Indukowanie specyficznej dla miejsca blokady replikacji u E. coli przy użyciu systemu operatora represora fluorescencyjnego

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zatrzymanie widełek replikacyjnych na blokadzie nukleoproteinowej i obserwacja struktur DNA w miejscu tej blokady w celu zbadania szlaków naprawy DNA. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące replikacji i naprawy DNA, takie jak sposób przetwarzania DNA w sytuacji, gdy aparat replikacyjny komórki napotyka białkową przeszkodę. Główną zaletą tej techniki jest możliwość odwracalnego zatrzymania widełek replikacyjnych w konkretnej lokalizacji na chromosomie w całej populacji żywych komórek.

Procedurę tę zaprezentują członkowie mojego laboratorium: dr Karla Mettrick oraz studenci studiów magisterskich, Georgia Weaver i Tayla-Ann Corocher. W procedurze tej wykorzystuje się szczep E.coli zawierający macierz operatorów tetracykliny w plazmidzie pKM1. pKM1 koduje TetR-YFP, czyli indukowalne białko represora tetracykliny znakowane żółtym białkiem fluorescencyjnym.

Świeżą kulturę nocną tego szczepu E.coli rozcieńczyć do gęstości optycznej przy 600 nanometrach wynoszącej 0,01 w rozcieńczonym medium złożonym z antybiotykami wymaganymi do selekcji. Hodować kulturę w temperaturze 30 degrees celsius z wytrząsaniem do uzyskania gęstości optycznej przy 600 nanometrach w przedziale od 0,05 do 0,1. Odobrać próbkę o objętości 10 milliliter, która posłuży jako kontrola nieindukowana.

Do pozostałej hodowli dodaj 0,01% arabinozy, aby indukować produkcję TetR-YFP z pKM1. Kontynuuj inkubację obu kultur, nieindukowanej i indukowanej, w temperaturze 30 stopni celsius z wytrząsaniem. Po godzinie, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, sprawdź obecność pojedynczego punktu ogniskowego w każdej komórce kultury indukowanej.

Jeśli potwierdzona zostanie blokada indukowanych komórek, o czym świadczy fakt, że ponad 70% komórek posiada pojedynczy ognisko, należy zarejestrować gęstość optyczną i pobrać 7,5 milliliters próbki do analizy za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej. Należy pobrać równoważną próbkę z nieindukowanej kultury kontrolnej. Przed badaniem w mikroskopie fluorescencyjnym należy przygotować podkładki agarozowe w celu zapobiegania przemieszczaniu się komórek podczas wizualizacji.

Dla każdej podkładki agarozowej nanieś pipetą 500 µL płynnej agarozy na szkiełko przedmiotowe i natychmiast przykryj ją szkiełkiem nakrywką, zanim agaroza stężeje. Przechowuj szkiełka między wilgotnymi chusteczkami w temperaturze 4 °C do momentu użycia. W czasie sprawdzania komórek zdejmij szkiełko nakrywkę z podkładki agarozowej i nanieś pipetą 10 µL kultury bakteryjnej na środek podkładki.

Po około pięciu minutach, gdy podkładka z agarozy wyschnie, należy ponownie nałożyć szkiełko nakrywkowe. Na szkiełko nakrywkowe nanosi się kroplę oleju imersyjnego, a następnie umieszcza preparat pod obiektywem. Komórki obserwuje się za pomocą mikroskopii fazowej przy powiększeniu 100x.

W oknie dialogowym Acquire w oprogramowaniu do obrazowania ustaw czas ekspozycji (Exposure Time) na 100 milliseconds. Wybierz Acquire, aby zarejestrować obraz. Nie przesuwaj stolika.

W oknie dialogowym Acquired wybierz YFP jako oświetlenie dla migawki zewnętrznej powiązanej z kamerą. Ustaw czas ekspozycji (Exposure Time) na 1 000 milisekund. Wyłącz oświetlenie stołu i wybierz Acquire, aby zarejestrować obraz fluorescencyjny.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać azotek sodu do wcześniej pobranych próbek hodowli do stężenia końcowego 0,1% i inkubować na lodzie przez co najmniej pięć minut. Następnie komórki należy wirować z prędkością 5 000 ×g przez dziesięć minut. Następnie należy odrzucić nadsącz.

Każdy osad komórkowy zawiesić ponownie w 200 µL buforu PIV i przenieść komórki do probówki do mikrowirówki. Odwirować w mikrocentryfudze, aby uzyskać osad komórkowy, a następnie odrzucić nadsącz. Przetraktować szkiełko przedmiotowe 40 µL odpowiedniego hydrofobowego środka do szkła lub roztworu silikonu.

Przecieraj szkiełko chusteczką, aż będzie suche. Resuspenduj komórki o najniższej gęstości w 50 µL PIV i umieść w bloku grzewczym w temperaturze 50 °C. W przypadku pozostałych próbek dostosuj objętość PIV tak, aby końcowa gęstość komórek w każdej probówce była taka sama.

Do próbek dodać równą objętość świeżo przygotowanego 0,8% roztworu agarozy w PIV. Próbki należy przechowywać w bloku grzejnym, aby utrzymać ich temperaturę powyżej 50 °C i zapobiec krzepnięciu. Na przygotowany szkiełko nanieść krople zawiesiny komórek w agarozie o objętości 20 µl, aby utworzyć półkoliste grudki.

Po zastygnięciu zatyczek należy ostrożnie przesunąć wszystkie zatyczki z jednej próbki do jednej probówki do mikrowirówki i dodać jeden mililitr buforu do lizy komórek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Po dwóch godzinach usunąć bufor do lizy komórek i dodać 1 ml roztworu EDTA-Sarkosyl-Proteinase K lub roztworu ESP.

Inkubować w temperaturze 50 °C przez noc lub do momentu, aż krążki staną się przezroczyste. Gdy krążki będą przezroczyste, usunąć bufor ESP i przenieść krążki do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 12 ml buforu TE i pozostawić na 30 minut.

Przemyć wtyczki łącznie pięć razy buforem TE. Przechowywać wtyczki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w 1 ml buforu TE. Aby przeanalizować produkty pośrednie replikacji, DNA w wtyczkach agarozowych poddaje się trawieniu odpowiednim enzymem restrykcyjnym dla badanego regionu.

W tym przykładzie enzym EcoRV przecina DNA bezpośrednio przed macierzą, wewnątrz macierzy oraz po macierzy, co daje fragmenty o wielkości 5,5 kb i 6,7 kb w obszarze zainteresowania. Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś zrąb agarozowy do nowej probówki do mikrowirówki i dodaj 150 µL buforu do enzymów restrykcyjnych. Dodaj od 25 do 100 jednostek enzymu restrykcyjnego i inkubuj w 37 °C przez sześć do ośmiu godzin.

Przygotować 0,4% żel agarozowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wlać 300 ml roztopionej agarozy do tacy do żelu o wymiarach około 25 na 25 cm. Włożyć grzebień, aby utworzyć oczka o szerokości zbliżonej do średnicy plugu.

Po zastygnięciu żelu należy wyjąć grzebień i przenieść żel do temperatury pokojowej. Za pomocą pętli do szczepienia należy wsunąć jeden z przetrawionych czopków agarozowych do studzienki, ustawiając płaską stronę czopka przylegać do boku studzienki, przez który DNA będzie wnikać do żelu. W ten sam sposób należy umieścić pojedynczy czopek w co drugiej studzience.

Wypipetuj stopioną 0,4% agarozy do otworów, aby utrwalić zatyczki na miejscu. W pustym otworze nanieś marker wielkości DNA 1 kb, pozostawiając odstęp między markerem a próbkami. Prowadź elektroforezę w żelu przez noc w 1xTBE w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia barwić żel w łaźni wodnej zawierającej 0,3 µg/ml bromku etydyny przez 20 minut. Wizualizować DNA za pomocą transiluminatora UV z długą falą i wyciąć fragment każdej ścieżki prostym, równym cięciem, minimalizując ilość nadmiaru agarozy po obu stronach ścieżki. Umieścić wycięty fragment żelu w kuwecie do elektroforezy pod kątem 90 stopni względem kierunku migracji DNA.

Kolejnym krokiem jest przygotowanie 300 mililitrów agarozy do żelu drugiego wymiaru. Gdy agaroza ostygnie do 50 °C, nanieś pipetą płynną agarozę wokół plastrów żelu, aby utrwalić ich położenie. Wlej pozostałą agarozę do kuwety, tak aby głębokość była co najmniej równa wysokości plastrów żelu.

Po zastygnięciu żelu należy przeprowadzić elektroforezę w 1xTBE zawierającym 0,3 µg/ml bromku etydyny w temperaturze 4 °C, aż DNA przemieści się o około 10 cm. Należy wyciąć fragmenty żelu zawierające genomowe DNA wraz z obszarem powyżej nich, aby objąć również niewidoczne DNA. DNA w żelu jest następnie wizualizowane za pomocą hybrydyzacji Southern zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

W tym systemie blokada replikacji została potwierdzona przez większość komórek zawierających jeden ognisko odpowiadający jednej kopii macierzy wewnątrz komórki. Dodatek anhydrotetracykliny znosił blokadę, a następująca po niej duplikacja macierzy była wizualizowana jako gromadzenie się komórek z wieloma ogniskami. Komórki z zablokowaną replikacją wykazywały również hamowanie wzrostu, które było odwracane przez późniejszy wzrost w obecności anhydrotetracykliny.

W celu analizy produktów pośrednich replikacji, DNA poddano elektroforezie w pierwszym wymiarze. Następnie wycięto interesujący fragment DNA, a elektroforeza w drugim wymiarze doprowadziła do powstania przekątnej liniowego DNA. Hybrydyzacja Southern DNA z macierzy wykazała w nieblokowanej próbce dwie plamki odpowiadające oczekiwanym fragmentom macierzy o wielkości 5,5kb i 6,7kb.

W próbce blokowanej zaobserwowano zmniejszenie plamki 5,5 kb oraz pojawienie się sygnału eliptycznego, co wskazuje na akumulację DNA w kształcie litery Y. Dodatek anhydrotetracykliny wyeliminował sygnał DNA w kształcie litery Y. Innym powszechnym produktem pośrednim jest połączenie Hollidaya, widoczne jako sygnał stożkowy na szczycie łuku Y oraz sygnał w postaci kolca od DNA liniowego na końcu łuku Y.

Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w ciągu ośmiu dni, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Mimo że jest to procedura 2D, należy pamiętać, że jakość wtyczek DNA jest krytyczna dla optymalnej wizualizacji struktur DNA.