Elektroelucja fragmentów DNA

Hi.Today pokażemy Ci, jak wykonuje się elektrolutację w celu oczyszczenia fragmentów DNA, takich jak produkty trawienia i PCR. Do dalszych celów, takich jak klonowanie i sekwencjonowanie, elektrolutacja może być jedną z metod z wyboru. Opierając się na ujemnym ładunku elektrycznym DNA, w polu elektro umieszczana jest wysoka bariera komórkowa, która upuszcza fragmenty i zapobiega ich dalszej migracji.

Metoda ta pozwala na oczyszczanie szerokiego zakresu rozmiarów fragmentów DNA z różnych źródeł ze stosunkowo wysoką skutecznością do 80%Jego niski koszt. To kolejna zaleta elektrotechniki w porównaniu z innymi metodami oczyszczania, takimi jak między innymi kolumny, zestawy żywic. Próbka DNA jest najpierw wizualizowana za pomocą elektroforezy żelowej Aris barwionej bromkiem nudy, w celu wizualizacji i zidentyfikowania pożądanego fragmentu, który ma zostać oczyszczony, należy przeprowadzić elektroforezę.

Fragmenty pod spodem są dobrze oddzielone, niewymiarowe można precyzyjnie określić. Po elektroforezie. Pożądany fragment jest starannie wycinany z żelu za pomocą zupełnie nowej żyletki i uważając, aby obrócić plasterek żelu jak najbliżej interesującego go pasma.

Zabieg ten należy wykonywać przy odpowiedniej ochronie przed promieniowaniem UV i w rękawiczkach. Po napełnieniu elektrolutera odpowiednim buforem do spalania i upewnieniu się, że rozlał się on po powierzchni środkowego płaskowyżu, plasterek żelu umieszcza się wewnątrz jednego z kół jak najbliżej kanału V. Wewnątrz kanału vch nie powinno być żadnych pęcherzyków.

Można tego uniknąć, przepłukując kanał buforem w celu usunięcia uwięzionego powietrza. Następnie 100 mikrolitrów wysokiej bariery solnej dodaje się ostrożnie do kanału V od miejsca bliższego do studni. Komora jest zamknięta, a elektrody podłączone do źródła zasilania, aby rozpocząć elektrolutację przy napięciu od 100 do 120 woltów.

Upływ czasu będzie zależał od rozmiaru fragmentu w przypadku dużych fragmentów do 20 kbs. 50 minut do jednej godziny powinno wystarczyć, a małe fragmenty powinny być monitorowane co 10 minut światłem UV, aby uniknąć dalszego przenikania przez roztwór soli i do końcowego łańcucha buforowego dorosłego osobnika. W tym przypadku przetrawiliśmy 560 nanogramów plazmidu za pomocą enzymów ND one i wejścia w celu uwolnienia 900 zasad na fragment, co odpowiada 84 nanogramom próbki.

W związku z tym, po umieszczeniu plastra żelu w studzience, elektrolutowanie będzie trwało przez 25 minut przy napięciu 100 woltów. Po zakończeniu elektroroztworu i uwięzieniu fragmentów DNA w południowej poduszce w kanale V, z kanału pobiera się 400 mikrolitrów roztworu z dystalnej strony pojemnika i umieszcza się w mikroprobówce o pojemności 1,5 mikrolitra za pomocą cienkiej końcówki przymocowanej do mikrodołu, przystąp do wytrącania alkoholu, dodając dwie objętości zimnego absolutnego etanolu i mieszając wirem. Dodatkowo można dodać dwa do trzech mikrolitrów glikogenu, aby poprawić wydajność klasycznych probówek do odzyskiwania DNA W temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez godzinę lub alternatywnie przechowywać w tej temperaturze przez noc wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza na najwyższych obrotach przez 25 minut.

Ten supernatant cardio i umyć, dodając jeden mililitr zimnego, 70% etanolu Wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza z maksymalną prędkością przez pięć do 10 minut, odrzucić supernatant i pozostawić do wysuszenia w temperaturze pokojowej z probówkami w pozycji odwróconej, smary zużyte w 10 do 15 mikrolitrach wody wolnej od jądra i przystąpić do oznaczania stężenia próbki. W tym przypadku oczyszczoną próbkę ponownie zawieszono w 10 mikrolitrach wody i oznaczono ilościowo w spektrofotometrze o długości fali 260 nanometrów, wykazując stężenie 6,3 nanograma na mikrolitr, co stanowi 75% wydajność. Być może myślisz, że lepiej będzie, jeśli zainwestujesz tylko 10 minut swojego cennego czasu z zestawem.

Jednak pomimo czasu poświęconego na ten proces, będziesz w stanie kontrolować wiele zmiennych, które pozwolą Ci oczyścić szerszy zakres próbek noszących naturalne rozmiary i źródła. Jak można było zauważyć w tym przypadku, zaobserwowano 75% skuteczność równą lub lepszą niż w przypadku większości zestawów do oczyszczania DNA. Dziękujemy, że dołączyłeś do nas dzisiaj.

Mamy nadzieję, że ten protokół okazał się przydatny w Państwa projektach badawczych.