Name: Elektroelucja fragmentów DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Poznaj metodę elektroelucji do oczyszczania fragmentów DNA z wysoką wydajnością do 80%. Ta technika molekularna jest ekonomiczna i skuteczna w porównaniu do komercyjnych zestawów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace w laboratorium dr Bermudez były finansowane przez Conacyt (Grant # 82622). Dziękujemy Gabrielie Gutierrez-Sosa, Eliuthowi Reyes-Martinezowi i Ximenie Rodriguez-Torres za nagranie wideo procedury elektroelucji.

<ol>
	<li>W celu wyboru fragmentów DNA przeznaczonych do oczyszczenia, należy je rozdzielić w żelach agarozowych lub akrylamidowych barwionych bromkiem etydyny za pomocą elektroforezy w buforze 0.5X TBE (Tris-boran, EDTA) przy napięciu 120 V przez 1 godzinę. W tym celu wykorzystano ~ 700 ng plazmidu pProEx-GdMre11S (6000 bp) wcześniej trawionego enzymami NdeI i HindIII, aby wyciąć fragment o długości 900 bp (560 ng plazmidu i 84 ng fragmentu).</li>
	<li>Zbiornik do elektroelucji (Rysunek 1) należy wypełnić buforem 0.5X TBE, rozdzielając go równomiernie po obu stronach środkowego plateau, dbając o to, aby nie rozlał się on na samo plateau.</li>
	<li>Wybrany prążek (lub prążki) należy wyciąć z żelu i umieścić w komorze na próbkę jak najbliżej kanału V (jeden wycinek na każdą komorę). Do każdej komory należy dodać bufor do elektroforezy w ilości wystarczającej do całkowitego przykrycia wycinka żelu.</li>
	<li>Każdy używany kanał V musi zostać przepłukany pipetą Pasteura w celu usunięcia wszelkich uwięzionych pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Następnie do wnętrza kanału V należy ostrożnie dodać 100 µl 10 M octanu NH4 (w celu ułatwienia wizualizacji dodaje się niewielką ilość błękitu bromofenolowego, wystarczającą do zabarwienia roztworu).</li>
	<li>Pokrywę należy zamknąć ostrożnie, aby zapobiec resuspensji poduszki z wysokim stężeniem soli.</li>
	<li>Elektroelucję rozpoczyna się przy napięciu 100 V przez 25 minut.</li>
	<li>Po zakończeniu elektroelucji z kanału V pobiera się 400 µl i przenosi do probówki do mikrocentryfugi w celu wytrącenia z użyciem 2 objętości zimnego etanolu i glikogenu (zalecanego w celu poprawy odzysku DNA) w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę lub przez noc.</li>
	<li>Wirować przez 20 minut, usunąć nadsącz i przemyć 70% etanolem.</li>
	<li>Osuszyć probówkę i określić ilość DNA przy OD 260 nm.</li>
	<li>Uzyskany odzysk wyniósł 75% (odzyskano 63 ng z 84 ng umieszczonych w kanale V).</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="Schemat elektroforezy, plasterek żelu w kanale V, układ anoda-katoda, proces rozdzielania DNA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Schemat elektroelutora. Anoda i katoda są zaznaczone po obu stronach zbiornika; DNA zawarte w plasterku żelu (przedstawionym jako czarny kwadrat) migrować będzie w kierunku katody ze względu na swój ładunek ujemny. Następnie zostanie ono zatrzymane w poduszce solnej (przedstawionej jako odwrócony czarny trójkąt) znajdującej się w kanale V.

<ol><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Czas trwania procesu będzie w dużej mierze zależeć od wielkości fragmentów; zazwyczaj w przypadku fragmentów do 20 kb wystarczy od 50 minut do 1 godziny, natomiast dla małych fragmentów wymagane jest monitorowanie światłem UV co 10 minut, aby zapobiec przedostaniu się fragmentu przez poduszkę solną, a w konsekwencji do anodowej komory buforowej, co zmniejszyłoby odzysk. Ważne jest, aby upewnić się, że przy ustawieniu zasilacza na 100 volt natężenie prądu wynosi co najmniej 10 mAmp. Pasmo DNA można monitorować za pomocą lampy UV, aby wykryć moment, w którym opuszcza ono fragment żelu. Poduszkę solną można również przygotować z 3 M Na acetate.
Niniejsza procedura umożliwia oczyszczanie fragmentów DNA lub RNA o różnych rozmiarach z dobrą wydajnością odzysku (~80%), które mają zostać znakowane radioaktywnie, trawione enzymami restrykcyjnymi, przetwarzane przez enzymy modyfikujące itp.

<table><tbody><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; octan</td><td>JT Baker</td><td>0596</td><td></td></tr><tr><td>agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Biofotometr</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000 020</td><td></td></tr><tr><td>Elektro&amp;#8211;Luter</td><td>IBI</td><td>UEA CAT 46000</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroeluowanie fragmentów dna

Electroeluting DNA Fragments

Oczyszczone fragmenty DNA są wykorzystywane w różnych celach w biologii molekularnej i mogą być przygotowywane za pomocą kilku procedur. Większość z nich wymaga uprzedniej elektroforezy fragmentów DNA w celu oddzielenia interesującego nas pasma. Następnie pasmo to jest wycinane z żelu agarozowego lub akrylamidowego i oczyszczane z wykorzystaniem: wiązania i elucji z cząsteczek szkła lub krzemionki, membran DEAE-celulozowych, „metody kruszenia i moczenia” (crush and soak method), elektroelucji lub bardzo często drogich komercyjnych zestawów do oczyszczania. Zatem wybór metody zależy głównie od dostępności odpowiednich środków w laboratorium. Procedura elektroelucji pozwala na uzyskanie bardzo czystego DNA, które może być wykorzystane w wielu zastosowaniach (sekwencjonowanie, znakowanie radiologiczne, trawienie enzymatyczne, modyfikacja enzymatyczna, klonowanie itp.). Procedura ta polega na umieszczeniu wycinków żelu agarozowego lub akrylamidowego zawierających pasmo DNA w dołkach próbkowych elektroelutera; następnie przyłożenie prądu powoduje opuszczenie przez fragment DNA struktury agarozy i jego uwięzienie w poduszce solnej, skąd jest on później odzyskiwany poprzez precypitację etanolem.

Niniejsza procedura umożliwia oczyszczanie fragmentów DNA z wysoką wydajnością.

Elektroeluowanie fragmentów DNA

Oczyszczone fragmenty DNA są wykorzystywane w różnych celach w biologii molekularnej i mogą być przygotowywane za pomocą kilku procedur. Większość z nich wymaga...

Witajcie. Dzisiaj pokażemy Wam, jak przeprowadza się elektroelucję w celu oczyszczenia fragmentów DNA, takich jak produkty trawienia i PCR. Elektroelucja może być jedną z preferowanych metod w dalszych zastosowaniach, takich jak klonowanie i sekwencjonowanie. Wykorzystując ujemny ładunek elektryczny DNA, w polu elektrycznym umieszcza się wysoką barierę komórkową, co powoduje osadzanie się fragmentów i zapobiega ich dalszej migracji.Ta metoda umożliwia oczyszczanie szerokiego zakresu rozmiarów fragmentów DNA z różnych źródeł z relatywnie wysoką wydajnością do 80%. Niskie koszty stanowią kolejną zaletę elektroeluowania w porównaniu do innych metod oczyszczania, takich jak kolumny czy zestawy z żywicami. Próbka DNA jest najpierw wizualizowana za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym barwionym bromkiem etydium, aby zidentyfikować i zwizualizować pożądany fragment do oczyszczenia, po czym należy przeprowadzić elektroforezę.Jeśli fragmenty są wyraźnie odseparowane, można precyzyjnie określić te o zbyt małym rozmiarze. Po elektroforezie pożądany fragment jest starannie wycinany z żelu za pomocą nowej żyletki, dbając o to, aby wycinek żelu znajdował się jak najbliżej interesującego nas prążka.Procedurę tę należy przeprowadzić przy zapewnieniu odpowiedniej ochrony przed światłem UV oraz w rękawiczkach. Po napełnieniu elektroelutora odpowiednim buforem do elucji i upewnieniu się, że pokrywa on powierzchnię środkowej platformy, plasterek żelu umieszcza się w jednej z komór jak najbliżej kanału V. W kanale V nie powinno znajdować się żadnych pęcherzyków powietrza.Można tego uniknąć, przepłukując kanał buforem w celu usunięcia uwięzionego powietrza. Następnie do kanału V, od strony proksymalnej względem dołka, ostrożnie dodaje się 100 µL bariery wysokosolnej. Komorę zamyka się i podłącza elektrody do źródła zasilania, aby rozpocząć elektroelucję przy napięciu od 100 do 120 V.Czas oczekiwania będzie zależał od wielkości fragmentu; dla dużych fragmentów do 20 kb wystarczająco będzie od 50 minut do godziny, natomiast małe fragmenty należy monitorować co 10 minut za pomocą światła UV, aby uniknąć dalszej elucji przez roztwór solny do końcowego buforu łańcuchowego. W tym przypadku poddano trawieniu 560 nanogramów plazmidu za pomocą enzymów ND1 i Entry w celu uwolnienia fragmentu o długości 900 par zasad, co odpowiada 84 nanogramom próbki.W związku z tym, po umieszczeniu wycinka żelu w dołku, elektroelucja będzie trwać 25 minut przy napięciu 100 V. Po zakończeniu elektroelucji i zatrzymaniu fragmentów DNA w dolnej poduszce w kanale V, z kanału, od strony dystalnej odbiornika, odzyskuje się 400 µL roztworu i przenosi go do mikroprobówki 1,5 µL za pomocą cienkiej końcówki zamocowanej do mikropipety. Następnie przeprowadza się wytrącanie alkoholem poprzez dodanie dwóch objętości zimnego absolutnego etanolu i wymieszanie za pomocą wortexa. Dodatkowo, w celu zwiększenia wydajności odzyskiwania DNA, można dodać 2-3 µL glikogenu. Probówki inkubuje się w temperaturze -20 °C przez jedną godzinę lub alternatywnie przechowuje w tej temperaturze przez noc, a następnie wiruje w temperaturze 4 °C z maksymalną prędkością przez 25 minut.Przezwirowano nadsącz i przemyto pellet, dodając 1 mL zimnego, 70% etanolu. Wirowano w temperaturze 4 °C z maksymalną prędkością przez 5 do 10 minut, po czym odlano nadsącz i pozostawiono do wyschnięcia w temperaturze pokojowej z probówkami w pozycji odwróconej. Następnie pellet resuspendowano w 10 do 15 µL wody wolnej od nukleaz i przystąpiono do oznaczenia stężenia próbki. W tym przypadku oczyszczoną próbkę resuspendowano w 10 µL wody i zmierzono w spektrofotometrze przy długości fali 260 nm, co wykazało stężenie 6,3 ng/µL, co odpowiada wydajności 75%. Można odnieść wrażenie, że korzystniej byłoby poświęcić zaledwie 10 minut cennego czasu na użycie gotowego zestawu.Niemniej jednak, mimo czasu poświęconego na ten proces, będą Państwo w stanie kontrolować wiele zmiennych, co pozwoli na oczyszczenie szerszego zakresu próbek o zróżnicowanych rozmiarach i pochodzeniu. Jak można zauważyć w niniejszym przypadku, odnotowano wydajność na poziomie 75%, co jest wynikiem równym lub lepszym niż w przypadku większości zestawów do oczyszczania DNA. Dziękujemy za dołączenie do nas w dniu dzisiejszym.Mamy nadzieję, że protokół ten okaże się pomocny w Państwa projektach badawczych.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Elektroelucja fragmentów DNA

Czujniki „e-DNA”, czyli bezodczynnikowe biosensory elektrochemiczne, które wykazują wysoką skuteczność nawet podczas bezpośredniej analizy krwi i innych złożonych matryc, zostały zaadaptowane do wykrywania szerokiego zakresu analitów w postaci kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiamy ogólną procedurę wytwarzania i stosowania takich czujników.

Wytwarzanie elektrochemicznych biosensorów DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

Opisano podstawowy protokół rozdzielania fragmentów DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Elektroforeza w żelu agarozowym do rozdziału fragmentów DNA

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

W tym filmie analizujemy rozkład wielkości bezkomórkowego DNA lub fragmentów cfDNA za pomocą automatycznej elektroforezy kapilarnej. Technika ta pomaga uzyskać wgląd w profil fragmentów DNA uwalnianych przez komórki nowotworowe podczas apoptozy.

Zautomatyzowana analiza rozkładu wielkości fragmentów cfDNA oparta na elektroforezie kapilarnej: metoda oparta na mikroprocesorze DNA do badania rozkładu wielkości fragmentów DNA wyizolowanych z płynów biologicznych

Ten film opisuje technikę mikroprzepływowej elektroforezy kapilarnej do rozdzielania amplikonów PCR na podstawie ich wielkości. Ta technika pomaga w wymiarowaniu fragmentów przy użyciu barwników fluorescencyjnych i standardowych markerów wielkości molekularnej.

Mikroprzepływowa elektroforeza kapilarna do wymiarowania fragmentów produktów PCR: technika separacji elektroforetycznej oparta na mikroprocesorach w celu oddzielenia fragmentów DNA na podstawie wielkości

Prezentujemy mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do wykrywania hybrydyzacji DNA. Po funkcjonalizacji sondy ssDNA bada się swoistość, czułość i granicę wykrywalności za pomocą komplementarnych i niekomplementarnych celów ssDNA. Wyniki ilustrują wpływ zdarzeń hybrydyzacji DNA na układ elektrochemiczny, przy granicy wykrywalności wynoszącej 3,8 nM.

Mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji DNA

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing to metoda przygotowania bibliotek sekwencjonowania do analizy metylacji DNA opartej na trawieniu enzymem restrykcyjnym połączonym z konwersją wodorosiarczynu cytozyny. Protokół ten wymaga 50 ng materiału wyjściowego i daje dane o rozdzielczości par zasad w regionach genomowych bogatych w GC.

Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji DNA w rozdzielczości par zasad

Tradycyjne eksperymenty z elektroforezą żelową (SGE) wymagają skomplikowanej aparatury i dużego zużycia chemikaliów. W niniejszej pracy przedstawiono protokół, który opisuje tanią metodę separacji fragmentów DNA w krótkim czasie.

Śledzenie separacji fragmentów DNA w czasie rzeczywistym za pomocą smartfona

Przedstawiono protokół selekcji in vitro i charakterystyki aptamerów DNA wiążących estry kwasu ftalowego specyficznych dla grupy. Uwzględniono również zastosowanie wybranego aptameru w elektrochemicznym czujniku aptasensorycznym.

Wybór aptameru DNA wiążącego estry kwasu ftalowego, charakterystyka i zastosowanie do elektrochemicznego czujnika aptasensora

Tutaj prezentujemy prostą technikę oceny środowiskowej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) poprzez zwiększenie proporcji niskocząsteczkowego DNA zewnątrzkomórkowego. Wcześniejsze leczenie 20%-30% PEG i 1,2 M NaCl pozwala na wykrycie zarówno genomowych, jak i przenoszonych horyzontalnie genów AMR. Protokół nadaje się do procesu bez zestawów z dodatkową optymalizacją.

Ulepszona ekstrakcja DNA o niskiej masie cząsteczkowej ze ścieków w celu kompleksowej oceny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Poznaj metodę elektroelucji do oczyszczania fragmentów DNA z wysoką wydajnością do 80%. Ta technika molekularna jest ekonomiczna i skuteczna w porównaniu do komercyjnych zestawów.

Elektroeluowanie fragmentów DNA

Przeglądaj więcej filmów