Wykrywanie horyzontalnego transferu genów, w którym pośredniczą naturalne plazmidy koniugacyjne w E. coli

Bakterie takie jak E. coli przenoszą geny oporności na antybiotyki w plazmidach koniugacyjnych. Bakterie te można znaleźć w szpitalach, żyjąc jako komensale u zwierząt oraz w środowiskach wodnych. Naturalne plazmidy koniugacyjne poziomy transfer genów między różnymi liniami bakteryjnymi.

Prezentujemy metale do wykrywania plazmidów koniugacyjnych i skuteczności koniugacji powstawania. Ta technika jest prosta i wrażliwa. Jest wrażliwy, ponieważ wykorzystuje markery dla plazmidu, dawcy i biorcy.

Markery te są wybieralne, co oznacza, że mogą identyfikować pojedyncze zdarzenia w bardzo dużych populacjach. Przedstawione przez nas protokoły są przydatne do badania ewolucji oporności na antybiotyki oraz do nadzoru epidemiologicznego, czyli monitorowania przepływu genów oporności na leki. Procedurę zademonstrują Caison Warner, doktorantka z mojego laboratorium, oraz Pepper St. Clair, studentka studiów licencjackich z laboratorium CAMS.

Pierwszego dnia oddzielnie nałóż dawców i biorcę z zapasów glicerolu na pożywkę C, którą jest agar MacConkey bez antybiotyków i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Drugiego dnia oznacz 14-mililitrową probówkę hodowlaną dla każdego dawcy i biorcy. Wybierz pojedynczą kolonię każdego dawcy i biorcy i hoduj je w dwóch mililitrach bulionu Mueller Hinton przy 200 obr./min przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Trzeciego dnia zmierz gęstość optyczną 10-krotnie rozcieńczonej solą fizjologiczną kultury uprawianej przez noc w temperaturze 600 nanometrów bez wirowania. W razie potrzeby użyj wysterylizowanego roztworu soli fizjologicznej, aby dostosować gęstość optyczną do dwóch. Oznacz 1,5-mililitrową probówkę wirówkową jako probówkę łączącą, wskazując szczepy dawcy i biorcy.

Przenieść 500 mikrolitrów dostosowanej zawiesiny każdego dawcy i biorcy do probówki współpracującej i delikatnie wymieszać zawiesinę przez odwrócenie. Odwirować probówkę współpracującą w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 500 G. Odpipetować 800 mikrolitrów supernatantu z probówki współpracującej, nie naruszając osadu, pozostawiając 200 mikrolitrów w probówce. Inkubować probówkę łączącą przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Ponadto, jako kontrolę negatywną, należy prześledzić nocną hodowlę dawców na pożywce B i biorców na pożywce A i inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji, w czwartym dniu, dodaj 800 mikrolitrów roztworu soli fizjologicznej do probówki współpracującej i ponownie zawieś przez wirowanie. Wykonać seryjne rozcieńczenia pasującej zawiesiny i dodać 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na płytkach z podłożami.

Po wysuszeniu płytek inkubuj je przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i oblicz częstotliwość koniugacji na dawcę lub biorcę, jak opisano w manuskrypcie. Po wyekstrahowaniu DNA ze ścian komórkowych bakterii przy użyciu prostej metody ekstrakcji z przygotowaniem do gotowania, oznacz 1,5-mililitrową probówkę jako pulę w wymaganych probówkach PCR nazwą genu i próbki. W probówce oznaczonej jako basen dodaj sterylną wodę, mieszankę wzorcową PCR, startery i polimerazę.

Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy w chłodnym miejscu. Dodaj DNA z matrycy do odpowiedniej probówki i zabezpiecz probówki PCR nakrętkami. Umieść probówki PCR w termocyklerze i uruchom program dla genów oporności i replikonów, jak opisano w manuskrypcie.

W celu potwierdzenia amplikonu przygotuj 1% żel agarozowy, dodając agarozę i bufor TAE do kolby o pojemności 250 mililitrów i rozpuść agarozę za pomocą kuchenki mikrofalowej. Gdy roztwór agarozy ostygnie do około 55 stopni Celsjusza, pod wyciągiem dodaj sześć mikrolitrów SYBR Green i wymieszaj. Wlej żel do tacki uszczelnionej taśmą klejącą, aby uniknąć rozlania i pozwól żelowi zastygnąć przez 15 do 25 minut, aż pojawi się zmętnienie.

Po usunięciu taśmy klejącej umieść żel w komorze elektroforetycznej i dodaj bufor TAE w celu pokrycia żelu. Wymieszaj pięć mikrolitrów sześciokrotnego barwnika ładującego żel DNA z 25 mikrolitrami każdej reakcji, pipetując w górę iw dół co najmniej 10 razy. Następnie załaduj mieszaninę do studzienek, unikając pęcherzyków.

Po dodaniu czterech mikrolitrów jednej drabinki DNA z jedną parą kilozasad do pierwszej studzienki, zamknij pokrywę komory i uruchom żel na 60 minut przy napięciu 120 woltów i 400 miliamperach. Wizualizuj żel w świetle UV i zapisz obraz. Agar MacConkey rozróżniał dawców laktozo-dodatnich, którzy wytwarzali duże różowe kolonie od biorcy i transkoniugantów, którzy byli laktozo-ujemni i wytwarzali mniejsze bladożółte kolonie.

Pięć wydajności koniugacji szczepu dawcy SSW4955 mieściło się w tym samym rzędzie wielkości, co wskazuje, że mobilizację plazmidu koniugacyjnego można wykryć niezależnie od selekcji użytej do identyfikacji transkoniugantu. Natomiast szczep dawcy wykazał SSW7037 trzykrotnie niższą sprawność koniugacji, co pozwala na porównanie efektywności koniugacji różnych dawców i typów plazmidów z tymi samymi biorcami. Elektroforeza żelowa produktów PCR potwierdziła obecność spodziewanych replikonów w transkoniugantach.

Ten test całkowicie zależy od markerów, które można wybrać. Należy przeprowadzić kontrole w celu potwierdzenia, że każda selekcja działa, a transkoniuganty muszą być potwierdzone kolorymetrycznie lub metodą PCR. Przedstawione tutaj protokoły mogą być zaadaptowane do badania koniugacji in vivo lub modeli biofilmu, a także do badania zmiennych modulujących efektywność koniugacji.

Ten protokół wykrywania zdolnych do mobilizacji plazmidów na dużą skalę znacznie wzbogaci nasze zrozumienie przepływu genów w środowisku i zbadanie zmiennych wpływających na efektywność koniugacji.