Wizualizacja produktów pośrednich replikacji indukowanych promieniowaniem UV w E. coli za pomocą dwuwymiarowej analizy żelu agarozowego

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja strukturalnych produktów pośrednich DNA, które występują, gdy replikacja napotyka zmiany w DNA za pomocą dwuwymiarowej analizy żelowej. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie DNA z aktywnie dzielących się komórek, w których indukowano zmiany blokujące replikację. Następnie stosuje się elektroforezę żelową do oddzielenia odzyskanego DNA na podstawie wielkości.

Następnie pasy są wycinane i ponownie odlewane poziomo w drugim żelu, który dodatkowo rozdziela DNA zarówno na podstawie rozmiaru, jak i kształtu. Wreszcie, analiza południowa służy do wizualizacji struktur DNA, które są związane z replikacją fragmentów DNA w czasie przed i w różnym czasie po wprowadzeniu uszkodzeń wywołanych promieniowaniem UV. Ostatecznie procedura ta może być wykorzystana do wykazania, że niezdolność do przetwarzania zmian DNA w niektórych mutantach powoduje akumulację produktów pośrednich naprawy DNA.

Cześć, nazywam się Arthur Ian. Pochodzę z Corella Lab na Uniwersytecie Stanowym w Portland. Cześć, nazywam się Brand she, też jestem z Corella Lab.

Dzisiaj pokażemy Wam procedurę dwuwymiarowej elektroforezy żelowej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania replikacji DNA i naprawy produktów pośrednich. Więc zacznijmy.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować 200 mikrolitrów nocnej kultury E coli zawierającej plazmid PBR 3 22 w pożywce udowej DGC z ampicyliną w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zastosowanie medium udowego DGC minimalizuje ochronę przed promieniowaniem UV. Po całonocnej inkubacji osadzać komórki w temperaturze 14 000 RRP M przez 30 sekund.

Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 200 mikrolitrach pożywki DG C z niedoborem ampicyliny i zaszczep. 20 mililitrów pożywki udowej DG C bez selekcji ampicyliny. W inkubatorze wytrząsającym w temperaturze 37 stopni Celsjusza do OD 600 0,5, co odpowiada około pięć razy 10 do ósmych komórek Wzrost na mililitr bez ampicyliny pozwala uniknąć selekcji przeciwko nieprawidłowym lub nieproduktywnym produktom pośrednim replikacji, które mogą powstać w niektórych mutantach.

Ponadto, jeśli używasz światła UV do wywoływania uszkodzeń, konieczne jest usunięcie ampicyliny z mediów, ponieważ silnie absorbuje ona przy tych długościach fal i ekranuje. Komórki zmniejszają efektywną dawkę promieniowania UV podczas wzrostu komórek. Użyj fotometru UVC, aby określić odległość od 15-watowej lampy bakteriobójczej, która wytwarza szybkość ekspozycji około jednego JUUL-a na metr kwadratowy na sekundę.

Kolejne kroki należy wykonywać w świetle żółtym, ponieważ zapobiegnie to odwróceniu fotoreaktywacji dimerów perynowych cyklobutanu przez fotoliazę po naświetlaniu promieniowaniem UV. Po osiągnięciu pożądanej gęstości komórek za pomocą pipety przenieś kulturę na szalkę Petriego o średnicy 15 centymetrów na obrotowej platformie, aby zapewnić równomierne napromieniowanie całej populacji komórek. Następnie napromienić kultury z prędkością 50 dżuli na metr kwadratowy i natychmiast przenieść je do sterylnej podgrzewanej kolby i umieścić z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Na czas trwania eksperymentu dawka ta wytwarza średnio jeden dimer cyklobutanu peryny, co 4,5 kilozasad jednoniciowego DNA na każdy punkt czasowy, który ma być zbadany. Odpipetować 0,75 mililitra podwielokrotności kultury do 0,75 mililitra lodowatej siatki 30. Siatka buforowa 30 służy jako bufor zatrzymujący, który zapobiega postępowi replikacji i naprawy przez wycinanie nukleotydów.

Po dodaniu buforu zatrzymującego próbkę można przechowywać na lodzie do końca przebiegu czasowego. Po upływie czasu należy przetworzyć każdą próbkę i ponownie zawiesić granulki. W 150 mikrolitrach buforu do lizy utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut bez mieszania.

Ponieważ replikujące się struktury z pojedynczymi pasmami, regionami lub punktami rozgałęzień są bardziej podatne na ścinanie, odetnij końcówki pipet żyletką, aby poszerzyć usta i zminimalizować siły ścinające. Ogólnie rzecz biorąc, pipetowanie i mieszanie powinno być ograniczone do minimum do czasu, gdy DNA zostanie strawione enzymami restrykcyjnymi, po lizie dodać proteinazę K i komórkę Sarcasa i pozostawić inkubację na godzinę do końca. Służy to uwolnieniu fragmentów DNA związanych z białkiem.

Ponieważ aktywnie replikujące się DNA jest często związane z kompleksami białkowymi lub błonowymi, pomaga to zwiększyć wydajność fragmentów replikacji. Po godzinie ekstrahować próbki, dodając dwie objętości fenolu do każdej próbki i delikatnie odwracając probówki przez pięć minut. Następnie dodaj dwie objętości chloroformu, izoamylu, alkoholu i delikatnie odwróć probówki przez dodatkowe pięć minut.

Następnie odwirować próbki z prędkością 14 000 obr./min w mikrowirówce przez pięć minut i przenieść górną fazę wodną każdej próbki do świeżej probówki. Następnie dodaj cztery objętości alkoholu chloroformowego ISO i ponownie delikatnie odwróć probówki przez pięć minut. Ponownie odwirować próbki z prędkością 14 000 obr./min przez pięć minut.

Umieścić membranę dializacyjną na 250 mililitrach 0,1 xte w zlewce i umieścić 100 mikrolitrów każdej próbki na membranie. Pozwól próbkom na dializę przez godzinę po dializie. Umieść 80 mikrolitrów każdej próbki w świeżej 1,5 mililitrowej probówce zawierającej 20 mikrolitrów mieszanki enzymatycznej.

Próbki trawić przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. PV two linearyzuje plazmid tuż za początkiem replikacji. Przed załadowaniem żelu agros dodaj 100 mikrolitrów chloroformu i 20 mikrolitrów sześciokrotnego barwnika ładującego zawierającego bromo.

Błękit fenolowy i błękit ksylenowy do każdej próbki i zmieszanie chloroformu usunie wszelkie pozostałe PV dwa związane z końcami DNA. Rozpocznij dwuwymiarową analizę żelu aros, przepuszczając ograniczone próbki DNA przez pierwszy wymiar. Najpierw załaduj marker Lambda hind three size na pierwszy pas wcześniej przygotowanego żelu agros 0,4% w jednym XTBE.

Następnie załaduj 40 mikrolitrów fazy wodnej zawierającej barwnik ładujący do każdej próbki, omijając pasy, aby ułatwić krojenie żelu. Po elektroforezie uruchomić pierwszy wymiar przy napięciu jednego wolta na centymetr przez około 12 do 15 godzin. Niskonapięciowy i niskoprocentowy żel AGROS służy do oddzielania fragmentów DNA głównie na podstawie wielkości.

Po przebiegnięciu pierwszego wymiaru użyj dużego noża rzeźniczego, aby wyciąć pierwszy pas zawierający znacznik Lambda tylnych trzech i zabarwić bromkiem atherium. W drugim wymiarze wytnij pasy żelu za pomocą dużego noża rzeźniczego, używając markera Lambda Hind three jako uprawy prowadzącej i odrzuć obszar poniżej miejsca, w którym oczekuje się, że zlinearyzowany plazmid będzie przebiegał na każdym pasie. Aby odlać drugi wymiar, umieść każdy plasterek poziomo na wierzchu pustego żelowego kółka.

Przygotuj roztwór 1%AROS w jednym XTBE i ostudź do 55 stopni Celsjusza. Po schłodzeniu wlej roztwór żelu, aby odlać drugi wymiar, upewniając się, że całkowicie pokryłeś plastry żelu. Ważne jest, aby przed wlaniem żelu upewnić się, że plastry są równomiernie ułożone, a kółko wypoziomowane.

Po związaniu żelu uruchom drugi wymiar, pięć i pół do siedmiu godzin przy 6,5 obj. na centymetr w jednostce do elektroforezy, która umożliwia buforowi recyrkulację wysokiego napięcia, a wysokoprocentowy żel Agros skutecznie oddziela fragmenty DNA na podstawie ich kształtu, a także rozmiaru. Kształty nieliniowe przebiegają wolniej przez drugi wymiar po elektroforezie. Spłucz żel raz w wodzie, a następnie umyj go dwukrotnie w 400 mililitrach 0,25 molowego kwasu solnego przez 15 minut z delikatnym mieszaniem.

Mycie kwasem służy do częściowego nacinania cząsteczek DNA na mniejsze fragmenty, które przenoszą się wydajniej podczas analizy południowej i są konieczne ze względu na duży rozmiar i nietypowy kształt produktów pośrednich replikacji DNA. Aby przygotować żel do przenoszenia alkaliów, należy ponownie spłukać żel w wodzie, a następnie przemyć go dwukrotnie w 400 mililitrach 0,4 molowego wodorotlenku sodu przez 30 minut. DNA w żelach jest następnie przenoszone do membrany nylonowej o wysokim wiązaniu n plus za pomocą systemu transferu zasad w dół z 0,4 molowym wodorotlenkiem sodu, jak opisano w pisemnej części tej procedury, pozwól transferowi DNA przez sześć do 12 godzin po transferze DNA kontynuować hybrydyzację sondy, jak opisano w pisemnym protokole.

Po zbadaniu i umyciu membrany należy położyć membranę na ręczniku papierowym, aż płyn widocznie zniknie. Następnie owiń membranę w folię z polichlorku winylu i wystaw ją na ekran skanera fosfonowego. Wreszcie, radioaktywność może być zwizualizowana i określona ilościowo za pomocą burzy 840 i powiązanej z nią ilości obrazu.

Przedstawiono schemat migracji dwutrawionego plazmidu PBR 3 22 PV obserwowanego za pomocą analizy żelu 2D aros. Niereplikujące plazmidy liniowe działają jako liniowy fragment replikujący plazmid o wielkości 4,4 KB tworzy struktury w kształcie litery Y, które migrują wolniej niż niereplikujące się fragmenty ze względu na ich większy rozmiar i nieliniowy kształt. Ten wzór migracji tworzy łuk, który rozciąga się od obszaru liniowego w kierunku studni po napromieniowaniu UV.

Cząsteczki w kształcie podwójnej litery Y lub X są obserwowane w obszarze stożka i migrują wolniej niż łuk cząsteczek w kształcie litery Y. Przykład południowej analizy żelu 2D sondowanego za pomocą P 32 oznaczonego PBR 3 22 pokazano dla komórek bezpośrednio po naświetlaniu promieniowaniem UV i 15 minut po napromieniowaniu UV bezpośrednio po napromieniowaniu UV. Około 1% całkowitego DNA osocza można znaleźć w łuku Y, gdy komórki szybko rosną w fazie wykładniczej po promieniowaniu.

Obserwuje się przejściowy wzrost cząsteczek w kształcie YS, gdy zablokowane widełki replikacyjne gromadzą się w uszkodzonych miejscach. Półprodukty replikacji w kształcie litery L są również przejściowe, kumulują się i utrzymują do czasu, który koreluje z momentem, w którym zmiany są naprawiane. Właśnie pokazaliśmy, jak wizualizować produkty pośrednie naprawy DNA za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z sił ścinających, które mogą zmniejszyć wydajność, i zachować delikatność w przypadku wszystkich próbek i żeli. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.