Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków
7 stycznia 2019
Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.
Test ten został opracowany w celu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii błon plazmatycznych i ustalenia, jak skutecznie uszkodzone komórki mogą ponownie uszczelnić błonę plazmatyczną. Technika ta może być wykorzystana do pomiaru skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w wysokiej przepustowości oraz do identyfikacji określonych białek i odpowiadających im szlaków, które pośredniczą w ponownym uszczelnianiu błony plazmatycznej. Zacznij od dodania 20 mililitrów 2,5 razy 10 do piątej komórki HeLa na mililitr zawiesiny pożywki wzrostowej do sterylnej miski na pipety i użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby dokładnie wymieszać komórki.
Następnie za pomocą mikropipety wielokanałowej wysiewaj 100 mikrolitrów komórek na studzienkę w trzech egzemplarzach na 96-dołkowej płaskiej, przezroczystej płytce z czarnym polistyrenem poddanym kulturze tkankowej. Należy pamiętać, że jednorodne rozmieszczenie komórek jest kluczem do udanego eksperymentu, ponieważ porównania między wszystkimi warunkami eksperymentalnymi wymagają równoważnej liczby komórek. Po 24 godzinach w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 podgrzej czytnik płytek do 37 stopni Celsjusza i ustaw konfigurację optyczną na monochromator, tryb odczytu na fluorescencję, a typ odczytu na kinetyczny.
W ustawieniach długości fali wybierz wzbudzenie dziewięcionanometrowe i pasmo przepustowe emisji 15 nanometrów. W przypadku testów z użyciem jodku propidyny należy ustawić długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio na 535 nanometrów i 617 nanometrów. W polu Typ płyty wybierz 96 dołków dla formatu płyty i wybierz wstępnie ustawioną konfigurację płyty odpowiadającą przezroczystej płycie dolnej o czarnych ściankach.
W obszarze odczytu zaznacz dołki, które będą analizowane podczas testu kinetycznego. W obszarze PMT i optyka ustaw liczbę błysków na odczyt na sześć i zaznacz pole odczytu od dołu. W polu Chronometraż wprowadź zero godzin 30 minut i zero sekund w całkowitym czasie trwania 30-minutowego testu kinetycznego i wprowadź zero godzin, pięć minut i zero sekund dla interwału.
Potwierdź określone ustawienia w informacjach o ustawieniach i kliknij przycisk OK. Następnie kliknij przeczytaj, aby rozpocząć bieg kinetyczny. Aby ustawić parametry obrazowania w trybie ustawień, ustaw MiniMax dla konfiguracji optycznej, obrazowanie dla trybu odczytu i punkt końcowy dla typu odczytu. W obszarze długości fal wybierz światło przechodzące i odpowiednie pola fluorescencyjne odpowiadające eksperymentalnym długościom fal wzbudzenia i emisji.
Ustaw typ płytki i obszar odczytu, jak właśnie pokazano, a w ustawieniu obszaru studni ustaw liczbę miejsc w studni, które mają być obrazowane. W ustawieniach akwizycji obrazu dla GFP ustaw urządzenie tak, aby obrazowało całą studnię z czasem naświetlania 20 milisekund na obraz. W przypadku światła przechodzącego uzyskaj pojedynczy obraz środka każdej studzienki z ośmiomilisekundowym czasem ekspozycji.
W przypadku jodku propidyny uzyskaj pojedynczy obraz w środku każdej studzienki z 20-milisekundowym czasem ekspozycji. Następnie potwierdź ustawienia w informacjach o ustawieniach i kliknij OK i przeczytaj, aby rozpocząć obrazowanie. Aby skonfigurować wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji dla warunków permisywnych naprawy, umyj komórki dwa razy 200 mikrolitrami pożywki M1 o temperaturze 37 stopni Celsjusza na studzienkę i dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki M1 o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionej 30 mikromolowym jodkiem propidyny po odrzuceniu drugiego prania.
W celu naprawy warunków restrykcyjnych należy przemyć ogniwa jeden raz 200 mikrolitrami pożywki M2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionej pięcioma milimolowymi EGTA na studzienkę, a następnie przemyć je jednym myciem 200 mikrolitrami samej pożywki M2. Po odrzuceniu drugiego prania dodać 100 mikrolitrów świeżej pożywki M2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionej 30 mikromolowym jodkiem propydyny na studzienkę. Następnie zobrazuj płytkę w świetle przechodzącym, GFP i PI, jak właśnie pokazano.
Podczas obrazowania płytki umieść 96-dołkową mikropłytkę polipropylenową z okrągłym dnem na lodzie i skonfiguruj płytkę tak, jak pokazano dla poprzedniej płytki. W celu naprawy warunków permisywnych dodać 100 mikrolitrów lodowatego podłoża M1 uzupełnionego 60 mikromolowym jodkiem propidyny na studzienkę, a następnie dodać 100 mikrolitrów lodowatego M1 z lub bez 4X listeriolizyny O na studzienkę. W celu naprawy warunków ograniczających dodaj 100 mikrolitrów lodowatego podłoża M2 uzupełnionego 60 mikromolowym jodkiem propidyny na studzienkę, a następnie dodaj 100 mikrolitrów lodowatego M2 z lub bez 4X listeriolizyny O na studzienkę.
Konieczne jest przygotowanie listeriolizyny O w odpowiednim stężeniu doświadczalnym na lodzie na około pięć minut przed rozpoczęciem próby kinetycznej, gdy pierwsza tabliczka znajduje się na lodzie, a druga jest przygotowywana. Po zakończeniu obrazowania pierwszej płytki natychmiast przenieś ją na arkusz folii aluminiowej na lodzie. Po pięciu minutach przenieść 100 mikrolitrów z każdej studzienki drugiej płytki do odpowiedniego dołka w pierwszej schłodzonej płytce, wkładając końcówki pipet poniżej menisku roztworu do każdej studzienki przed wyrzuceniem objętości bez mieszania w celu prawidłowego rozprowadzenia toksyny.
Pozwól, aby toksyna związała się z komórkami gospodarza przez jedną minutę i natychmiast przenieś pierwszą płytkę do czytnika płytek w celu przeprowadzenia testu postkinetycznego w trybie spektrofluorometru. Pod koniec testu kinetycznego należy natychmiast uzyskać postkinetyczne obrazowanie obrazu płytki, jak pokazano w przypadku obrazowania przedkinetycznego. Aby określić liczbę komórek na podstawie fluorescencji jądrowej, w oprogramowaniu do liczenia komórek mikropłytki w ustawieniach wybierz ponowną analizę, a w ustawieniach analizy obrazu wybierz dyskretną analizę obiektów przy użyciu 541 jako długości fali do wyszukiwania obiektów.
W opcji znajdź obiekty użyj metody wyszukiwania rysowania na obrazach, wybierz jądra i kliknij zastosuj, a następnie kliknij OK i przeczytaj, aby zainicjować algorytm zliczania komórek. Ekspresja GFP nie zakłóca pomiarów intensywności jodku propidyny w obecności lub bez leczenia listeriolizyną O. Ekspresja jodku propydyny może przenikać przez fluorescencję GFP, o czym świadczy wzrost intensywności fluorescencji GFP w komórkach HeLA H2B-GFP w teście obrazowania postkinetycznego w porównaniu z analizą prekinetyczną.
Co jednak ważne, to skrzyżowanie nie wpływa na zliczanie komórek, ponieważ wzrost fluorescencji GFP nie ma wpływu na proces segmentacji związany z liczeniem jąder. W przypadku braku listeriolizyny O integralność błony komórkowej pozostaje stała w obecności lub braku wapnia zewnątrzkomórkowego, podczas gdy leczenie listeriolizyną O w obecności pożywki uzupełnionej wapniem powoduje stały wzrost intensywności fluorescencji jodku propidyny. Jednak przy braku wapnia zewnątrzkomórkowego następuje znacznie bardziej gwałtowny wzrost fluorescencji jodku propidyny, co odzwierciedla brak ponownego uszczelniania błony.
Alternatywnie, barwnik wiążący kwas nukleinowy karbocyjaniny z fluorescencją w dalekiej czerwieni można zastąpić jodkiem propidyny, aby zminimalizować nakładanie się widma z GFP. Ponadto większy współczynnik wzbudzenia dla barwnika dalekiej czerwieni wykazuje wyższy stosunek sygnału do szumu i lepszą rozdzielczość między warunkami zezwalającymi na naprawę a warunkami ograniczającymi naprawę. Podczas wykonywania tej procedury zaleca się oznaczenie wszystkich probówek na dzień przed eksperymentem, ponieważ przygotuje to Cię do przygotowania całego odczynnika w dniu eksperymentu.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak cytometria obrazowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy toksyna tworząca pory uszkadza wszystkie komórki równomiernie, czy też niektóre komórki są bardziej podatne niż inne. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami zakaźnymi i naprawą błon plazmatycznych do zbadania wpływu wielkości porów na skuteczność naprawy różnych typów komórek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje wysokoprzepustowy test fluorescencyjny służący do pomiaru wydajności uszczelniania błony plazmatycznej w żywych komórkach. Test ten został zaprojektowany w celu przesiewania leków lub genów docelowych, które wpływają na ten krytyczny proces komórkowy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Obrazowanie fluorescencyjne
- Biologia błon
Wstęp
- Zrozumienie procesu uszczelniania błony plazmatycznej jest kluczowe dla przeżycia komórki.
- Uszkodzone komórki muszą efektywnie uszczelniać swoje błony, aby utrzymać homeostazę.
- Niniejszy test pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii błony plazmatycznej.
- Identyfikacja białek i szlaków zaangażowanych w proces uszczelniania może prowadzić do postępów w terapeutyce.
Cel badania
- Opracowanie wysokoprzepływowej metody oceny wydajności uszczelniania błony.
- Identyfikacja specyficznych białek pośredniczących w procesie uszczelniania.
- Ułatwienie przesiewania leków związanych z mechanizmami naprawy błony.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zawiesiny komórek HeLa do analizy.
- Wysiew komórek na płytkę 96-dołkową do analizy.
- Pomiary fluorescencyjne z wykorzystaniem czytnika płytek.
- Monitorowanie zachowania komórek po uszkodzeniu w celu oceny efektywności uszczelniania błony.
Główne wyniki
- Analiza pozwala na ilościowe określenie wydajności uszczelniania błony.
- Możliwości wysokoprzepustowe umożliwiają szerokie przesiewanie warunków.
- Można zidentyfikować specyficzne białka zaangażowane w proces uszczelniania.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia reakcji komórkowych na uszkodzenia błony.
Wnioski
- Ten test jest cennym narzędziem do badania biologii błony plazmatycznej.
- Może on pomóc w odkrywaniu celów terapeutycznych dla naprawy błony.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć wiedzę na temat zidentyfikowanych szlaków i białek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Uszczelnianie błony plazmatycznej jest kluczowym mechanizmem przetrwania, który determinuje odporność komórek na stres mechaniczny i biochemiczny, co bezpośrednio wpływa na walidację celu w toksykologii i farmakologii bezpieczeństwa. Ten wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji umożliwia ilościowy pomiar wydajności uszczelniania na poziomie populacyjnym, wspierając mechanistyczną redukcję ryzyka we wczesnej fazie odkrywania leków poprzez identyfikację genetycznych lub związkowych modulatorów naprawy błony. Kompatybilność testu z czytnikami mikropłytkowymi i platformami obrazowania pozwala na jego integrację z kaskadami przesiewowymi mającymi na celu zwiększenie pewności prognostycznej w identyfikacji związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie wpływu perturbacji genetycznych lub małych cząsteczek na efektywność uszczelniania błony plazmatycznej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów poprzez analizę kinetyki napływu barwników nieprzenikających przez błony, zapewniając bezpośredni odczyt przywrócenia bariery.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację związków lub celów zwiększających uszczelnianie, co redukuje odsetek niepowodzeń na późnych etapach badań ze względu na cytotoksyczność.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez standaryzację pomiarów uszczelniania w formatach 96-dołkowych przy użyciu czytników mikropłytek z kontrolą temperatury.
- Wynik ilościowy: Generuje kinetyczne dane intensywności fluorescencji, które umożliwiają obliczenie wydajności uszczelniania, co wspiera standaryzację testu i potwierdzenie trafień.
- Skalowalność: Umożliwia przesiewanie genów gospodarza lub egzogennie dodanych związków dzięki protokołom kompatybilnym z automatyzacją, co zwiększa możliwość ponownego wykorzystania platformy w kampaniach przesiewowych fenotypowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie kliniczne: Modeluje uszkodzenia błony plazmatycznej istotne w przypadku niedokrwienia, stanu zapalnego i chorób zakaźnych, umożliwiając dopasowanie biomarkerów translacyjnych.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, dostarczając ilościowego i powtarzalnego miernika zdolności komórek do regeneracji.
- Decyzje z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju poprzez powiązanie efektywności uszczelniania błony z przeżywalnością komórek w warunkach stresu, co zmniejsza niepewność biologiczną podczas optymalizacji wiodących kandydatów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od weryfikacji hipotez dotyczących celu terapeutycznego, przez identyfikację związków wiodących, aż po ocenę przedkliniczną, szczególnie w szlakach, w których integralność błony wpływa na wyniki fenotypowe.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez pomiar wpływu konkretnych białek lub leków na kinetykę uszczelniania w kontrolowanym, powtarzalnym formacie.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość testu oraz wyniki ilościowe, które umożliwiają niezawodną ocenę związków z dużych bibliotek w formacie kompatybilnym z mikropłytkami.
- Analityka: Umożliwia pomiary kinetyki fluorescencji oraz odczyty obrazowania pokinetycznego, co pozwala zespołom na porównywanie wydajności uszczelniania w różnych warunkach i normalizację liczby komórek za pomocą fluorescencji jąder.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie mechanizmów naprawy błon istotnych dla systemów związanych z chorobami, wspierając postępy zgodne z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako możliwość ponownego wykorzystania w projektach badających mechanizmy cytotoksyczne, uszkodzenia wywołane toksynami lub związki cytoprotekcyjne.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w zakresie odpowiedzi komórkowych na uszkodzenia błon).
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność dzięki zastosowaniu kinetycznego obrazowania na płytkach wielodołkowych oraz zautomatyzowanego liczenia komórek.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania cytotoksyczności, co zwiększa efektywność kapitałową i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację celów wzmacniających procesy uszczelniania błon lub związków poprawiających odporność komórkową.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej, kinetycznego odczytu płytek oraz standaryzacji hodowli komórkowych.
- Zależne od wykorzystania wielofunkcyjnych czytników mikropłytek z kontrolą temperatury, możliwości odczytu od dołu oraz kompatybilnych zestawów filtrów dla jodku propidyny lub alternatyw w zakresie dalekiej czerwieni.
- Wymaga standaryzacji przygotowania toksyn, protokołów płukania i czasu pomiaru pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności pomiarów uszczelniania.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji przy rozszerzeniu metody na linie komórkowe inne niż HeLa lub komórki pierwotne ze względu na zmienność wydajności transfekcji i składu błony.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak nakładanie się widm GFP i jodku propidyny, co może wymagać zastąpienia ich barwnikami dalekiej czerwieni w celu zachowania wierności sygnału.
