Name: Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę fluorescencyjną do pomiaru skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w żywych komórkach ssaków. Ta technika umożliwia identyfikację białek i szlaków naprawczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Jesse Kwiek (Uniwersytet Stanowy Ohio) za uprzejme umożliwienie nam korzystania z jego wielotrybowej platformy detekcyjnej do wstępnych eksperymentów. Badania opisane w tym artykule były wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer RO1AI107250 dla Stephanie Seveau. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Wysiew komórek 
	Uwaga: W tym protokole zastosowano ludzkie komórki nabłonka szyjki macicy HeLa oraz HeLa wykazujące ekspresję Histony 2B-GFP (H2B-GFP), jednak test ten można dostosować do innych komórek ssaków19.
	<ol>
		<li>Oddzielić komórki adherentne z kolby do hodowli komórek o powierzchni 75 cm2, przemywając je 2 mL Trypsyny-EDTA 0,25%. Zastąpić zużytą trypsynę 2 mL świeżej trypsyny-EDTA 0,25%.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 ˚C przez 5 min, aż komórki przyjmą kształt kulisty i oddzielą się od ścianek kolby.</li>
		<li>Resuspendować komórki w 8 mL pożywki wzrostowej (DMEM zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/mL penicyliny oraz 100 µg/mL streptomycyny).</li>
		<li>Określić stężenie komórek za pomocą hemocytometru, wykorzystując 10 µL zawiesiny komórkowej.</li>
		<li>Rozcieńczyć komórki w pożywce wzrostowej do stężenia 2,5 x 105 komórek/mL.</li>
		<li>Przelać zawiesinę komórkową do sterylnego pojemnika na pipety i dokładnie wymieszać zawiesinę za pomocą pipety serologicznej 10 mL.</li>
		<li>Za pomocą 12-kanałowej mikropipety i końcówek 200 µL rozdzielić komórki HeLa (2,5 x 104 komórek/100 µL/dołek) w trzech (lub czterech) powtórzeniach na 96-dołkowej czarnej polistyrenowej płytce do hodowli tkanek o płaskim, przezroczystym dnie. 
		Uwaga: Przykład układu wysiewu przedstawiono na Rysunku 1.</li>
		<li>Hodować komórki przez 24 h w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórek w temperaturze 37 ˚C i 5% CO2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworów stokowych
	<ol>
		<li>Przygotować 1 L 10-krotnego roztworu stokowego buforu M (używanego do przygotowania M1 i M2), dodając 95 g zrównoważonego roztworu soli Hanksa, 0,476 g MgCl2 (5 mM) oraz 23,83 g HEPES (100 mM) do 900 mL wody. Dostosować pH do 7,4 i uzupełnić objętość do 1 L. Sterylizować przez filtrację.</li>
		<li>Przygotować 50 mL 50-krotnego (1,25 M) roztworu stokowego glukozy, dodając 11,26 g D-(+)-glukozy do całkowitej objętości 50 mL wody. Sterylizować roztwór przez filtrację.</li>
		<li>Przygotować 50 mL 100-krotnego (120 mM) roztworu stokowego wapnia, dodając 0,666 g CaCl2 do całkowitej objętości 50 mL wody. Sterylizować roztwór przez filtrację.</li>
		<li>Przygotować 50 mL 10-krotnego (50 mM) roztworu stokowego kwasu etylenoglikolu-bis(2-aminoetyloeteru)-N,N,N’,N’,tetraoctowego (EGTA), dodając 0,951 g EGTA do 40 mL wody. Podnieść pH do 8 za pomocą NaOH, aby rozpuścić EGTA, a następnie uzupełnić objętość do 50 mL. Sterylizować roztwór przez filtrację.</li>
		<li>Dla jednej płytki 96-dołkowej przygotować odpowiednio 50 mL Pożywki 1 (M1, zawiera Ca2+), 50 mL Pożywki 2 (M2, wolnej od Ca2+) oraz 15 mL Pożywki 2 uzupełnionej o EGTA:
		<ol>
			<li>W przypadku M1 dodać 5 mL 10-krotnego buforu M, 0,5 mL 100-krotnego CaCl2 oraz 1 mL 50-krotnej glukozy do 43,5 mL wody.</li>
			<li>W przypadku M2 dodać 5 mL 10-krotnego buforu M oraz 1 mL 50-krotnej glukozy do 44 mL wody.</li>
			<li>W przypadku M2/EGTA dodać 1,5 mL 10-krotnego buforu M oraz 1,5 mL 10-krotnego EGTA do 12 mL wody. 
			Uwaga: Wszystkie roztwory zawierające jodek propidyny (PI) należy przygotować bezpośrednio przed dodaniem do komórek.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawienia czytnika płytek/cytometru obrazującego 
	Uwaga: Należy użyć wielofunkcyjnego czytnika płytek wyposażonego w dwie jednostki detekcyjne: spektrofluorometr i cytometr obrazujący. Ograniczyć ekspozycję na fluorescencję, aby uniknąć fotobielenia fluoroforów.
	<ol>
		<li>Przed wykonaniem testu rozgrzać czytnik płytek do 37 °C.</li>
		<li>W trybie Settings odpowiednio skonfigurować parametry testu kinetycznego:
		<ol>
			<li>W konfiguracji optycznej, trybach odczytu i typie odczytu wybrać odpowiednio Monochromator, FL (fluorescence) oraz Kinetic.</li>
			<li>W sekcji Wavelength Settings wybrać odpowiednio pasmo przepustowości wzbudzenia 9 nm i emisji 15 nm. W przypadku testów z użyciem jodku propidyny (PI) ustawić długości fali wzbudzenia i emisji odpowiednio na 535 i 617 nm.</li>
			<li>W sekcji Plate Type wybrać format płytki 96 Wells oraz predefiniowaną konfigurację płytki odpowiadającą płytce o czarnych ściankach i przezroczystym dnie.</li>
			<li>W sekcji Read Area zaznaczyć dołki, które będą analizowane podczas pomiaru kinetycznego.</li>
			<li>W sekcji PMT and Optics ustawić liczbę błysków na odczyt na 6 oraz zaznaczyć pole Read from Bottom.</li>
			<li>W sekcji Timing wpisać 00:30:00 w polu Total Run Time dla 30-minutowego testu kinetycznego oraz 00:05:00 w polu Interval. 
			Uwaga: Czas odczytu pełnej płytki 96-dołkowej dla każdego punktu czasowego i jednej długości fali wynosi 30 s.</li>
			<li>Potwierdzić określone ustawienia w sekcji Settings Information po prawej stronie i wybrać OK. Nacisnąć Read, aby rozpocząć pomiar kinetyczny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W trybie Settings odpowiednio skonfigurować parametry obrazowania:
		<ol>
			<li>W konfiguracji optycznej, trybach odczytu i typie odczytu wybrać odpowiednio Minimax, Imaging oraz Endpoint.</li>
			<li>W sekcji Wavelengths wybrać transmitted light oraz jedno lub oba pola fluorescencji odpowiadające długościom fal wzbudzenia i emisji 456/541 nm (GFP) oraz 625/713 nm (PI).</li>
			<li>Zastosować te same opcje dla Plate Type i Read Area, co w krokach 1.3.2.3 i 1.3.2.4.</li>
			<li>W sekcji Well Area Setting wybrać liczbę obszarów w obrębie dołka, które mają zostać zobrazowane. 
			Uwaga: 12 obszarów odpowiada obrazowi całego dołka.</li>
			<li>W sekcji Image Acquisition Settings wybrać czasy ekspozycji dla światła przechodzącego, 541 (GFP) i 713 (PI). Dla GFP zobrazować cały dołek z czasem ekspozycji 20 ms/obraz. Dla światła przechodzącego (TL) i fluorescencji PI pozyskać pojedynczy obraz centrum każdego dołka z czasami ekspozycji odpowiednio 8 i 20 ms.</li>
			<li>Potwierdzić określone ustawienia w sekcji Settings Information po prawej stronie i wybrać OK. Czas akwizycji dla obrazowania całej powierzchni każdego dołka (12 obrazów/dołek) płytki 96-dołkowej dla jednej długości fali wynosi ok. 15 min. Nacisnąć Read, aby rozpocząć obrazowanie. 
			Uwaga: Czas akwizycji pojedynczego obrazu/dołka płytki 96-dołkowej dla jednej długości fali wynosi ok. 2,5 min/płytkę. Opisane powyżej parametry odpowiadają konkretnemu sprzętowi w naszym laboratorium. Pomiary spektrofluorometryczne: lampa błyskowa ksenonowa z długościami fal wzbudzenia w przyrostach 1,0 nm (250-850 nm) z regulowanym pasmem przepustowości 9 lub 15 nm, detektor w postaci fotopowielacza o zakresie dynamicznym &gt; 6 log i regulowanym pasmem przepustowości emisji 15 lub 25 nm. Cytometr obrazujący: źródło światła oświetlającego zdolne do generowania białego światła oraz długości fal wzbudzenia 460 nm i 625 nm z pasmem przepustowości 20 nm, filtry emisyjne centrowane odpowiednio na 541 nm (pasmo przepustowości 108 nm) i 713 nm (pasmo przepustowości 123 nm) oraz obiektyw 4X sprzężony z 12-bitową kamerą CCD o rozdzielczości 1,25 megapiksela.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza
Uwaga: W momencie przeprowadzania analizy konfluencja komórek musi wynosić 70-90%. Podczas etapów płukania medium należy usuwać i nanosić na ściankę boczną dołka (nie bezpośrednio na komórki). Należy utrzymać temperaturę LLO na poziomie &lt; w temperaturze 4 ˚C, aby zapobiec jego agregacji aż do kroku 3.1.5.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy 30 µM PI w M1 oraz roztwór zapasowy 30 µM PI w M2, uprzednio podgrzany do 37 ˚C.</li>
	<li>Delikatnie wypłukać komórki na płytce 1, używając 12-kanałowej pipety wielokanałowej i końcówek 200 µL, w następujący sposób:
	<ol>
		<li>W przypadku warunków dopuszczających naprawę (repair-permissive), usunąć pożywkę wzrostową i wypłukać komórki dwukrotnie 200 µL/studzienkę M1 podgrzanego do 37 ˚C. Zastąpić pożywkę 100 µL/studzienkę ciepłego M1 zawierającego 30 µM PI.</li>
		<li>W przypadku warunków ograniczających naprawę (repair-restrictive), usunąć pożywkę wzrostową i wypłukać komórki raz 200 µL/studzienkę ciepłego M2 zawierającego 5 mM EGTA w celu chelatowania Ca2+, a następnie wypłukać raz 200 µL/studzienkę M2. Zastąpić pożywkę 100 µL/studzienkę ciepłego M2 zawierającego 30 µM PI.</li>
		<li>Po wypłukaniu pożywki wzrostowej i zastąpieniu jej pożywką zawierającą jodek propidyny, przejść bezpośrednio do kroku 2.1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać obrazowanie płytki 1 w świetle przechodzącym, GFP oraz PI zgodnie z opisem w punkcie 1.3.3 (przed kinetyką). Krok ten trwa 15-20 min.</li>
	<li>Podczas 15-minutowego okresu w kroku 2.1.3, przygotować płytkę 2, używając 12-kanałowej pipety wielokanałowej i końcówek 200 µL w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Umieścić polipropylenową mikropłytkę 96-dołkową z okrągłym dnem na lodzie. Przygotować płytkę zgodnie z planem eksperymentalnym odpowiadającym płytce 1 (Rysunek 1).</li>
		<li>W przypadku warunków dopuszczających naprawę, dodać 100 µL/studzienkę lodowatego M1 zawierającego 60 µM PI, a następnie dodać 100 µL/studzienkę lodowatego M1 zawierającego 4x LLO lub pominąć ten krok w przypadku kontroli.</li>
		<li>W przypadku warunków ograniczających naprawę, dodać 100 µL/studzienkę lodowatego M2 zawierającego 60 µM PI, a następnie dodać 100 µL/studzienkę lodowatego M2 zawierającego 4x LLO lub pominąć ten krok w przypadku kontroli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po obrazowaniu płytki 1 (krok 2.1.3), natychmiast umieścić ją na lodzie, używając folii aluminiowej, aby oddzielić płytkę od bezpośredniego kontaktu z lodem. Pozostawić płytkę 1 do schłodzenia na 5 min.</li>
	<li>Używając 12-kanałowej pipety wielokanałowej i końcówek 200 µL, przenieść 100 µL z każdej studzienki płytki 2 (krok 2.1.4) do odpowiadających im studzienek w płytce 1. Aby prawidłowo rozprowadzić toksynę w pożywkach płytki 1, wprowadzić końcówki poniżej menisku i delikatnie wypuścić objętość, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza. 
	Uwaga: Nie pipetować w górę i w dół, ponieważ może to doprowadzić do przypadkowego odklejenia komórek.</li>
	<li>Pozostawić płytkę na dodatkową 1 min, aby toksyna mogła związać się z komórkami, a następnie natychmiast przenieść płytkę 1 do czytnika płytek w celu przeprowadzenia analizy kinetycznej w trybie spektrofluorometrycznym (krok 1.3.2).</li>
	<li>Po zakończeniu analizy kinetycznej, natychmiast wykonać obrazowanie płytki 1 (po kinetyce), stosując krok 1.3.3.</li>
</ol>
3. Analiza: Liczenie komórek
<ol>
	<li>Wyznaczyć liczbę komórek na podstawie fluorescencji jąder, korzystając z oprogramowania do zliczania komórek w mikropłytkach.
	<ol>
		<li>W sekcji Settings wybrać Re-analysis, a następnie w kategorii w ramach Image Analysis Settings wybrać Discreet Object Analysis, ustawiając długość fali 541 nm dla wykrywania obiektów.</li>
		<li>W opcji Find Objects, korzystając z metody wyszukiwania Draw on Images, wybrać Nuclei w karcie ustawień i nacisnąć Apply.</li>
		<li>Nacisnąć OK oraz Read, aby uruchomić algorytm zliczania komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie, w przypadku braku takiego narzędzia, użyć oprogramowania do analizy obrazu, np. ImageJ, aby przeliczyć komórki.
	<ol>
		<li>W programie ImageJ otworzyć plik obrazu jako stos (stack).</li>
		<li>Konwertować stos na 8-bitowe obrazy w skali szarości, klikając Image w pasku menu, najeżdżając na Type i wybierając 8-bit.</li>
		<li>Odjąć tło: kliknąć Image w pasku menu, najechać na Adjust i wybrać Brightness/Contrast. Dostosować wartość minimalną, aby usunąć szum tła, i wybrać Apply.</li>
		<li>Zastosować progowanie (threshold), aby utworzyć obrazy binarne: kliknąć Image w pasku menu, najechać na Adjust i wybrać Threshold. Wybrać Dark background, dostosować minimalną i maksymalną wartość progu, a następnie kliknąć Apply.</li>
		<li>W przypadku nakładających się jąder można użyć narzędzia Watershed do ich segmentacji. Kliknąć Process w menu, najechać na Binary i wybrać Watershed. 
		Uwaga: spowoduje to automatyczne rozdzielenie połączonych jąder.</li>
		<li>Przeanalizować zamaskowane obrazy, stosując określone przez użytkownika kryteria (rozmiar i kolistość), aby doprecyzować identyfikację jąder i wykluczyć debris komórkowe.
		<ol>
			<li>Kliknąć Analyze w menu, a następnie Analyze particles. Ustawić pożądane zakresy rozmiaru (pixel^2) i kolistości (wartość 1 oznacza idealne koło), które są wystarczające do uwzględnienia pojedynczych komórek/jąder.</li>
			<li>W rozwijanym polu Show wybrać żądane opcje, zaznaczyć Summarize i kliknąć OK, aby uzyskać liczbę komórek.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza: Krzywe kinetyczne
<ol>
	<li>Przenieś dane kinetyczne z oprogramowania czytnika płytek do oprogramowania do analizy danych.</li>
	<li>Dla każdego warunku doświadczalnego oblicz średnią intensywność fluorescencji powtórzeń w każdym punkcie czasowym, wraz z odpowiadającym im odchyleniem standardowym i błędem standardowym średniej dla każdego warunku doświadczalnego.</li>
	<li>Dla każdego warunku doświadczalnego wykreśl odpowiednią krzywą kinetyczną: intensywność PI (oś y) w funkcji czasu (oś x).</li>
	<li>Aby obliczyć wydajność uszczelniania dla danego warunku traktowania, oblicz pole pod krzywą (AUC) dla +LLO w M1 (AUC(M1)) oraz +LLO w M2 (AUC(M2)). Zastosuj poniższe podejście w celu oceny wydajności (E) uszczelniania: 
	<img alt="Równanie obliczania wydajności przy użyciu stosunków pól pod krzywą, AUC(M1) i AUC(M2)." src="/files/ftp_upload/58351/58351eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"></li>
	<li>Przeprowadź porównanie między kontrolą a traktowaniem testowym poprzez wyznaczenie współczynnika wydajności (REff) wskazanego poniżej: 
	<img alt="Równanie współczynnika efektywności do oceny grup testowych i kontrolnych, formuła matematyczna." src="/files/ftp_upload/58351/58351eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
	REFF = 1, traktowanie testowe nie ma wpływu na naprawę 
	REFF &lt; 1, traktowanie testowe hamuje naprawę 
	REFF &gt; 1, traktowanie testowe poprawia naprawę</li>
	<li>Oblicz pole pod krzywą korzystając z następującego równania: 
	<img alt="Formuła AUC dla całkowania numerycznego w analizie danych; równowaga statyczna, równanie." src="/files/ftp_upload/58351/58351eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3">, gdzie k jest całkowitą liczbą pomiarów kontrolnych.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test ten mierzy skuteczność ponownego uszczelniania błony na poziomie populacji komórek przy wysokiej przepustowości. Może być używany do badań przesiewowych w poszukiwaniu składników komórkowych lub bibliotek leków, które mogą wpływać na naprawę błony. W opisanym teście wykorzystano format płytki 96-dołkowej, ale można go dostosować do płytek 384-dołkowych w celu uzyskania większej przepustowości. Zaletą tego testu jest jego zdolność do uzyskiwania pomiarów fluorescencji przylegających żywych komórek w czasie rzeczywist...

Komórki ssaków są poddawane stresowi mechanicznemu, osmotycznemu i biochemicznemu, co skutkuje utratą integralności błony plazmatycznej. Bez szybkiego i skutecznego ponownego uszczelnienia uszkodzone komórki szybko uległyby zaprogramowanej lub martwiczej śmierci. Od lat sześćdziesiątych XX wieku wysiłki zmierzające do zrozumienia procesu ponownego uszczelniania błony komórkowej były motywowane niszczycielskimi konsekwencjami związanymi z jej dysfunkcjami. Rzeczywiście, choroby takie jak dystrofia mięśniowa obręczowo-kończynowa, cukrzyca i zespół Chediaka-Higashiego zostały powiązane z niedostateczną naprawą błony plazmatycznej z powodu mutacji w genie kodującym dysferlinę, produkcji zaawansowanych produktów końcowych glikacji i defektów w lizosomalnym regulatorze transportu CHS1, odpowiednio1,2,3,4,5,6. Jednak do tej pory nasza wiedza na temat ponownego uszczelniania membran jest nadal ograniczona7. Wstępne badania wykazały, że ponowne uszczelnienie błony jest inicjowane przez napływ zewnątrzkomórkowego Ca2+ przez uszkodzoną błonę plazmatyczną8,9,10. Od tego czasu zaproponowano kilka wzajemnie wykluczających się mechanizmów zależnych odCa2+ w celu ponownego uszczelnienia komórek. Hipoteza łatki zakłada, że w pobliżu rany pęcherzyki wewnątrzkomórkowe łączą się ze sobą i z uszkodzoną błoną plazmatyczną, działając jak łata11,12,13,14. Drugi model sugeruje, że zależna od wapnia egzocytoza lizosomów w miejscu rany uwalnia enzym lizosomalny kwas sfingomielinazę, który przekształca sfingomielinę w ceramid w zewnętrznej płatku błony komórkowej. Ta nagła zmiana składu lipidów powoduje endocytozę uszkodzonego regionu wywołaną ceramidami15,16,17. Wreszcie, trzeci proponowany mechanizm obejmuje rolę endosomalnego kompleksu sortującego wymaganego do transportu (ESCRT) w promowaniu tworzenia pęcherzyków skierowanych na zewnątrz, które wyrastają z błony komórkowej18. W tych modelach zidentyfikowano tylko ograniczony zestaw białek, a ich mechanizm musi zostać dokładniej wyjaśniony. 
Tutaj opisujemy test o wysokiej przepustowości, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej w przylegających komórkach ssaków poddanych uszkodzeniu, w którym pośredniczy rekombinowana listeriolizyna O (LLO)19. LLO jest toksyną tworzącą pory (PFT) wydzielaną przez fakultatywny wewnątrzkomórkowy patogen Listeria monocytogenes20,21,22 i należy do nadrodziny MACPF/CDC (kompleks ataku błonowego, perforyna i cytolizyna zależna od cholesterolu). MACPF to białka tworzące pory ssaków zaangażowane w obronę immunologiczną, podczas gdy CDC to toksyny bakteryjne wytwarzane głównie przez patogeny Gram-dodatnie, które uszkadzają komórki gospodarza, promując ich patogenny styl życia23. CDC są syntetyzowane jako rozpuszczalne w wodzie monomery lub dimery, które wiążą się z cholesterolem obecnym w błonie komórkowej i oligomeryzują się w kompleks preporowy do 50 podjednostek. Kompleks prepore następnie przestawia się, aby wprowadzić β-nici w poprzek dwuwarstwy lipidowej, tworząc β-beczkowy por o średnicy 30-50 nm24,25,26,27. Te duże pory umożliwiają strumienie jonów i małych składników komórkowych do i z komórki; Jednak niektóre badania sugerują, że powstają również pory o mniejszych rozmiarach28,29,30. Wśród CDC LLO wykazuje unikalne właściwości, w tym nieodwracalną agregację zależną od pH i temperatury, co sprzyja analizom o wysokiej przepustowości31,32. LLO można dodać do pożywki do hodowli komórkowej w temperaturze 4 °C, która pozwala na jego wiązanie z komórkami, ale nie na tworzenie kompleksu porów. Inicjacja tworzenia porów może być następnie zsynchronizowana poprzez podniesienie temperatury do 37 °C, co pozwala na efektywną dyfuzję cząsteczek toksyn w płaszczyźnie błony w celu utworzenia oligomerów i przebudowę konformacyjną zaangażowaną w tworzenie porów. Dlatego po zmianie temperatury kinetyka uszkodzenia komórek będzie zależeć od ilości toksyny związanej z błoną plazmatyczną. Co ważne, rozpuszczalny LLO (niezwiązany z błoną plazmatyczną) szybko i nieodwracalnie agreguje się, gdy temperatura osiągnie 37 °C, co łagodzi konieczność wypłukiwania niezwiązanych cząsteczek toksyny i ogranicza zakres uszkodzeń błony w czasie. Wreszcie, ponieważ LLO wiąże się z cholesterolem i tworzy pory w błonach bogatych w cholesterol, test ten jest podatny na szeroki zakres komórek ssaków. Ważne jest, aby pamiętać, że LLO wpływa na sygnalizację komórkową gospodarza głównie poprzez tworzenie porów, z kilkoma wyjątkami, w których może wystąpić sygnalizacja komórkowa niezależna od porów33,34,35,36,37,38,39. Dlatego nie można wykluczyć, że aktywność sygnalizacyjna LLO może wpływać na proces naprawy błony. 
Ten test bezpośrednio ocenia stopień zranienia komórek, mierząc inkorporację nieprzeznaczonego dla komórki fluorochromu (np. jodku propidyny), który pasywnie wnika do uszkodzonych komórek i staje się wysoce fluorescencyjny, gdy połączy się z kwasami nukleinowymi. W związku z tym fluorochrom może być utrzymywany w pożywce do hodowli komórkowych przez cały czas trwania eksperymentu, co pozwala na analizę zranień komórek w czasie rzeczywistym. Intensywność fluorescencji barwnika wiążącego kwas nukleinowy będzie rosła wraz ze stężeniem toksyny i dla danego stężenia toksyny będzie rosła z czasem, aż uformują się wszystkie pory, a komórki zostaną w pełni naprawione lub do osiągnięcia nasycenia. Napływ zewnątrzkomórkowego Ca2 + przez pory błonowe jest warunkiem sine qua non ponownego uszczelnienia. W związku z tym skuteczność ponownego zamykania można pośrednio udowodnić, porównując zranienie komórek w pożywce hodowlanej zawierającej Ca2+ (warunek dopuszczający naprawę) z nawinięciem w pożywce wolnej od Ca2+ (warunek ograniczający naprawę). Ponieważ intensywność fluorescencji barwnika wiążącego kwas nukleinowy jest wprost proporcjonalna do stężenia komórek w każdym dołku, ważne jest, aby zasiać komórki w tym samym stężeniu we wszystkich studzienkach. Ważne jest również, aby zliczyć komórki w każdym dołku przed i po teście, aby upewnić się, że nie dojdzie do oderwania komórek, ponieważ unoszące się, zagregowane komórki mogą zaciemniać odczyty fluorescencji, co może skomplikować interpretację danych. Aby zliczyć komórki, w tym teście użyto komórek wyrażających histon zlokalizowany jądrowo 2B-GFP (H2B-GFP). Wielomodowe czytniki mikropłytek z kontrolowaną temperaturą łączą szybkie, wysokoprzepustowe pomiary intensywności fluorescencji (przy użyciu płytki 96- lub 384-dołkowej) z obrazowaniem mikroskopowym żywych komórek w temperaturze 37 °C. Te ostatnie mogą być używane do wyliczania liczby komórek i obserwowania ostatecznego tworzenia się odrębnych populacji komórek.
Ostatecznie, ten test daje użytkownikom możliwość poszerzenia swojej wiedzy na temat złożoności mechanizmów naprawy błony poprzez badania przesiewowe w poszukiwaniu cząsteczek gospodarza lub egzogennie dodanych związków, które mogą kontrolować naprawę błony. Poniższy protokół opisuje etapy eksperymentalne mające na celu zmierzenie skuteczności ponownego uszczelniania komórek wystawionych na działanie LLO i ocenę wpływu danego leku lub leczenia komórkowego na skuteczność ponownego uszczelniania.

<table><tbody><tr><td>Wielomodowy czytnik mikropłytek SpectraMax i3x</td><td>Urządzenia molekularne</td> Cytometr obrazujący <td>i3x</td><td></td></tr><tr><td>MiniMax 300</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>5024062</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL2</td><td></td></tr><tr><td>HeLa H2B-GFP</td><td>Millipore</td><td>SCC117</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,25%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli tkanki polistyrenowej Corning z płaskim dnem</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważone sole Hanksa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4891</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ISC BioExpress</td><td>0732-100G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza, HybriMax</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5146-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

W swoim fizjologicznym środowisku, komórki ssaków są często poddawane mechanicznym i biochemicznym obciążeniom, które skutkują uszkodzeniem błony plazmatycznej. W odpowiedzi na te uszkodzenia złożone mechanizmy molekularne szybko ponownie uszczelniają błonę plazmatyczną, aby przywrócić jej funkcję barierową i utrzymać przetrwanie komórek. Pomimo 60 lat badań w tej dziedzinie, nadal brakuje nam dogłębnej wiedzy na temat maszyn do ponownego zamykania komórek. W celu zidentyfikowania składników komórkowych, które kontrolują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej lub leków, które mogą poprawić ponowne uszczelnianie, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków hodowanych na mikropłytkach. Jako system modelowy do uszkodzenia błony komórkowej, komórki są wystawione na działanie bakteryjnej toksyny tworzącej pory listeriolizyny O (LLO), która tworzy duże pory białkowe o średnicy 30-50 nm w błonach zawierających cholesterol. Zastosowanie wielotrybowego czytnika mikropłytek z kontrolowaną temperaturą pozwala na szybkie i czułe pomiary spektrofluorometryczne w połączeniu z obrazowaniem żywych komórek za pomocą mikroskopii jasnego pola i fluorescencji. Analiza kinetyczna intensywności fluorescencji emitowanej przez nieprzepuszczalny dla błony fluorochrom wiążący kwas nukleinowy odzwierciedla zakres zranień i ponownego uszczelnienia błony na poziomie populacji komórek, co pozwala na obliczenie skuteczności ponownego uszczelniania komórek. Obrazowanie mikroskopem fluorescencyjnym pozwala na zliczenie komórek, które konstytutywnie wyrażają fluorescencyjną chimerę białka jądrowego histonu 2B, w każdym dołku mikropłytki, aby uwzględnić potencjalne zmiany w ich liczbie i pozwala na ostateczną identyfikację odrębnych populacji komórek. Ten wysokoprzepustowy test jest potężnym narzędziem, które ma poszerzyć naszą wiedzę na temat mechanizmów naprawy błon poprzez badania przesiewowe w kierunku genów gospodarza lub egzogennie dodanych związków, które kontrolują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej.

Dokładność zliczania komórek: komórki HeLa są często wykorzystywane jako modelowa linia komórkowa ssaków do badania mechanizmów naprawy błony. Podczas oceny naprawy błony na poziomie populacji komórkowej ważne jest wysianie komórek w tym samym stężeniu we wszystkich dołkach w celu prawidłowej interpretacji danych. Równie ważne jest zweryfikowanie w czasie przeprowadzania analizy, czy liczba komórek w dołkach jest równoważna. W analizie tej wprowadzono komórki HeLa konstytutywnie ekspresyj...

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Test ten został opracowany w celu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii błon plazmatycznych i ustalenia, jak skutecznie uszkodzone komórki mogą ponownie uszczelnić błonę plazmatyczną. Technika ta może być wykorzystana do pomiaru skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w wysokiej przepustowości oraz do identyfikacji określonych białek i odpowiadających im szlaków, które pośredniczą w ponownym uszczelnianiu błony plazmatycznej. Zacznij od dodania 20 mililitrów 2,5 razy 10 do piątej komórki HeLa na mililitr zawiesiny pożywki wzrostowej do sterylnej miski na pipety i użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby dokładnie wymieszać komórki.Następnie za pomocą mikropipety wielokanałowej wysiewaj 100 mikrolitrów komórek na studzienkę w trzech egzemplarzach na 96-dołkowej płaskiej, przezroczystej płytce z czarnym polistyrenem poddanym kulturze tkankowej. Należy pamiętać, że jednorodne rozmieszczenie komórek jest kluczem do udanego eksperymentu, ponieważ porównania między wszystkimi warunkami eksperymentalnymi wymagają równoważnej liczby komórek. Po 24 godzinach w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 podgrzej czytnik płytek do 37 stopni Celsjusza i ustaw konfigurację optyczną na monochromator, tryb odczytu na fluorescencję, a typ odczytu na kinetyczny.W ustawieniach długości fali wybierz wzbudzenie dziewięcionanometrowe i pasmo przepustowe emisji 15 nanometrów. W przypadku testów z użyciem jodku propidyny należy ustawić długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio na 535 nanometrów i 617 nanometrów. W polu Typ płyty wybierz 96 dołków dla formatu płyty i wybierz wstępnie ustawioną konfigurację płyty odpowiadającą przezroczystej płycie dolnej o czarnych ściankach.W obszarze odczytu zaznacz dołki, które będą analizowane podczas testu kinetycznego. W obszarze PMT i optyka ustaw liczbę błysków na odczyt na sześć i zaznacz pole odczytu od dołu. W polu Chronometraż wprowadź zero godzin 30 minut i zero sekund w całkowitym czasie trwania 30-minutowego testu kinetycznego i wprowadź zero godzin, pięć minut i zero sekund dla interwału.Potwierdź określone ustawienia w informacjach o ustawieniach i kliknij przycisk OK. Następnie kliknij przeczytaj, aby rozpocząć bieg kinetyczny. Aby ustawić parametry obrazowania w trybie ustawień, ustaw MiniMax dla konfiguracji optycznej, obrazowanie dla trybu odczytu i punkt końcowy dla typu odczytu. W obszarze długości fal wybierz światło przechodzące i odpowiednie pola fluorescencyjne odpowiadające eksperymentalnym długościom fal wzbudzenia i emisji.Ustaw typ płytki i obszar odczytu, jak właśnie pokazano, a w ustawieniu obszaru studni ustaw liczbę miejsc w studni, które mają być obrazowane. W ustawieniach akwizycji obrazu dla GFP ustaw urządzenie tak, aby obrazowało całą studnię z czasem naświetlania 20 milisekund na obraz. W przypadku światła przechodzącego uzyskaj pojedynczy obraz środka każdej studzienki z ośmiomilisekundowym czasem ekspozycji.W przypadku jodku propidyny uzyskaj pojedynczy obraz w środku każdej studzienki z 20-milisekundowym czasem ekspozycji. Następnie potwierdź ustawienia w informacjach o ustawieniach i kliknij OK i przeczytaj, aby rozpocząć obrazowanie. Aby skonfigurować wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji dla warunków permisywnych naprawy, umyj komórki dwa razy 200 mikrolitrami pożywki M1 o temperaturze 37 stopni Celsjusza na studzienkę i dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki M1 o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionej 30 mikromolowym jodkiem propidyny po odrzuceniu drugiego prania.W celu naprawy warunków restrykcyjnych należy przemyć ogniwa jeden raz 200 mikrolitrami pożywki M2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionej pięcioma milimolowymi EGTA na studzienkę, a następnie przemyć je jednym myciem 200 mikrolitrami samej pożywki M2. Po odrzuceniu drugiego prania dodać 100 mikrolitrów świeżej pożywki M2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionej 30 mikromolowym jodkiem propydyny na studzienkę. Następnie zobrazuj płytkę w świetle przechodzącym, GFP i PI, jak właśnie pokazano.Podczas obrazowania płytki umieść 96-dołkową mikropłytkę polipropylenową z okrągłym dnem na lodzie i skonfiguruj płytkę tak, jak pokazano dla poprzedniej płytki. W celu naprawy warunków permisywnych dodać 100 mikrolitrów lodowatego podłoża M1 uzupełnionego 60 mikromolowym jodkiem propidyny na studzienkę, a następnie dodać 100 mikrolitrów lodowatego M1 z lub bez 4X listeriolizyny O na studzienkę. W celu naprawy warunków ograniczających dodaj 100 mikrolitrów lodowatego podłoża M2 uzupełnionego 60 mikromolowym jodkiem propidyny na studzienkę, a następnie dodaj 100 mikrolitrów lodowatego M2 z lub bez 4X listeriolizyny O na studzienkę.Konieczne jest przygotowanie listeriolizyny O w odpowiednim stężeniu doświadczalnym na lodzie na około pięć minut przed rozpoczęciem próby kinetycznej, gdy pierwsza tabliczka znajduje się na lodzie, a druga jest przygotowywana. Po zakończeniu obrazowania pierwszej płytki natychmiast przenieś ją na arkusz folii aluminiowej na lodzie. Po pięciu minutach przenieść 100 mikrolitrów z każdej studzienki drugiej płytki do odpowiedniego dołka w pierwszej schłodzonej płytce, wkładając końcówki pipet poniżej menisku roztworu do każdej studzienki przed wyrzuceniem objętości bez mieszania w celu prawidłowego rozprowadzenia toksyny.Pozwól, aby toksyna związała się z komórkami gospodarza przez jedną minutę i natychmiast przenieś pierwszą płytkę do czytnika płytek w celu przeprowadzenia testu postkinetycznego w trybie spektrofluorometru. Pod koniec testu kinetycznego należy natychmiast uzyskać postkinetyczne obrazowanie obrazu płytki, jak pokazano w przypadku obrazowania przedkinetycznego. Aby określić liczbę komórek na podstawie fluorescencji jądrowej, w oprogramowaniu do liczenia komórek mikropłytki w ustawieniach wybierz ponowną analizę, a w ustawieniach analizy obrazu wybierz dyskretną analizę obiektów przy użyciu 541 jako długości fali do wyszukiwania obiektów.W opcji znajdź obiekty użyj metody wyszukiwania rysowania na obrazach, wybierz jądra i kliknij zastosuj, a następnie kliknij OK i przeczytaj, aby zainicjować algorytm zliczania komórek. Ekspresja GFP nie zakłóca pomiarów intensywności jodku propidyny w obecności lub bez leczenia listeriolizyną O. Ekspresja jodku propydyny może przenikać przez fluorescencję GFP, o czym świadczy wzrost intensywności fluorescencji GFP w komórkach HeLA H2B-GFP w teście obrazowania postkinetycznego w porównaniu z analizą prekinetyczną.Co jednak ważne, to skrzyżowanie nie wpływa na zliczanie komórek, ponieważ wzrost fluorescencji GFP nie ma wpływu na proces segmentacji związany z liczeniem jąder. W przypadku braku listeriolizyny O integralność błony komórkowej pozostaje stała w obecności lub braku wapnia zewnątrzkomórkowego, podczas gdy leczenie listeriolizyną O w obecności pożywki uzupełnionej wapniem powoduje stały wzrost intensywności fluorescencji jodku propidyny. Jednak przy braku wapnia zewnątrzkomórkowego następuje znacznie bardziej gwałtowny wzrost fluorescencji jodku propidyny, co odzwierciedla brak ponownego uszczelniania błony.Alternatywnie, barwnik wiążący kwas nukleinowy karbocyjaniny z fluorescencją w dalekiej czerwieni można zastąpić jodkiem propidyny, aby zminimalizować nakładanie się widma z GFP. Ponadto większy współczynnik wzbudzenia dla barwnika dalekiej czerwieni wykazuje wyższy stosunek sygnału do szumu i lepszą rozdzielczość między warunkami zezwalającymi na naprawę a warunkami ograniczającymi naprawę. Podczas wykonywania tej procedury zaleca się oznaczenie wszystkich probówek na dzień przed eksperymentem, ponieważ przygotuje to Cię do przygotowania całego odczynnika w dniu eksperymentu.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak cytometria obrazowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy toksyna tworząca pory uszkadza wszystkie komórki równomiernie, czy też niektóre komórki są bardziej podatne niż inne. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami zakaźnymi i naprawą błon plazmatycznych do zbadania wpływu wielkości porów na skuteczność naprawy różnych typów komórek.

high-throughput-measurement-plasma-membrane-resealing-efficiency

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Ten film demonstruje test do badania skuteczności uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków. Komórki są wystawione na działanie bakteryjnej toksyny tworzącej pory, która tworzy pory w błonie komórkowej. W obecności zewnątrzkomórkowych jonów wapnia pory powodują napływ wapnia, wywołując zdarzenia ponownego uszczelniania błony. Skuteczność ponownego zamykania ocenia się za pomocą barwnika jodku propydyny wiążącego DNA, który dostaje się do komórek tylko bez ponownie uszczelnionej błony.

Test fluorescencyjny in vitro do pomiaru skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej

Obrazowanie na żywo komórek narażonych na działanie barwnika lipofilowego FM1-43 pozwala na precyzyjne określenie kinetyki, za pomocą której toksyny tworzące pory są usuwane z błony plazmatycznej. Jest to czuły test, który można wykorzystać do oceny wymagań dotyczących Ca2+, sfingomielinazy i innych czynników dotyczących naprawy błony komórkowej.

Test obrazowania na żywo do oceny roliCa2+ i sfingomielinazy w naprawie ran toksyn tworzących pory

Proteoliposomy są używane do badania oczyszczonych kanałów i transporterów odtworzonych w dobrze zdefiniowanym środowisku biochemicznym. Zilustrowano eksperymentalną procedurę pomiaru wypływu, w którym pośredniczą te białka. Opisano etapy przygotowania proteoliposomów, wykonywania zapisów i analizy danych w celu ilościowego określenia właściwości funkcjonalnych odtworzonego białka.

Test wypływu na podstawie proteoliposomów w celu określenia właściwości pojedynczych cząsteczek kanałów i transporterów Cl

Tutaj prezentujemy protokół do określenia orientacji i topologii integralnych białek błonowych w żywych komórkach. Ten prosty protokół opiera się na selektywnej wrażliwości chimer na proteazę między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a GFP.

Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Uwijanie błony komórkowej za pomocą lasera dwufotonowego jest powszechnie stosowaną metodą oceny zdolności do ponownego uszczelniania błony i może być stosowane do wielu typów komórek. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania in vitro na żywo ponownego uszczelniania błony w komórkach pacjenta z dysferlinopatią po dwufotonowej ablacji laserowej.

Test naprawy błony komórkowej przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia analizy ilościowej poziomu asocjacji plazmato-błonowej dla fluorescencyjnie oznakowanego białka związanego obwodowo. Metoda opiera się na obliczeniowej dekompozycji błonowej i cytoplazmatycznej składowej sygnału obserwowanej w komórkach znakowanych markerem fluorescencyjnym błony plazmatycznej.

Oznaczanie partycjonowania błony plazmatycznej dla białek związanych obwodowo

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Ten protokół opisuje metodę badania elektrogenicznych białek błonowych poprzez pomiar zmian potencjału błonowego. Test ten stanowi platformę do funkcjonalnego odczytu wielu kanałów jonowych ulegających endogenicznej ekspresji w liniach komórkowych nabłonka.

Oparty na fluorescencji test potencjału błonowego do wysokoprzepustowego badania funkcjonalnego dwóch endogennych kanałów jonowych w dwóch nabłonkowych liniach komórkowych

Poznaj wysokoprzepustową metodę fluorescencyjną do pomiaru skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w żywych komórkach ssaków. Ta technika umożliwia identyfikację białek i szlaków naprawczych.

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów