Indukowanie specyficznej dla miejsca blokady replikacji u E. coli przy użyciu systemu operatora represora fluorescencyjnego

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zatrzymanie widełek replikacyjnych w bloku nukleoproteiny i obserwacja struktur DNA w miejscu bloku w celu zbadania szlaków naprawy DNA. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące replikacji i naprawy DNA, takie jak sposób przetwarzania DNA, gdy aparat replikacyjny komórki napotyka blokadę białkową. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy odwracalnie zatrzymać widełki replikacyjne w określonym miejscu na chromosomie w całej populacji żywych komórek.

Tę procedurę zademonstrują następujący członkowie mojego laboratorium, dr Karla Mettrick i doktorantka, Georgia Weaver i Tayla-Ann Corocher. Do tej procedury wykorzystuje się szczep E. coli przenoszący układ operatorów tetracyklin w plazmidzie pKM1. pKM1 koduje TetR-YFP, indukowalne białko represorowe tetracykliny znakowane białkiem żółtym fluorescencyjnym.

Rozcieńczyć świeżą nocną kulturę tego szczepu E. coli do gęstości optycznej 0,01 w 600 nanometrach w rozcieńczonym złożonym podłożu z antybiotykami, zgodnie z wymaganiami selekcji. Hoduj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem do gęstości optycznej przy 600 nanometrach od 0,05 do 0,1. Usuń 10-mililitrową próbkę, aby służyła jako nieindukowana kontrola.

Dodać 0,01% arabinozy do pozostałej kultury, aby indukować produkcję TetR-YFP z pKM1. Kontynuuj uprawę zarówno kultur nieindukowanych, jak i indukowanych w temperaturze 30 stopni Celsjusza z potrząsaniem. Po godzinie sprawdź, czy w każdej komórce indukowanej hodowli znajduje się pojedynczy punkt ogniskowy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Jeśli potwierdzi się, że indukowane komórki są zablokowane, na co wskazuje ponad 70% komórek mających pojedyncze ognisko, należy zarejestrować gęstość optyczną i usunąć 7,5 mililitra próbki do analizy za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej. Usunąć równoważną próbkę z nieindukowanej kultury kontrolnej. Przed mikroskopią fluorescencyjną należy przygotować podkładki agarozowe, aby zapobiec ruchowi komórek podczas wizualizacji.

Dla każdej wkładki agarozowej odpipetować 500 mikrolitrów stopionej agarozy na szkiełko mikroskopowe i nałożyć na szkiełko nakrywkowe bezpośrednio przed zestaleniem się agarozy. Przechowuj szkiełka między mokrymi chusteczkami w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą potrzebne. Kiedy nadejdzie czas na sprawdzenie komórek, usuń szkiełko nakrywkowe z podkładki agarozowej i odpipetuj 10 mikrolitrów kultury bakteryjnej na środek podkładki.

Po około pięciu minutach, gdy wacik agarozowy wyschnie, wymień szkiełko nakrywkowe. Umieść kroplę olejku immersyjnego na szkiełku nakrywkowym i umieść szkiełko pod optyką. Wizualizuj komórki za pomocą mikroskopii fazowej w 100-krotnym powiększeniu.

W oknie dialogowym Acquire (Pobierz) w oprogramowaniu do obrazowania ustaw opcję Exposure Time (Czas ekspozycji) na 100 milisekund. Wybierz opcję Pobierz, aby przechwycić obraz. Nie przesuwaj sceny.

W oknie dialogowym Pozyskane wybierz opcję YFP jako oświetlenie migawki zewnętrznej połączonej z kamerą. Ustaw czas ekspozycji na 1 000 milisekund. Wyłącz oświetlenie stołu montażowego i wybierz opcję Acquire, aby przechwycić obraz fluorescencyjny.

Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj azydek sodu do wcześniej pobranych próbek kultur do końcowego stężenia 0,1% i inkubuj na lodzie przez co najmniej pięć minut. Odwirować komórki z prędkością 5 000 g przez dziesięć minut. Odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić każdą komórkę w 200 mikrolitrach buforu PIV i przenieść komórki do probówki do mikrofuge. Mikrowirówka do osadzania komórek i odrzucania supernatantu. Potraktuj szkiełko mikroskopowe 40 mikrolitrami odpowiedniego szklanego roztworu hydrofobowego lub silikonowego.

Przetrzyj szkiełko chusteczką, aż wyschnie. Ponownie zawieś ogniwa o najmniejszej gęstości komórek w 50 mikrolitrach PIV i umieść w temperaturze 50 stopni Celsjusza w bloku grzewczym. W przypadku wszystkich innych próbek dostosuj objętości PIV tak, aby końcowa gęstość komórek była taka sama w każdej probówce.

Dodać równą objętość świeżo przygotowanego 0,8% roztworu agarozy w PIV do próbek. Próbki należy przechowywać w bloku grzewczym, aby upewnić się, że mają temperaturę powyżej 50 stopni Celsjusza, aby zapobiec zestaleniu. Umieść 20 mikrolitrów zawiesiny agarozy komórkowej na leczonym szkiełku, aby uzyskać półkuliste zatyczki.

Gdy zatyczki zestalą się, delikatnie wsuń wszystkie zatyczki z jednej próbki do jednej probówki do mikrofuge i dodaj jeden mililitr buforu do lizy komórek. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po dwóch godzinach usuń bufor do lizy komórek i dodaj 1 mililitr roztworu EDTA-sarkozyloproteinazy K lub ESP.

Inkubować w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez noc lub do momentu, gdy zatyczki staną się przezroczyste. Gdy wtyczki staną się przezroczyste, wyjmij bufor ESP i przenieś zatyczki do 15-mililitrowej tuby. Dodaj 12 mililitrów buforu TE i odstaw na 30 minut.

Umyj wtyczki w sumie pięć razy buforem TE. Przechowuj wtyczki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w jednym mililitrze buforu TE. Aby przeanalizować produkty pośrednie replikacji, DNA w czopach agarozowych jest trawione za pomocą enzymu restrykcyjnego odpowiedniego dla regionu zainteresowania.

W tym przykładzie EcoRV tnie DNA bezpośrednio przed macierzą, w obrębie macierzy i po macierzy, aby uzyskać fragmenty o długości 5,5 kb i 6,7 kb w obszarze zainteresowania. Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś czop agarozowy do świeżej probówki do mikrofuge i dodaj 150 mikrolitrów buforu enzymu restrykcyjnego. Dodaj 25 do 100 jednostek enzymu restrykcyjnego i traw w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć do ośmiu godzin.

Przygotuj 0,4% żel agarozowy w czterech stopniach Celsjusza. Wlej 300 mililitrów stopionej agarozy do tacki żelowej o wymiarach około 25 na 25 centymetrów. Włóż grzebień, aby studzienki miały mniej więcej taką samą szerokość jak średnica korka.

Gdy żel stężeje, wyjmij grzebień i przenieś żel do temperatury pokojowej. Za pomocą pętli inokulacyjnej wsuń jeden z strawionych czopów agarozowych do studzienki, ustawiając płaską stronę czopa względem strony studzienki, po której DNA dostanie się do żelu. Włóż pojedynczą zatyczkę w ten sam sposób do co drugiej studzienki.

Pipetą stopioną 0,4% agarozę wciągnąć do studzienek, aby uszczelnić korki na miejscu. Załaduj drabinkę DNA o wielkości jednego kb do pustej studzienki, pozostawiając przerwę między drabinką a próbkami. Uruchom żel przez noc w 1xTBE w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia zabarwić żel w łaźni wodnej zawierającej 0,3 mikrograma na mililitr bromku etydyny przez 20 minut. Wizualizuj DNA za pomocą długofalowego transiluminatora UV i wycinaj każdy fragment pasa prostym, równym cięciem, minimalizując włączenie nadmiaru agarozy po obu stronach pasa. Umieść wycięty pas żelu w tacki z żelem pod kątem 90 stopni w kierunku migracji DNA.

Kolejnym krokiem jest przygotowanie 300 mililitrów agarozy do żelu drugiego wymiaru. Gdy agaroza zostanie schłodzona do 50 stopni Celsjusza, odpipetuj stopioną agarozę wokół plastrów żelu, aby zestalić ich pozycję. Wlej pozostałą agarozę do tacki na głębokość co najmniej na poziomie plasterków żelu.

Po zestaleniu się żelu należy go poddać elektroforezie w 1xTBE zawierającym 0,3 mikrograma na mililitr bromku etydyny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż DNA przeniesie się na około 10 centymetrów. Wyciąć bloki, w których obecne jest genomowe DNA, w tym żel znajdujący się nad nim, aby uwzględnić DNA, które nie jest widoczne. DNA w żelu jest następnie wizualizowane przez hybrydyzację południową, jak opisano w protokole tekstowym.

W tym systemie blok replikacyjny został potwierdzony przez większość komórek zawierających jedno ognisko odpowiadające jednej kopii tablicy w komórce. Dodanie anhydrotetracykliny odwróciło blok, a późniejsza duplikacja macierzy została zwizualizowana jako akumulacja komórek z wieloma ogniskami. Komórki z zablokowaną replikacją wykazywały również zahamowanie wzrostu, które zostało odwrócone przez późniejszy wzrost w obecności anhydrotetracykliny.

Aby przeanalizować produkty pośrednie replikacji, DNA poddano elektroforezie w pierwszym wymiarze. Interesujące nas DNA zostało następnie wycięte, a elektroforeza w drugim wymiarze dała przekątną liniowego DNA. Południowa hybrydyzacja macierzy DNA ujawniła dwie plamki w niezablokowanej próbce odpowiadające oczekiwanym fragmentom macierzy o wielkości 5,5 kb i 6,7 kb.

Zablokowana próbka wykazała zmniejszenie plamki 5,5 kb i dodanie eliptycznego sygnału wskazującego na nagromadzenie DNA w kształcie litery Y. Dodanie anhydrotetracykliny wyeliminowało sygnał DNA w kształcie litery Y. Innym powszechnym produktem pośrednim jest złącze Hollidaya wizualizowane jako sygnał stożka na szczycie łuku Y i skok z liniowego DNA na końcu łuku Y.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu ośmiu dni, jeśli jest odpowiednio uformowana. Chociaż jest to procedura 2D, ważne jest, aby pamiętać, że jakość czopów DNA ma kluczowe znaczenie dla optymalnej wizualizacji struktur DNA.