wszystkich powtórzeń, a czerwone linie to średnie.

Pokazane jest pierwsze 100 milisekund znormalizowanego sygnału fluorescencyjnego. Szare kropki są wynikiem pojedynczego powtórzenia dla każdego warunku. Czerwone linie to rozciągnięte wykładniczo dopasowania do tych powtórzeń.

Stłumiona niebieska linia oznacza znak dwóch milisekund. Czas, w którym określa się szybkość hartowania. Względną zmianę szybkości tłumienia określa się poprzez normalizację danych do próbki kontrolnej za pomocą graminy i bez modyfikatora.

Kiedy kapsaicyna wchłania się do dwuwarstwy lipidowej, zmienia właściwości dwuwarstwy. Zmiana w kierunku bardziej miękkiej dwuwarstwy zostanie odzwierciedlona jako przesunięcie strony grama w równowadze monodimerów na korzyść dimeru przewodzącego. Właśnie pokazaliśmy Ci procedurę pomiaru dwuwarstwowych efektów zakłócających małej cząsteczki.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o użyciu odpowiednich kontroli dla każdego eksperymentu z użyciem tej samej partii pęcherzyków. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.