Name: Wizualizacja produktów pośrednich replikacji indukowanych promieniowaniem UV w E. coli za pomocą dwuwymiarowej analizy żelu agarozowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji pośrednich struktur DNA podczas replikacji w komórkach E. coli uszkodzonych promieniowaniem UV. Dwuwymiarowa analiza żelu agarozowego pozwala szczegółowo badać mechanizmy naprawy DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace w naszym laboratorium są wspierane przez grant CAREER MCB0551798 z National Science Foundation oraz grant AREA R15GM86839 z NIGMS-NIH.

1. Wzrost i naświetlanie UV.
<ol>
	<li>200 μl świeżej kultury nocnej zawierającej plazmid pBR322, hodowanej w pożywce Davisa1 uzupełnionej o 0,4% glukozy, 0,2% kwasów kasamino i 10 μg/ml tyminy (pożywka DGCthy) oraz 100 μg/ml ampicyliny, poddaje się wirowaniu w celu uzyskania osadu. Osad komórkowy resuspenduje się następnie w 200 μl pożywki DGCthy bez ampicyliny i wykorzystuje do zaszczepienia 20 ml pożywki DGCthy.</li>
	<li>Kultury hoduje się bez selekcji ampicyliną w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37° C do osiągnięcia wartości OD600 równej 0,5 (~ 5 x 108 komórek/ml). Wzrost bez ampicyliny pozwala uniknąć selekcji przeciwko nieprawidłowym lub nieproduktywnym produktom pośrednim replikacji, które mogą powstać w niektórych mutantach. Ponadto, w przypadku wykorzystania światła UV do indukowania uszkodzeń, usunięcie ampicyliny z pożywek jest konieczne, ponieważ silnie absorbuje ona promieniowanie o tych długościach fal i osłania komórki, zmniejszając efektywną dawkę UV.</li>
	<li>Pracując przy żółtym świetle, kulturę przenosi się do szalki Petriego o średnicy 15 cm, umieszczonej na platformie rotacyjnej w celu mieszania. Nasze kultury są umieszczane w określonej odległości od 15-watowej lampy bakteriobójczej, która generuje natężenie ekspozycji wynoszące ~1 J/m2/sec, mierzone za pomocą fotometru UVC. Kultury naświetla się dawką 50 J/m2, a następnie bezzwłocznie przenosi z powrotem do inkubatora z wytrząsaniem w temperaturze 37° C na czas trwania eksperymentu. Dawka ta powoduje powstanie średnio jednego dimeru cyklobutanowego pirymidyn na każde 4,5 kb ssDNA. Żółte oświetlenie zapobiega fotoreaktywacji, czyli odwróceniu dimerów cyklobutanowych pirymidyn przez fotoliazę.</li>
</ol>
2. Izolacja DNA.
<ol>
	<li>W momentach, w których należy zbadać produkty pośrednie replikacji, 0,75 ml alikwot kultury przenosi się do 0,75 ml lodowatego buforu NET30 (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0, 30 mM EDTA) i utrzymuje na lodzie do końca przebiegu czasowego. Zazwyczaj przeprowadzamy przebieg czasowy trwający 90 minut, badając próbki w 0, 15, 30, 45, 60 i 90 minucie. EDTA oraz niska temperatura służą do skutecznego zatrzymania replikacji i naprawy przez wycinanie nukleotydów.</li>
	<li>Każdą próbkę następnie wiąże się w wirówce, resuspensuje w 150 μl lizozymu (1,5 mg/ml) i RNazy A (0,2 mg/ml) w buforze TE (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA) i poddaje lizie w temperaturze 37°C przez 20 min. Następnie dodaje się 10 μl proteinazy K (10 mg/ml) i 10 μl 20% sarkozylu, a inkubację kontynuuje się przez 1 h. Proteinaza K i sarkozyl pomagają uwolnić fragmenty DNA, które mogą być związane z błoną lub białkami przed ekstrakcją fenolem. Ponieważ aktywnie replikowany DNA jest często związany z kompleksami białkowymi lub błonowymi, pomaga to zwiększyć wydajność odzyskiwanych fragmentów replikacyjnych.</li>
	<li>Próbki ekstrahuje się poprzez dodanie 2 objętości fenolu do każdej próbki, a probówki delikatnie odwraca się przez 5 minut. Następnie dodaje się 2 objętości chloroformu/alkoholu izoamylowego (24/1) i ponownie delikatnie odwraca probówki przez 5 minut.</li>
	<li>Próbki wiruje się w mikrowirówce przy 14 000 rpm przez 5 minut, a górną fazę wodną z każdej próbki pobiera się i przenosi do nowej probówki. Następnie dodaje się 4 objętości chloroformu/alkoholu izoamylowego (24/1), delikatnie odwraca probówki przez 5 minut i ponownie wiruje przy 14 000 rpm przez 5 minut.</li>
	<li>Górna faza wodna każdej próbki jest następnie dializowana przez 1 godzinę poprzez naniesienie 100 μl każdej próbki na dysk Whatman 47 mm o rozmiarze porów 0,025 μm, który pływa na 250 ml 0,1X TE w zlewce. Ponieważ struktury replikacyjne z regionami jednoniciowymi lub punktami rozgałęzień są bardziej podatne na ścinanie, zazwyczaj odcinamy końcówki pipet żyletką, aby poszerzyć wlot i zminimalizować siły ścinające. Generalnie należy ograniczyć pipetowanie do minimum aż do momentu trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi.</li>
	<li>Każdą próbkę trawi się następnie enzymem PvuII (New England Biolabs), który linearyzuje plazmid tuż za miejscem inicjacji replikacji.</li>
	<li>Przed naniesieniem na żel agarozowy do każdej próbki dodaje się 100 μl chloroformu i 20 μl 6X barwnika do nakładania zawierającego błękit bromofenolowy i ksylen cyjanol, a następnie miesza. Następnie do żelu nanosi się 40 μl fazy wodnej z barwnikiem. Aby zminimalizować błędy strukturalne, artefakty strukturalne oraz ścinanie DNA, niniejsza procedura izolacji nie obejmuje żadnych kroków mających na celu wzbogacanie w regiony jednoniciowe, wytrącanie lub zagęszczanie próbek DNA po lizie komórek.</li>
</ol>
3. Analiza Southern i elektroforeza w żelu 2D.
<ol>
	<li>Analiza w 2-wymiarowym żelu agarozowym jest zmodyfikowaną wersją procedury 3. W 1. WYMIARZE próbki DNA poddane restrykcji są rozdzielane w żelu agarozowym 0,4% w 1X TBE przy napięciu 1V/cm. Jeden litr roztworu stokowego 10X TBE zawiera:
 <ul>
		<li>108 g Tris Base</li>
		<li>55 g kwasu borowego</li>
		<li>40 ml 0,5M EDTA (pH 8,0)</li>
 </ul>
</li>
	<li>W pierwszej ścieżce nanosi się marker wielkości lambda Hind III, a następnie próbki nanosi się w co drugiej ścieżce. Pierwszy wymiar prowadzimy zazwyczaj przez ~12-15 h. Pominięcie ścieżek ułatwia wycinanie pasm w celu odlania ich w drugim wymiarze. Niskie napięcie i niskie stężenie agarozy w żelu służą przede wszystkim do rozdzielenia fragmentów DNA na podstawie wielkości.</li>
	<li>W drugim wymiarze ścieżki żelowe są wycinane z żelu pierwszego wymiaru przy użyciu dużego noża rzeźnickiego. Pierwszą ścieżkę zawierającą marker lambda Hind III można barwić bromkiem etydyny. Używając markera lambda Hind III jako punktu odniesienia, wycina się i odrzuca fragment żelu znajdujący się poniżej miejsca, w którym spodziewamy się przejścia zlinearyzowanego plazmidu. W tych warunkach stwierdzamy, że zlinearyzowany pBR322 wędruje nieco powyżej barwnika xylene cyanol.</li>
	<li>Aby odlać drugi wymiar, każdą ścieżkę kładzie się poziomo na górze pustej formy do żelu. Przygotowuje się roztwór 1,0% agarozy w 1X TBE i schładza go do 55°C. Następnie wlewa się roztwór żelu, aby odlać drugi wymiar, dbając o całkowite przykrycie wycinków żelu. Po zastygnięciu żelu prowadzi się elektroforezę przy 6,5V/cm w urządzeniu do elektroforezy umożliwiającym recyrkulację buforu. Drugi wymiar prowadzimy zazwyczaj przez ~5,5-7 h. Wysokie napięcie i wysokie stężenie agarozy w żelu skutecznie rozdzielają fragmenty DNA na podstawie ich kształtu oraz wielkości. Formy nieliniowe wędrują wolniej w drugim wymiarze.</li>
	<li>Po elektroforezie żel płucze się w H2O, dwukrotnie przemywa w 400 ml 0,25M kwasu solnego przez 15 minut, płucze w H2O, a następnie dwukrotnie przemywa w 400 ml 0,4M NaOH przez 30 minut. Przemywanie kwasem służy do częściowego wprowadzenia nacięć (nicking) w cząsteczkach DNA, co rozbija je na mniejsze fragmenty, które przenoszą się wydajniej. Krok ten jest niezbędny ze względu na dużą wielkość i nietypowe kształty produktów pośrednich replikacji DNA.</li>
	<li>DNA z żeli jest następnie przenoszone na membranę nylonową Hybond N+ 4. Stosujemy system transferu alkalicznego w kierunku w dół z użyciem 0,4M NaOH. W skrócie, dwa arkusze papieru do blotingu nasączone 0,4M NaOH kładzie się na dużym stosie ręczników papierowych. Membrana nylonowa jest również nasączona 0,4M NaOH i kładzie się ją na papierze do blotingu. Następnie ostrożnie nakłada się na to żel, a na wierzch kolejny kawałek papieru do blotingu zwilżonego w roztworze NaOH. Na koniec na górze układa się długi pas zwilżonego papieru do blotingu, a jego dwa końce umieszcza się w naczyniach zawierających 1 L roztworu 0,4M NaOH, aby pełniły funkcję knota. Transfer DNA trwa zazwyczaj od 6 do 12 h.</li>
	<li>Membranę nylonową wyjmuje się, płucze przez 20-30 s w buforze 5X SSC i umieszcza w obrotowej butelce do hybrydyzacji zawierającej 10,5 ml roztworu do prehybrydyzacji. Następnie membranę inkubuje się w 42°C przy obrotach przez ponad 6 h. Roztwór do prehybrydyzacji:
	<ul>
		<li>5,0 ml formamidu</li>
		<li>0,5 ml 20% SDS</li>
		<li>2,5 ml 20X SSC*</li>
		<li>2,0 ml 50X Denhardt's*</li>
		<li>0,5 ml DNA z plemników łososia (10mg/ml) *przepisy na SSC i Denhardt's znajdują się w 5</li>
 </ul>
 </li>
	<li>Podczas okresu prehybrydyzacji 1 μg plazmidu pBR322 jest znakowany 32P metodą translacji nacięć (nick translation) zgodnie z protokołem dostarczonym przez Roche, przy użyciu alfa-znakowanego [32-P]-dCTP. Radioznakowaną sondę (100μl) denaturuje się poprzez inkubację w 98°C przez 10 minut w probówce do mikrocentryfugi z zakrętką, a następnie natychmiast umieszcza na lodzie.</li>
	<li>Zdenaturowaną sondę dodaje się do 5,9 ml roztworu do hybrydyzacji, który zawiera:
 	<ul>
		<li>3,0 ml formamidu</li>
		<li>1,5 ml SSC</li>
		<li>1,0 ml H2O</li>
		<li>0,15 ml 50X Denhardt's</li> 
		<li>0,10 ml 20% SDS</li>
		<li>0,15 ml 10mg/ml DNA z plemników łososia</li>
	</ul>
</li>
	<li>Roztwór do prehybrydyzacji wylewa się z butelki obrotowej i wlewa roztwór do hybrydyzacji. Butelkę obrotową umieszcza się ponownie w inkubatorze w 42°C i obraca przez ponad 12 h.</li>
	<li>Roztwór do hybrydyzacji wylewa się z butelki obrotowej. Następnie blot przemywa się 4 razy po 20 minut w butelce obrotowej z ~150 ml roztworu piorącego zawierającego 0,5X SSC i 0,1% SDS w 42°C przy obrotach.</li>
	<li>Po ostatnim przemywaniu membranę kładzie się na ręczniku papierowym, aż płyn widocznie zniknie. Następnie membranę owija się folią z polichlorku winylu i eksponuje na ekran phosphorimager. Radioaktywność wizualizujemy i kwantyfikujemy przy użyciu urządzenia Storm 840 oraz powiązanego z nim oprogramowania ImageQuant.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2220/2220fig1.jpg" alt="Schemat procesu naprawy uszkodzeń DNA z produktami pośrednimi indukowanymi przez UV; przedstawiono efekty napromieniowania UV." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Produkty pośrednie replikacji plazmidu obserwowane w obecności i przy braku uszkodzeń DNA indukowanych przez UV. Przedstawiono schemat wzoru migracji plazmidu pBR322 trawionego enzymem PvuII, obserwowanego w analizie w 2D-żelu agarozowym. Niereplikujące się plazmidy liniowe wędrują jako liniowy fragment 4.4-kb. Replikujące się plazmidy tworzą struktury w kształcie litery Y, które migrują wolniej niż fragmenty niereplikujące się ze względu na większy rozmiar i nieliniowy kształt. Ten wzór migracji tworzy łuk rozciągający się od obszaru liniowego w stronę dołka. Po napromieniowaniu UV w obszarze stożka obserwuje się cząsteczki w kształcie podwójnego Y lub litery X, które migrują wolniej niż łuk cząsteczek w kształcie Y. Przedstawiono przykład analizy Southern żelu 2D z użyciem sondy pBR322 znakowanej 32P dla komórek bezpośrednio po napromieniowaniu UV oraz 15 minut po napromieniowaniu UV (reprodukowano za zgodą wydawcy).

<ol><li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li>
<li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li>
<li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li>
<li>Spivak, G., Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+damage+and+repair+in+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22METHODS%3A+A+Companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of damage and repair in specific DNA sequences.</a> METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning+-+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning - A laboratory manual</a>. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li>
<li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork%3A+a+comparison+to+UV-induced+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecBCD+and+RecJ%2FRecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li>
<li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Typowe wyniki uzyskane z komórek typu dzikiego w obecności i przy braku uszkodzeń indukowanych promieniowaniem UV przedstawiono na Rysunku 1. W przypadku braku uszkodzeń, około 1% całkowitej ilości plazmidowego DNA znajduje się w łuku Y, gdy komórki szybko rosną w fazie wykładniczej. Po naświetlaniu obserwuje się przejściowy wzrost liczby cząsteczek w kształcie Y, co wynika z gromadzenia się zablokowanych widełek replikacyjnych w miejscach uszkodzeń. Intermediaty replikacyjne w kształcie X również gromadzą się przejściow...

<table><tbody><tr><td>Przykład analizy Southern żelu 2D po hybrydyzacji</td><td>GE Healthcare</td><td>G15T8</td><td>Yellow Lighting</td></tr><tr><td>Lampa bakteriobójcza 15 &amp;mu;W</td><td>Sylvania</td><td>F20T12/GO</td><td>Lampa UV</td></tr><tr><td>Miernik natężenia UV Blak-Ray 254nm</td><td>Daigger</td><td>EF28195T</td><td>Fotometr UVC</td></tr><tr><td>Dyski porowe 0,025 &amp;mu;m</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>VSWP04700</td><td>Pływające dyski dializacyjne</td></tr><tr><td>PvuII</td><td>Fermentas</td><td>ER0632</td><td>Restrykcyjna endonukleaza</td></tr><tr><td>Zestaw do translacji nacięć (Nick-translation kit)</td><td>Roche Group</td><td>976776</td><td>Do przygotowania sondy znakowanej 32P</td></tr><tr><td>Papier do transferu</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-704</td><td>Do transferu Southern</td></tr><tr><td>Membrana nylonowa</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203S</td><td>Do transferu Southern</td></tr></tbody></table>

wizualizacja indukowanych promieniami uv produktów pośrednich replikacji w e. coli przy użyciu dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Nieprawidłowa replikacja w obecności uszkodzeń DNA odpowiada za większość przemieszczeń komórkowych i mutagenezę obserwowaną we wszystkich typach komórek i powszechnie uważa się, że jest ona bezpośrednio związana z rozwojem nowotworów u ludzi. Uszkodzenia DNA, takie jak te wywołane promieniowaniem UV, poważnie upośledzają zdolność replikacji do dokładnego powielania matrycy genomowej. Zidentyfikowano szereg produktów genów, które są niezbędne w sytuacjach, gdy podczas replikacji napotkane zostają uszkodzenia DNA w matrycy. Jednakże wyzwaniem pozostaje ustalenie, w jaki sposób białka te przetwarzają te uszkodzenia w trakcie replikacji.in vivoWykorzystując *Escherichia coli* jako układ modelowy, opisujemy procedurę, w której dwuwymiarowa analiza w żelu agarozowym może zostać zastosowana do identyfikacji produktów pośrednich strukturalnych powstających na replikujących się plazmidachin vivopo uszkodzeniu DNA indukowanym promieniowaniem UV. Procedura ta została wykorzystana do wykazania, że widły replikacyjne zablokowane przez uszkodzenia wywołane promieniowaniem UV ulegają przejściowemu odwróceniu, które jest stabilizowane przez białko RecA oraz kilka produktów genów związanych ze ścieżką RecF. Technika ta dowodzi, że te produkty pośrednie replikacji są utrzymywane do czasu korelującego z usunięciem uszkodzeń poprzez naprawę przez wycinanie nukleotydów, po czym replikacja zostaje wznowiona.

Przedstawiamy procedurę, w której dwuwymiarowa analiza w żelu agarozowym może zostać wykorzystana do identyfikacji struktury produktów pośrednich replikacji powstających po napromieniowaniu UV.

Wizualizacja indukowanych promieniami UV produktów pośrednich replikacji w E. coli przy użyciu dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym

Nieprawidłowa replikacja w obecności uszkodzeń DNA odpowiada za większość rearanżacji komórkowych i mutagenezy obserwowanej we wszystkich typach komórek ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja pośrednich struktur DNA powstających podczas napotkania przez replikację uszkodzeń DNA, z wykorzystaniem dwuwymiarowej analizy żelowej. Osiąga się to poprzez wstępną izolację DNA z aktywnie dzielących się komórek, w których wyindukowano uszkodzenia blokujące replikację. Następnie wykorzystuje się elektroforezę żelową do rozdzielenia odzyskanego DNA na podstawie jego wielkości.Następnie ścieżki są wycinane i odlewane poziomo w drugim żelu, który dodatkowo rozdziela DNA w zależności od jego rozmiaru i kształtu. Na koniec stosuje się analizę southern, aby zwizualizować struktury DNA powiązane z replikującymi się fragmentami DNA w czasie przed oraz w różnych odstępach czasu po wprowadzeniu uszkodzeń indukowanych promieniami UV. Ostatecznie procedura ta może służyć do wykazania, że brak możliwości naprawy uszkodzeń DNA u niektórych mutantów prowadzi do akumulacji produktów pośrednich naprawy DNA.Cześć, nazywam się Arthur Ian. Pochodzę z laboratorium Corella na Portland State University. Cześć, nazywam się Brand she, ja również pochodzę z laboratorium Corella.Dzisiaj przedstawimy procedurę dwuwymiarowej elektroforezy żelowej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania produktów pośrednich replikacji i naprawy DNA. Zacznijmy zatem.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 200 µL nocnej hodowli e coli zawierającej plazmid PBR 3 22 w pożywce DGC thigh z ampicyliną w temperaturze 37 °C. Zastosowanie pożywki DGC thigh minimalizuje ekranowanie UV. Po nocnej inkubacji komórki należy odwirCować przy 14 000 RPM przez 30 sekund.Następnie osad komórkowy resuspenduj w 200 µL medium DG C bez ampicyliny i zaszczep. Hodowle w 20 mL medium DG C prowadź bez selekcji ampicyliną w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C do osiągnięcia OD 600 równej 0,5, co odpowiada około 5 × 10⁸ komórkom na ml. Hodowla bez ampicyliny pozwala uniknąć selekcji przeciwko nieprawidłowym lub nieproduktywnym produktom pośrednim replikacji, które mogą pojawić się u niektórych mutantów.Dodatkowo, w przypadku stosowania światła UV do indukowania uszkodzeń, konieczne jest usunięcie ampicyliny z pożywki, ponieważ silnie pochłania ona promieniowanie o tych długościach fal i tworzy osłonę. Komórki redukują efektywną dawkę UV podczas wzrostu. Należy użyć fotometru UVC, aby wyznaczyć odległość od lampy bakteriobójczej o mocy 15 watów, która zapewnia natężenie ekspozycji wynoszące około jednego JUUL na metr kwadratowy na sekundę.Kolejne kroki należy przeprowadzić w świetle żółtym, aby zapobiec fotoreaktywacyjnej odwracalności dimerów cyklobutanowych peryden przez fotoliazę po naświetlaniu UV. Po osiągnięciu pożądanej gęstości komórek, za pomocą pipety przenieść kulturę do szalki Petriego o średnicy 15 cm umieszczonej na platformie obrotowej, aby zapewnić równomierne naświetlenie całej populacji komórek. Następnie naświetlić kultury dawką 50 J/m² i natychmiast przenieść je do sterylnej, uprzednio ogrzanej kolby, a następnie umieścić z powrotem w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 37 °C.Przez cały czas trwania eksperymentu dawka ta powoduje powstanie średnio jednego dimeru cyklobutanowego co 4,5 kilobazy jednoniciowego DNA dla każdego badanego punktu czasowego. Przenieś pipetą 0,75 mililitra alikwotu hodowli do 0,75 mililitra schłodzonego w lodzie buforu net 30. Bufor net 30 służy jako bufor zatrzymujący, który zapobiega zachodzeniu replikacji oraz naprawy przez wycinanie nukleotydów.Po dodaniu buforu zatrzymującego próbkę można przechowywać w lodzie do końca przebiegu czasowego. Po zakończeniu przebiegu czasowego należy odwirować każdą próbkę i resuspender osady. W 150 µL buforu do lizy należy przeprowadzić lizę komórek w temperaturze 37 °C przez 20 minut bez mieszania.Ponieważ replikowane struktury z regionami jednoniciowymi lub punktami rozgałęzień są bardziej podatne na ścinanie, należy odciąć końcówki pipet żyletką, aby poszerzyć ich otwór i zminimalizować siły ścinające. Generalnie należy ograniczyć pipetowanie i mieszanie do minimum, aż do momentu trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi; po lizie należy dodać proteinazę K i SDS, a następnie kontynuować inkubację przez jedną godzinę. Służy to uwolnieniu fragmentów DNA związanych z białkami.Ponieważ aktywnie replikowane DNA często jest związane z kompleksami białkowymi lub błonowymi, pomaga to zwiększyć wydajność uzyskiwania fragmentów replikacyjnych. Po jednej godzinie wyodrębnij próbki, dodając do każdej z nich dwie objętości fenolu i delikatnie odwracając probówki przez pięć minut. Następnie dodaj dwie objętości chloroformu i alkoholu izoamylowego, a następnie delikatnie odwracaj probówki przez kolejne pięć minut.Następnie odwiruj próbki w mikrocentryfudze przy 14 000 RPM przez pięć minut i przenieś górną fazę wodną z każdej próbki do nowej probówki. Następnie dodaj cztery objętości izopropanolu z chloroformem i ponownie delikatnie odwracaj probówki przez pięć minut. Ponownie odwiruj próbki przy 14 000 RPM przez pięć minut.Umieść membranę dializacyjną na 250 mililitrach 0.1 xte w zlewce i nanieś 100 mikrolitrów każdej próbki na membranę. Pozostaw próbki do dializy na jedną godzinę po rozpoczęciu procesu. Przenieś 80 mikrolitrów każdej próbki do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 20 mikrolitrów mieszaniny enzymatycznej.Próbki inkubować w celu trawienia przez noc w temperaturze 37 °C. Enzym PV two linearyzuje plazmid bezpośrednio za miejscem początku replikacji. Przed nałożeniem na żel agarozowy dodać 100 µL chloroformu oraz 20 µL 6x barwnika do nakładania próbek zawierającego bromofenol błękitny.Dodaj błękit fenolowy i cyjan ksylenowy do każdej próbki i wymieszaj; chloroform usunie wszelki pozostały PV two związany z końcami DNA. Rozpocznij dwuwymiarową analizę żelu agarozowego, przeprowadzając próbki z trawionym DNA przez pierwszy wymiar. Najpierw nałóż marker wielkości Lambda hind three do pierwszej studni wcześniej przygotowanego żelu agarozowego 0,4% w 1XTBE.Następnie nanieś 40 µL fazy wodnej zawierającej barwnik do nakładania dla każdej próbki, pomijając niektóre ścieżki, aby ułatwić późniejsze wycinanie żelu. Po elektroforezie przeprowadź pierwszy wymiar przy napięciu 1 V/cm przez około 12 do 15 godzin. Niskie napięcie oraz żel AGROS o niskim stężeniu procentowym służą do rozdzielania fragmentów DNA głównie na podstawie ich wielkości.Po zakończeniu elektroforezy w pierwszym wymiarze, za pomocą dużego noża kuchennego wytnij pierwszą ścieżkę zawierającą marker Lambda Hind III i przeprowadź barwienie bromkiem etydinium. W celu przygotowania drugiego wymiaru, wytnij ścieżki żelu dużym nożem kuchennym, posługując się markerem Lambda Hind III jako wzorcem, a następnie odetnij i odrzuć obszar poniżej miejsca, w którym w każdej ścieżce spodziewany jest prążek zlinearyzowanego plazmidu. Aby odlać żel do drugiego wymiaru, umieść każdy wycinek poziomo na górnej krawędzi pustej formy do żelu.Przygotować roztwór 1% AROS w buforze XTBE i schłodzić go do 55 stopni Celsjusza. Po schłodzeniu wlać roztwór żelu, aby odlać drugi wymiar, upewniając się, że plasterki żelu są całkowicie przykryte. Przed wlewaniem żelu należy upewnić się, że plasterki są równomiernie zorientowane, a kasetka do odlewania znajduje się w poziomie.Po zestaleniu się żelu przeprowadź elektroforezę w drugim wymiarze przez pięć i pół do siedmiu godzin przy napięciu 6,5 V/cm w aparacie elektroforetycznym z recyrkulacją buforu. Wysokie napięcie oraz wysoki procentowy stężenie żelu Agros skutecznie rozdzielają fragmenty DNA w zależności od ich kształtu oraz wielkości. Fragmenty o nieliniowym kształcie przemieszczają się wolniej w drugim wymiarze podczas elektroforezy. Przepłucz żel raz w wodzie, a następnie przemyj go dwukrotnie w 400 ml 0,25 M kwasu solnego przez 15 minut przy łagodnym wytrząsaniu.Płukanie kwasem służy do częściowego nacinania cząsteczek DNA na mniejsze fragmenty, które przenoszą się wydajniej podczas analizy Southern; jest to konieczne ze względu na duży rozmiar i nietypowy kształt produktów pośrednich replikacji DNA. Aby przygotować żel do transferu alkalicznego, ponownie wypłucz żel w wodzie, a następnie przemyj go dwukrotnie w 400 mililitrach 0,4 molarnego wodorotlenku sodu przez 30 minut. Następnie DNA z żeli przenosi się na membranę nylonową high bond n plus, stosując system transferu alkalicznego w dół z użyciem 0,4 molarnego wodorotlenku sodu, zgodnie z opisem w pisemnej części tej procedury; proces transferu DNA powinien trwać od 6 do 12 godzin. Po zakończeniu transferu DNA należy przejść do hybrydyzacji z sondą, zgodnie z opisem w protokole pisemnym.Po przeprowadzeniu inkubacji z przeciwciałami i przemyciu błony, należy położyć ją na ręczniku papierowym, aż ciecz widocznie odparuje. Następnie błonę należy zawinąć w folię z polichlorku winylu i naświetlić na ekranie fosforyzatora. Na koniec radioaktywność można wizualizować i kwantyfikować przy użyciu systemu Storm 840 oraz powiązanego oprogramowania ImageQuant.Przedstawiono schemat wzoru migracji dwóch trawionych plazmidów PBR 3 22 obserwowanego podczas analizy żelowej 2D. Niereplikujące się plazmidy liniowe migrują jako liniowe fragmenty 4.4 KB, natomiast plazmidy replikujące tworzą struktury w kształcie litery Y, które migrują wolniej niż fragmenty niereplikujące ze względu na większy rozmiar i nieliniowy kształt. Wzór migracji ten tworzy łuk wybiegający z obszaru liniowego w stronę studzienki po napromieniowaniu UV.Cząsteczki w kształcie podwójnego Y lub X są obserwowane w obszarze stożka i migrują wolniej niż łuk cząsteczek w kształcie Y. Przykład analizy południowej żelu 2D sondowanego P 32 znakowanym PBR 3 22 przedstawiono dla komórek bezpośrednio po napromieniowaniu UV oraz 15 minut po napromieniowaniu UV bezpośrednio po napromieniowaniu UV. Około 1% całkowitego plazmidowego DNA można znaleźć w łuku Y, gdy komórki szybko rosną w fazie wykładniczej po napromieniowaniu.Przejściowy wzrost liczby cząsteczek w kształcie litery Y obserwuje się w momencie gromadzenia się zablokowanych widełek replikacyjnych w miejscach uszkodzeń. Intermediaty replikacyjne w kształcie litery L również gromadzą się przejściowo i utrzymują do czasu skorelowanego z naprawą uszkodzeń. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób wizualizacji intermediatów naprawy DNA z wykorzystaniem dwuwymiarowej elektroforezy w żelu.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby mieć na uwadze siły ścinające, które mogą obniżyć wydajność, oraz zachować ostrożność w obchodzeniu się ze wszystkimi próbkami i żelami. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

visualization-uv-induced-replication-intermediates-e-coli-using-two

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizacja intermediatów replikacji wywołanych promieniowaniem UV w E. coli z wykorzystaniem dwuwymiarowej analizy żelu agarozowego

Niniejszy protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek służącą do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replisomy w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

DT40, modelowy system genetyczny kręgowców, stanowi potężne narzędzie do analizy funkcji białek. Opisujemy tutaj prostą metodę umożliwiającą jakościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA podczas fazy S w komórkach DT40 na poziomie pojedynczych cząsteczek.

Wizualizacja replikacji DNA w kręgowym systemie modelowym DT40 z wykorzystaniem techniki włókien DNA

Źródło: Cayron, J. i Lesterlin, C. Wieloskalowa analiza wzrostu bakterii w warunkach leczenia stresem. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę oceny filamentacji E. coli i replikacji DNA w przypadku antybiotykoterapii hamującej podziały komórek przy użyciu posiewu do pomiaru żywotności i cytometrii przepływowej do analizy wielkości komórki i zawartości DNA.

Ocena filamentacji indukowanej antybiotykiem w E. coli za pomocą testu posiewu i cytometrii przepływowej

Źródło: Mettrick, K. A., Lawrence i in., Indukowanie specyficznej blokady replikacji w E. coli przy użyciu systemu operatora tłumiącego fluorescencyjne. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje specyficzną blokadę replikacyjnej widełki w Escherichia coli z wykorzystaniem arabinozowej ekspresji żółtego, fluorescencyjnego białkowego TetR, który wiąże chromosomalne matryce TetO.

Fluorescencyjnie oznakowana blokada replikacji pośredniczona przez białko represyjne w Escherichia coli

Źródło: Bratton, B. P. i in., Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych dla dokładnych reprezentacji komórkowych i precyzyjnej lokalizacji białek. J. Vis. Exp. (2019)Ten film pokazuje metodę pozyskiwania i analizowania trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych komórek bakteryjnych w celu badania organizacji białek na poziomie pojedynczych komórek.

Wizualizacja rozkładu białek bakteryjnych w trzech wymiarach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Opisujemy tutaj system wykorzystujący specyficzny dla miejsca, odwracalny blok białkowy in vivo do zatrzymywania i zwijania widełek replikacyjnych u Escherichia coli. Ustanowienie bloku replikacji ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a do wizualizacji produktów pośrednich replikacji stosuje się neutralno-neutralną 2-wymiarową elektroforezę w żelu agarozowym.

Indukowanie specyficznej dla miejsca blokady replikacji u E. coli przy użyciu systemu operatora represora fluorescencyjnego

Tutaj przedstawiamy procedurę analizy przebiegu replikacji poprzez patogenne, podatne na struktury powtórzenia za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej.

Analiza elektroforetyczna replikacji przez podatne na strukturę powtórzenia DNA w ludzkim episomie opartym na SV40

Poznaj metodę wizualizacji pośrednich struktur DNA podczas replikacji w komórkach E. coli uszkodzonych promieniowaniem UV. Dwuwymiarowa analiza żelu agarozowego pozwala szczegółowo badać mechanizmy naprawy DNA.

Wizualizacja produktów pośrednich replikacji indukowanych promieniowaniem UV w E. coli za pomocą dwuwymiarowej analizy żelu agarozowego (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja indukowanych promieniami UV produktów pośrednich replikacji w E. coli przy użyciu dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym

Przeglądaj więcej filmów