Name: Wykrywanie horyzontalnego transferu genów, w którym pośredniczą naturalne plazmidy koniugacyjne w E. coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj metodę wykrywania horyzontalnego transferu genów za pośrednictwem plazmidów koniugacyjnych w E. coli. Technika wykorzystuje różnicowe markery do identyfikacji transkonjugantów w dużych populacjach bakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LM-B, IMG, AT i IS były wspierane przez GM055246 grantowe NIH przyznane LM-B. GC-C otrzymał stypendium podoktorskie UC MEXUS-CONACYT na dwa kolejne lata: AY 2017-18 i 2018-19. Bardzo dziękujemy studentom Sage Chavez i Pepper St. Clair z programu mentorskiego Academic Inspiration Network (GAIN) sponsorowanego przez Genentech-Foundation za ich wsparcie techniczne w eksperymentach.

<ol><li>Lederberg, J., Tatum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gene recombination in Escherichia coli.</a> Nature. 158 (4016), 558(1946).</li>
<li>de la Cruz, F., Frost, L. S., Meyer, R. J., Zechner, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+DNA+metabolism+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Conjugative DNA metabolism in Gram-negative bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (1), 18-40 (2010).</li>
<li>Grohmann, E., Muth, G., Espinosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+plasmid+transfer+in+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (2), 277-301 (2003).</li>
<li>Koraimann, G., Wagner, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+behavior+and+decision+making+in+bacterial+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Social behavior and decision making in bacterial conjugation.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 54(2014).</li>
<li>Dziewit, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+role+of+plasmids+in+adaptation+of+bacteria+inhabiting+the+Lubin+copper+mine+in+Poland%2C+an+environment+rich+in+heavy+metals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and role of plasmids in adaptation of bacteria inhabiting the Lubin copper mine in Poland, an environment rich in heavy metals.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 152(2015).</li>
<li>Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mobility of plasmids.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).</li>
<li>Balbuena-Alonso, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+plasmid+content+in+food+isolates+of+E.+coli+strongly+supports+its+role+as+a+reservoir+for+the+horizontal+transfer+of+virulence+and+antibiotic+resistance+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of plasmid content in food isolates of E. coli strongly supports its role as a reservoir for the horizontal transfer of virulence and antibiotic resistance genes.</a> Plasmid. 123-124, 102650(2022).</li>
<li>San Millan, A., MacLean, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+costs+of+plasmids%3A+A+limit+to+plasmid+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Fitness costs of plasmids: A limit to plasmid transmission.</a> Microbiol Spectrum. 5 (5), (2017).</li>
<li>Coluzzi, C., Garcillán-Barcia, M. P., de la Cruz, F., Rocha, E. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+plasmid+mobility%3A+Origin+and+fate+of+conjugative+and+nonconjugative+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolution of plasmid mobility: Origin and fate of conjugative and nonconjugative plasmids.</a> Molecular Biology and Evolution. 39 (6), 1-23 (2022).</li>
<li>Bevan, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+plasmids+encoding+blaCTX-M+from+faecal+Escherichia+coli+in+travellers+returning+to+the+UK+from+South+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of plasmids encoding blaCTX-M from faecal Escherichia coli in travellers returning to the UK from South Asia.</a> The Journal of Hospital Infection. 114, 134-143 (2021).</li>
<li>Minja, C. A., Shirima, G., Mshana, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+plasmids+disseminating+CTX-M-15+among+human%2C+animals+and+the+environment+in+Mwanza+Tanzania%3A+a+need+to+intensify+one+health+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Conjugative plasmids disseminating CTX-M-15 among human, animals and the environment in Mwanza Tanzania: a need to intensify one health approach.</a> Antibiotics. 10 (7), 836(2021).</li>
<li>Carattoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmids+and+the+spread+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Plasmids and the spread of resistance.</a> International Journal of Medical Microbiology. 303 (6-7), 298-304 (2013).</li>
<li>Sengupta, M., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+significance+of+plasmid+maintenance+functions+in+the+virulence+plasmids+of+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Prevalence and significance of plasmid maintenance functions in the virulence plasmids of pathogenic bacteria.</a> Infection and Immunity. 79 (7), 2502-2509 (2011).</li>
<li>Alderliesten, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+donor-recipient+relatedness+on+the+plasmid+conjugation+frequency%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effect of donor-recipient relatedness on the plasmid conjugation frequency: a meta-analysis.</a> BMC Microbiology. 20 (1), 135(2020).</li>
<li>Neil, K., Allard, N., Rodrigue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+influencing+bacterial+conjugation+in+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms influencing bacterial conjugation in the intestinal microbiota.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 673260(2021).</li>
<li>Liu, G., Bogaj, K., Bortolaia, V., Olsen, J. E., Thomsen, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-induced%2C+increased+conjugative+transfer+is+common+to+diverse+naturally+occurring+ESBL+plasmids+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-induced, increased conjugative transfer is common to diverse naturally occurring ESBL plasmids in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 2119(2019).</li>
<li>Suchman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+for+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction protocol.</a> American Society for Microbiology. , 1-14 (2011).</li>
<li>Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+heredity+of+multiple+drug+resistance+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria.</a> Bacteriological Reviews. 27 (1), 87-115 (1963).</li>
<li>Simonsen, L., Gordon, D. M., Stewart, F. M., Levin, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+rate+of+plasmid+transfer%3A+an+end-point+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Estimating the rate of plasmid transfer: an end-point method.</a> Journal of General Microbiology. 136 (11), 2319-2325 (1990).</li>
<li>Huisman, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+plasmid+conjugation+rates%3A+A+new+computational+tool+and+a+critical+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Estimating plasmid conjugation rates: A new computational tool and a critical comparison of methods.</a> Plasmid. 121, 102627(2022).</li>
<li>Jung, B., Hoilat, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MacConkey+medium%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls%22%5BJournal%5D)">MacConkey medium.</a> StatPearls. , StatPearls Publishing. (2022).</li>
<li>NucleoSpin Plasmid DNA purification. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mn-net.com/media/pdf/45/51/02/Instruction-NucleoSpin-Plasmid.pdf">https://www.mn-net.com/media/pdf/45/51/02/Instruction-NucleoSpin-Plasmid.pdf</a> (2022).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+extended-spectrum+beta-lactamases+in+clinical+isolates+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Detection of extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (9), 2990-2995 (2006).</li>
<li>Stapleton, P. D., Shannon, K. P., French, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbapenem+resistance+in+Escherichia+coli+associated+with+plasmid-determined+CMY-4+beta-lactamase+production+and+loss+of+an+outer+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Carbapenem resistance in Escherichia coli associated with plasmid-determined CMY-4 beta-lactamase production and loss of an outer membrane protein.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (5), 1206-1210 (1999).</li>
<li>Ben Yahia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+CTX-M-15+harboring+Escherichia+coli+isolated+from+wild+birds+in+Tunisia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of CTX-M-15 harboring Escherichia coli isolated from wild birds in Tunisia.</a> BMC Microbiology. 18 (1), 26(2018).</li>
<li>Madsen, L., Aarestrup, F. M., Olsen, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+streptomycin+resistance+determinants+in+Danish+isolates+of+Salmonella+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterisation of streptomycin resistance determinants in Danish isolates of Salmonella Typhimurium.</a> Veterinary Microbiology. 75 (1), 73-82 (2000).</li>
<li>Perreten, V., Boerlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+sulfonamide+resistance+gene+%28sul3%29+in+Escherichia+coli+is+widespread+in+the+pig+population+of+Switzerland%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerland.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (3), 1169-1172 (2003).</li>
<li>Guardabassi, L., Dijkshoorn, L., Collard, J. M., Olsen, J. E., Dalsgaard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+in-vitro+transfer+of+tetracycline+resistance+determinants+in+clinical+and+aquatic+Acinetobacter+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains.</a> Journal of Medical Microbiology. 49 (10), 929-936 (2000).</li>
<li>Carattoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+plasmids+by+PCR-based+replicon+typing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of plasmids by PCR-based replicon typing.</a> Journal of Microbiological Methods. 63 (3), 219-228 (2005).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2019 (1), (2019).</li>
<li>Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SYBR+Green+I+nucleic+acid+gel+stain+mutagenicity+and+ethidium+bromide+mutagenicity+in+the+Salmonella%2Fmammalian+microsome+reverse+mutation+assay+%28Ames+test%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test).</a> Mutation Research. 439 (1), 37-47 (1999).</li>
<li>Tuma, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+SYBR+Gold+nucleic+acid+gel+stain%3A+a+dye+optimized+for+use+with+300-nm+ultraviolet+transilluminators%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators.</a> Analytical Biochemistry. 268 (2), 278-288 (1999).</li>
<li>Oatey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+fluorescently+stained+DNA+with+CCD+technology+How+to+increase+sensitivity+and+reduce+integration+times%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Imaging fluorescently stained DNA with CCD technology How to increase sensitivity and reduce integration times.</a> Biotechniques. 42 (3), 376-377 (2007).</li>
<li>Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+plasmids%3A+vessels+of+the+communal+gene+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Conjugative plasmids: vessels of the communal gene pool.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 364 (1527), 2275-2289 (2009).</li>
<li>Du, L., Liu, R. H., Ying, L., Zhao, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+intergeneric+conjugation+of+DNA+from+Escherichia+coli+to+mycelia+of+the+lincomycin-producer+Streptomyces+lincolnensis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">An efficient intergeneric conjugation of DNA from Escherichia coli to mycelia of the lincomycin-producer Streptomyces lincolnensis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 4797-4806 (2012).</li>
<li>Kirk, J. A., Fagan, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+increases+conjugation+efficiency+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Heat shock increases conjugation efficiency in Clostridium difficile.</a> Anaerobe. 42, 1-5 (2016).</li>
<li>Esteves, G. M., Pereira, J. A., Azevedo, N. F., Azevedo, A. S., Mendes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+with+benefits%3A+An+inside+look+of+periodontal+microbes%27+interactions+using+fluorescence+in+situ+hybridization-Scoping+review%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Friends with benefits: An inside look of periodontal microbes' interactions using fluorescence in situ hybridization-Scoping review.</a> Microorganisms. 9 (7), 1504(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Plazmidy koniugacyjne zapewniają dostęp do wspólnej puli genów w określonym środowisku środowiskowym poprzez rekombinację i horyzontalny transfer genów34. Tak więc plazmidy koniugatywne są jednostkami ewolucyjnymi zdolnymi do nabywania i nadawania funkcji, które pozwalają bakteriom przystosować się do wielu warunków (w tym między innymi oporności na antybiotyki, odporności na metale, nabywania metali, tworzenia biofilmu i genów chorobotwórczych) w skali czasowej godzin.
W pracy przedstawiono protokół identyfikacji plazmidów koniugacyjnych u bakterii. Aby protokół działał, użyte markery muszą różnicować szczepy dawcy i biorcy, jak pokazano w kontrolach w pożywkach A i B. Muszą również skutecznie selekcjonować komórki przenoszące plazmid. Reakcja godowa jest krytyczna. W tej reakcji dawcy i biorcy muszą nawiązać przedłużony kontakt (poprzez pilusy), aby doszło do koniugacji. Wszystko, co może zakłócić kontakt międzykomórkowy, takie jak niewystarczający czas inkubacji lub potrząsanie lub mieszanie kultury, zmniejsza w ten sposób efektywność koniugacji. Wybór biorcy jest również krytyczny, ponieważ niektóre szczepy biorcy są oporne na koniugację35,36. LMB100 jest proponowany jako biorca z wyboru, ponieważ jest w stanie przyjmować plazmidy o wielu typach niezgodności.
Szybkość koniugacji jest specyficzna dla każdej pary chromosomów plazmid-dawca, biorcy i warunków środowiskowych. Stwierdzono, że koniugacja specyficznych plazmidów jest wrażliwa na wiele zmiennych, w tym fazę wzrostu, gęstość komórek, stosunek dawcy do biorcy, to, czy koniugacja odbywa się w środowisku ciekłym czy stałym, węgiel, tlen, sole żółciowe, stężenia metali, obecność komórek ssaków, temperaturę, pH i czas krycia 13,14,15. Badanie tych interakcji zależy od początkowego wykrycia plazmidu sprzęgającego, który ma być dogłębnie zbadany. W związku z tym opisany tutaj protokół może być również modyfikowany w celu zbadania wpływu różnych zmiennych eksperymentalnych, chociaż odbywa się to kosztem ograniczenia liczby przebadanych dawców. Może również identyfikować mobilizowalne plazmidy u gospodarzy, którzy mają plazmidy pomocnicze (tj. plazmidy, które umożliwiają koniugację, zapewniając funkcje, których brakuje w mobilizowalnych plazmidach w trans6).
Znajomość sekwencji plazmidu koniugacyjnego jest zalecana (ale nie jest konieczna do wykrycia koniugacji, jak omówiono powyżej). Gdy dawcy są ujemni pod względem laktozy (produkują żółte kolonie na agarze MacConkey), biorca dodatni pod względem laktozy (wytwarzający różowe kolonie na agarze MacConkey) może być użyty do odróżnienia prawdziwych transkoniugantów od komórek dawcy, które są w stanie rosnąć na pożywce w celu wybrania transkoniugancji. Opisany tutaj protokół ma na celu wykrywanie plazmidów koniugacyjnych od środowiskowych, komensalnych i patogennych członków rodziny Enterobacteriaceae; Można go jednak stosować z dowolnymi gatunkami bakterii z odpowiednim dawcą, biorcą, antybiotykiem (antybiotykami) i markerami kolorowymi. Identyfikacja tych krytycznych składników w innych bakteriach wymaga systematycznych badań z wykorzystaniem wielu dawców, biorców i markerów (antybiotyków i barwników). Protokół ten nie został przetestowany na bakteriach Gram-dodatnich.
Kilka wariantów przedstawionej tu metody zostało opisanych w literaturze, ostatnio recenzowanej20. Wynik jakościowy może być również odniesiony na różne sposoby (np. częstość koniugacji i częstotliwość transferu genów), a jednostki bezwymiarowe mogą być używane do raportowania wydajności koniugacji (mL/CFU x h)20.
Opisany tutaj protokół rozwiązuje kilka ograniczeń, które wcześniej nie były rozwiązywane przez istniejące metody 16,18,19,20. W pierwszej kolejności zidentyfikowano odpowiedniego odbiorcę. Po drugie, zastosowanie dwóch antybiotyków (ryfampicyny i streptomycyny) do selekcji prawdziwych transkoniugantów minimalizuje możliwość, że dawcy wyewoluują oporność na jeden z antybiotyków stosowanych do selekcji transkoniugantów poprzez spontaniczną mutagenezę. Fałszywe transkoniuganty mogą również wynikać z ochrony osób postronnych przez hydrolizę antybiotyku stosowanego do selekcji transkoniugantów przez enzymy (np. beta-laktamazy) wytwarzane w dużych ilościach przez dawcę. Po trzecie, uwzględniono kilka eksperymentalnych kontroli w celu zapewnienia, że produkt krycia jest prawdziwym transkoniugantem (tj. komórką biorcy, która stabilnie włączyła koniugacyjny plazmid dawcy). Tutaj przedstawiliśmy dwie niezależne metody badania autentyczności transkoniugantów, a mianowicie marker kolorymetryczny w agarze MacConkey oraz wykrywanie PCR replikonów i genów oporności na antybiotyki plazmidu koniugacyjnego u biorcy. Opisany tutaj protokół ma również na celu wyizolowanie i scharakteryzowanie koniugacyjnych plazmidów od środowiskowych, komensalnych i patogennych członków rodziny Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella i inne gatunki).
Aby zrozumieć mechanikę koniugacji, obserwacje eksperymentalne zostały zamodelowane za pomocą symulacji komputerowych. Te modele predykcyjne szacują częstotliwość transferu plazmidu dla danej gęstości wzrostu dawców, biorców i transkoniugantów. Model znany jako model punktu końcowego znalazł progi, powyżej których szybkość transferu plazmidu w płynnej hodowli i stwierdził, że na szybkość transferu nie ma wpływu gęstość komórek, stosunek dawcy do biorcy i czas krycia19. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) została wykorzystana jako alternatywna metoda transkoniugacyjnego wykrywania plazmidu. FISH umożliwia wizualizację plazmidu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej poprzez hybrydyzację sondy DNA i docelowego DNA. W związku z tym FISH umożliwia wizualne wykrywanie przepływów plazmidów w różnych populacjach komórek37, chociaż nie ma takiego samego poziomu czułości jak metoda przedstawiona tutaj, jeśli transkoniuganty są wykrywane przez wizualne badania przesiewowe, a nie selekcję.
Istnieje ogromna potrzeba zrozumienia biologii plazmidów koniugacyjnych, które dyspersują geny oporności na antybiotyki w różnych składnikach ekosystemu (kliniki, rolnictwo, ścieki, dzika przyroda, zwierzęta domowe, gleby, rzeki i jeziora). Podsumowując, uproszczone warunki eksperymentalne przedstawione w opisanych tutaj protokołach ułatwiają badania przesiewowe dawców na dużą skalę, a tym samym stanowią kluczowe narzędzie do badania horyzontalnego transferu genów pochodzących z plazmidów koniugacyjnych z różnych źródeł. Można je wykorzystać do zbadania częstości występowania genów oporności na antybiotyki lub innych klinicznie istotnych genów w koniugacyjnych plazmidach pochodzących z wielu źródeł i bakterii. Można je również zaadaptować do badania koniugacji in vivo (np. w jelitach kręgowców) oraz do badania warunków, które modulują skuteczność koniugacji. Wszystkie te badania znacznie przyczynią się do zrozumienia, w jaki sposób mobilizacja wielolekoopornych plazmidów koniugacyjnych przyczynia się do rozprzestrzeniania się oporności wielolekowej.

W 1946 roku Lederberg i Tatum1 opisali proces seksualny u Escherichia coli K-12, który obecnie znany jest jako koniugacja. Koniugacja bakteryjna to proces, w którym komórka bakteryjna (donor) przenosi materiał genetyczny w sposób jednokierunkowy do innej komórki (recypienta) poprzez bezpośredni kontakt międzykomórkowy. Koniugacja jest szeroko rozpowszechniona wśród bakterii2,3, choć frakcja komórek donora wykazujących aparat koniugacyjny jest zazwyczaj bardzo mała4.
Plazmidy są autonomicznie replikującymi się pozachromosomalnymi elementami DNA. Oprócz genów zaangażowanych w replikację i utrzymanie plazmidu, plazmidy często przenoszą zestaw genów odpowiedzialnych za adaptację do wyzwań środowiskowych, takich jak metale ciężkie lub ekspozycja na antybiotyki5. Plazmidy koniugacyjne to klasa plazmidów posiadających zestaw wyspecjalizowanych genów, które umożliwiają ich transfer do komórek biorców i wspierają ich utrzymanie po transferze6. Plazmidy koniugacyjne u bakterii z typu Pseudomonadota (synonim Proteobacteria) różnią się wielkością od 21.8 kb do 1.35 Mb, przy czym mediana wynosi około 100 kb5,7. Zazwyczaj charakteryzują się one również niską liczbą kopii, co prawdopodobnie ma na celu zminimalizowanie obciążenia metabolicznego gospodarza8,9.
Typowy aparat koniugacyjny składa się z czterech komponentów: miejsca rozpoczęcia transferu (oriT), relaksazy, białka sprzęgającego typu IV oraz systemu sekrecji typu IV (struktury przypominającej rurkę, nazywanej pilusem, która umożliwia kontakt dawców z biorcami)6. Tylko niewielka frakcja komórek niosących plazmidy koniugacyjne wykazuje ekspresję maszynerii koniugacyjnej4, jednak jeśli plazmidy zapewniają korzyść adaptacyjną, transkonjuganty mogą gwałtownie zwiększyć swoją liczebność w populacji. Od 35% do ponad 80% izolatów E. coli pobranych z różnych siedlisk posiada plazmidy koniugacyjne z genami nadającymi oporność na co najmniej jeden antybiotyk10,11; w związku z tym horyzontalny transfer genów pośredniczony przez plazmidy koniugacyjne jest głównym mechanizmem napędzającym globalne rozprzestrzenianie się genów oporności na antybiotyki12.
Eksperymenty z kojeniem prowadzone w hodowlach laboratoryjnych wykazały, że na częstotliwość konjugacji wpływa wiele czynników, w tym charakter komórek biorców, faza wzrostu, gęstość komórek, stosunek dawcy do biorcy, to czy konjugacja odbywa się w podłożu płynnym czy stałym, węgiel, tlen, sole żółciowe, stężenia metali, obecność komórek ssaków, temperatura, pH oraz czas kojenia13,14,15.
Niniejsza praca opisuje protokoły służące do wykrywania obecności plazmidów koniugacyjnych w danym szczepie gospodarza, do ilościowego określania szybkości koniugacji w kulturze stałej oraz do weryfikacji ich transferu do komórek biorcy. Protokoły te mogą być wykorzystane jako pierwszy etap identyfikacji naturalnych plazmidów koniugacyjnych odpowiednich do badań. Opierają się one na minimalnej liczbie uproszczonych kroków, ponieważ zostały zaprojektowane do masowego przesiewania obecności plazmidów koniugacyjnych w bakteriach pochodzących z wielu źródeł (środowiskowych, komensalnych i patogennych) w dużej skali (od kilkudziesięciu do kilkuset dawców).
Dodatkowo przedstawiono testy mające na celu ustalenie, czy mobilizacja danego plazmidu koniugacyjnego jest niezależna od antybiotyku użytego do detekcji (tj. czy istotny jest gen oporności na antybiotyk poddanego selekcji), a także porównano szybkości koniugacji dwóch plazmidów koniugacyjnych znalezionych w różnych izolatach środowiskowych.
W oparciu o skład genetyczny odpowiednich plazmidów koniugacyjnych (replikon plazmidowy i zestaw genów oporności na antybiotyki), każdy krok protokołu można zmodyfikować, aby zbadać wpływ różnych czynników, które mogą wpływać na szybkość koniugacji.
Ogólny schemat doświadczenia: 
Podstawowe elementy niezbędne do przygotowania eksperymentu z kojeniem to komórki donora, szczep biorcy oraz podłoża stałe umożliwiające selekcję donorów (antybiotyk A), biorców (antybiotyk B) oraz transkonjugantów (antybiotyk A i B). Transkonjuganty to komórki biorcy, które stabilnie utrzymują plazmid koniugacyjny donora.
Komórki donora są oporne na antybiotyk (antybiotyk A) i wrażliwe na marker lub markery stosowane do selekcji komórek biorcy (antybiotyk B). Lokalizacja genomowa genu oporności na antybiotyk (t.j..(niezależnie od tego, czy znajduje się on w chromosomie, czy w plazmidzie komórki donora) nie musi być znana a prioriponieważ mobilizacja markerów oporności na antybiotyki do biorcy (po bezpośrednim kontakcie dawca-biorca) oznacza, że markery dostarczone przez dawcę znajdowały się w plazmidzie.
Szczep biorcy (zdolny do przyjmowania plazmidów koniugacyjnych) musi posiadać stabilny marker selekcyjny, który nie występuje u donora; markerem tym jest zazwyczaj oporność na antybiotyk lub biocyd zlokalizowana w chromosomie. Wybór biorcy do eksperymentów z kojeniem jest krytyczny, ponieważ niektóre szczepy E. coli różnią się zdolnością do przyjmowania plazmidów koniugacyjnych16.
Po ustaleniu tych parametrów każda kolonia, która urośnie na podłożu zawierającym oba antybiotyki (A i B) po kontakcie pary dawca-biorca, jest domniemanym transkonjugantem (Rysunek 1). Przyjmuje się tutaj, że dawcy mogą rosnąć na podłożu z antybiotykiem A, ale nie mogą rosnąć na podłożu z antybiotykiem B, natomiast biorcy są w stanie rosnąć na podłożu z antybiotykiem B, ale nie mogą rosnąć na podłożu z antybiotykiem A. Transkonjugację można potwierdzić za pomocą dwóch testów diagnostycznych. Pierwszy test polega na wykryciu (poprzez amplifikację genów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy [PCR] lub innymi metodami) genów znajdujących się w plazmidzie koniugacyjnym w koloniach transkonjugantów. Drugi test wykorzystuje różnicowe markery koloru kolonii oparte na metabolizmie laktozy. Różnicowy kolor kolonii ujawnia się przy użyciu agaru MacConkey; laktoza w agarze może służyć jako źródło fermentacji dla mikroorganizmów fermentujących laktozę (lac+). Mikroorganizmy te wytwarzają kwasy organiczne, w szczególności kwas mlekowy, który obniża pH. Czerwony neutralny jest wskaźnikiem pH zawartym w podłożu, który zmienia barwę z białej na jaskrawoczerwoną/różową, gdy pH spadnie poniżej 6.817. W związku z tym szczepy E. coli laktozowo-dodatnie tworzą na agarze MacConkey większe różowe kolonie, podczas gdy szczepy laktozowo-ujemne tworzą na agarze MacConkey bladożółte i mniejsze kolonie.
<img alt="Schemat transferu plazmidu koniugacyjnego; wymiana plazmidów, oporność na antybiotyki, analiza PCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Projekt eksperymentalny wykorzystany do wykrywania obecności plazmidów koniugacyjnych w szczepach dawców. W tym przykładzie dawca posiada plazmid koniugacyjny z genem oporności na antybiotyki, który nadaje oporność na antybiotyk A, lecz jest on wrażliwy na antybiotyk B. Z kolei biorca posiada chromosomowy determinant oporności, który zapewnia ochronę przed antybiotykiem B, lecz jest wrażliwy na antybiotyk A. Transkonjuganty są oporne na oba antybiotyki (A i B), ponieważ posiadają plazmid koniugacyjny dawcy nadający oporność na antybiotyk A oraz chromosom biorcy zapewniający ochronę przed antybiotykiem B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Współczynnik koniugacji dla pary dawca-biorca (w określonych warunkach eksperymentalnych) można obliczyć, dzieląc liczbę transkonjugantów przez liczbę dawców lub przez liczbę biorców; pierwszy współczynnik wskazuje ułamek komórek dawców wykazujących funkcjonalną ekspresję aparatury koniugacyjnej przez dawcę.16,18, podczas gdy druga wartość wskazuje na zdolność biorcy do przyjmowania plazmidów koniugacyjnych19,20W niniejszym badaniu, o ile nie zaznaczono inaczej, częstość koniugacji reprezentuje ułamek komórek biorcy, które stają się transkonjugantami (tj.., stawka na odbiorcę).
W niniejszej pracy opisano dwa niezależne eksperymenty kojarzenia z udziałem jednego biorcy E. coli i dwóch dawców E. coli. Ponadto, w celu potwierdzenia, że pojedynczy plazmid wielolekooporny może być selekcjonowany za pomocą dowolnego z genów oporności na antybiotyki obecnych w plazmidzie koniugacyjnym, zastosowano różne antybiotyki do selekcji transkonjugantów dla jednego z dawców.
Szczepy dawcy i biorcy wykorzystane w niniejszej pracy zostały w pełni zsekwencjonowane, aby zrozumieć wszystkie komponenty tego układu eksperymentalnego; jednak protokoły te zostały opracowane w celu wykrywania obecności plazmidów koniugacyjnych u gospodarzy o nieznanej sekwencji i mogą być stosowane również w takim kontekście eksperymentalnym, przy czym w tym przypadku odpowiednie geny są najpierw sekwencjonowane.
Szczepy dawcy i biorcy użyte w protokole to:
Dawca 1. E. coli SW4955 została wyizolowana z jeziora w Baton Rouge (LA, USA). Posiada ona koniugacyjny plazmid o wielkości 134 797 bp (p134797) z replikonami IncFIC(FII) i IncFIB (AP001918). Plazmid koniugacyjny ten zawiera geny nadające oporność na cefalosporyny trzeciej generacji (blaCTX-M-55), aminoglikozydy (aac(3)-IIa i aadA1), fenikole (catA2), tetracykliny (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) oraz sulfonamidy (sul3). Pełna mapa p134797 przedstawiona jest na Ryc. 2A. E. coli SW4955 jest laktozowo-dodatnia i tworzy różowe kolonie na agarze MacConkey.
Dawca 2. E. coli SW7037 została pobrana z jeziora Erie (hrabstwo Ottawa, OH, USA). Posiada ona koniugacyjny plazmid o długości 101 718 bp (p101718) z replikonem IncI1-I(Alpha). Ten plazmid koniugacyjny zawiera gen nadający oporność na beta-laktamy (blaCMY-2). Pełną mapę p101718 przedstawiono na Rysunku 2B. E. coli SW7037 jest również laktozowo-dodatnia, tworząc różowe kolonie na agarze MacConkeya.
<img alt="Mapy plazmidów E. coli z adnotacjami genów oporności, 134797 bp i 101718 bp, na schemacie porównawczym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Mapa genetyczna plazmidów koniugacyjnych użytych w tej badaniu. (A) Plazmid p134797, plazmid koniugacyjny znaleziony w szczepie E. coli SW4955. (B) Plazmid p101718, plazmid koniugacyjny znaleziony w szczepie E. coli SW7037. Geny oporności na antybiotyki są zaznaczone na niebiesko, a geny należące do aparatu koniugacyjnego są zaznaczone na czerwono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Biorca. Jako biorca wykorzystuje się szczep E. coli LMB100. Jest to szczep pozbawiony plazmidów, oporny na rifampicynę (100 mg/L) oraz streptomycynę (100 mg/L). Posiadanie oporności na dwa antybiotyki zmniejsza prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji oporności u donora, co mogłoby zakłócić interpretację wyników. Dodatkowo E. coli LMB100 jest laktozo-ujemny i można go odróżnić od dwóch szczepów donora, ponieważ na agarze MacConkey tworzy on małe, bladożółte kolonie (w przeciwieństwie do większych, różowych kolonii).
W przypadku, gdy dawca jest laktozo-ujemny, zaleca się użycie biorcy laktozo-dodatniego (np. E. coli J53). Szczepy LMB100 i J53 są dostępne dla innych laboratoriów. Prosimy o przesłanie zapytania do dr. Gerardo Cortés-Cortés wraz z adresem i numerem FedEx.
Pożywką stałą niezbędną do selekcji i zliczania dawców, biorców oraz transkonjugantów jest agar MacConkey w szalkach Petriego o średnicy 100 mm. Wymagane jest dodanie następujących antybiotyków: (i) Pożywka A: karbenicylina (100 mg/L) w celu zliczenia dawców oraz upewnienia się, że biorcy nie rosną w obecności tego antybiotyku. (ii) Pożywka B: ryfampicyna (100 mg/L) + streptomycyna (100 mg/L) w celu zliczenia biorców oraz upewnienia się, że dawcy nie rosną w obecności tych dwóch antybiotyków. (iii) Pożywka AB: karbenicylina (100 mg/L) + ryfampicyna (100 mg/L) + streptomycyna (100 mg/L) w celu uzyskania i zliczenia transkonjugantów. (iv) Pożywka C: bez antybiotyków do wysiewania wszystkich badanych izolatów.
Porównano szybkości koniugacji plazmidów koniugacyjnych z E. coli SW4955 i E. coli SW7037 do E. coli LMB100. Ponadto, w przypadku plazmidu koniugacyjnego p134797 (szczep SW4955), w kolejnych eksperymentach zastąpiono antybiotyk karbenicylinę (100 mg/L) gentamycyną (2 mg/L), chloramfenikolem (25 mg/L), tetracykliną (10 mg/L), trimetoprimem (20 mg/L) lub sulfametoksazolem (100 mg/L), aby ustalić, czy marker oporności na antybiotyki użyty do selekcji ma jakikolwiek wpływ na wyniki.

<table><tbody><tr><td>Stojaki na probówki 1,5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-313630</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>2,0 ml Fiolki kriogeniczne</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 14 ml</td><td>FALCON</td><td>149597</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Stojaki na probówki 14 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8850</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>1 kb drabinka DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N0552G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kolby sterylne 250 ml&nbsp;</td><td>PYREX</td><td>5320</td><td>Można go wymienić na marker permanentny innej marki</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38SI-212</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Agaroza (klasa biologii molekularnej, wielofunkcyjna)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Karbenicylina</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>C-103-50</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Jednorazowe pętle inokulacyjne: 1 i mikro; L</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-595</td><td>Można go wymienić na inny barwnik</td></tr><tr><td>ładujący żel DNA innej marki 6x&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP119-500</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Elektroniczna waga cyfrowa</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-2001</td><td>Można go wymienić na inną</td></tr><tr><td>markę Rurki stożkowe Eppendorf: 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>14-282-302</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Sprzęt do elektroforezy w żelu agarozowym</td><td>Fisher Scientific</td><td>FP300</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Markery odporne na etanol</td><td>Sharpie</td><td>37001; 37002; 37003</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Systemy dokumentacji żeli (UVP GelSolo)</td><td>Analytakjena</td><td>SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Rękawice</td><td>X-GEN</td><td>44-100M</td><td>Działa dowolna marka rękawic nitrylowych</td></tr><tr><td>Wiaderko do lodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>432128</td><td>Można go wymienić na inny agar</td></tr><tr><td>MacConkey innej marki&nbsp;</td><td>BD DIFCO</td><td>212123</td><td></td></tr><tr><td>Master Mix&nbsp;</td><td>BioLabs</td><td>M0496S&nbsp;</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek: 2,0 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-138</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Agar Mueller Hinton</td><td>BD DIFCO</td><td>DF0479-17-3</td><td></td></tr><tr><td>Rosół Mueller Hinton</td><td>BD DIFCO</td><td>275730</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid, Mini zestaw do plazmidowego DNA</td><td>Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL</td><td>740588. 250</td><td></td></tr><tr><td>stojaków na probówki do PCR</td><td>AXYGEN&nbsp;</td><td>&nbsp; R96PCRFSP</td><td>Można go wymienić na</td></tr><tr><td>probówki PCR innej marki (0,2 ml)</td><td>AXYGEN&nbsp;</td><td>PCR-02-C</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-164-7517</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw mikropipet dozujących od 1 do 10 mu; L (P10), 2&ndash; 20 &mu; L (P20), 20&ndash; 200 &mu; L (P200) oraz 200&ndash; 1000 &mu; L (P1000)</td><td>RAININ</td><td>17008648; 17008650; 17008652; 17008653</td><td>Mikropipety powinny być skalibrowane; można wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Thermo Scientific</td><td>335905P</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Sterylizowane końcówki do 10 &mu; L, 200 &mu; L oraz 1000 &mu; L&nbsp;</td><td>Zaćmienie</td><td>1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczny żel DNA barwnik&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraza</td><td>BioLabs</td><td>M0273S</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler C1000 Dotyk&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td>Można go wymienić na inną markę</td></tr></tbody></table>

wykrywanie horyzontalnego transferu genów, w którym pośredniczą naturalne plazmidy koniugacyjne w e. coli

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Koniugacja stanowi jeden z głównych mechanizmów ułatwiających horyzontalny transfer genów u bakterii Gram-ujemnych. W pracy opisano metody badania mobilizacji naturalnie występujących plazmidów koniugacyjnych na przykładzie dwóch naturalnie występujących plazmidów. Protokoły te opierają się na zróżnicowanej obecności wybieralnych markerów w plazmidzie dawcy, biorcy i koniugatora. W szczególności opisane metody obejmują: 1) identyfikację naturalnych plazmidów koniugacyjnych, 2) kwantyfikację szybkości koniugacji w kulturze stałej oraz 3) diagnostyczne wykrywanie genów oporności na antybiotyki i typów repliconów plazmidowych u biorców transkoniugantów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Opisane tutaj protokoły zostały opracowane w kontekście badania ekologii ewolucyjnej horyzontalnego transferu genów w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem obecności plazmidów koniugacyjnych przenoszących geny oporności na antybiotyki u bakterii występujących w środowisku. Efektywny transfer plazmidów koniugacyjnych zaobserwowany w tych eksperymentach w kulturze podkreśla biologiczne znaczenie koniugacji jako mechanizmu promującego horyzontalny transfer genów w ogóle, a rozprzestrzenianie się oporności na antybiotyki w szczególności.

Biorąc pod uwagę, że szczepy donora SW4955 i SW7037 zostały zsekwencjonowane, oczekuje się, że oba te szczepy będą wykazywać fenotypy oporności odpowiadające profilowi genów oporności zidentyfikowanemu w ich sekwencji genomowej. Plazmid p134797 (z SW4955) posiada geny nadające oporność na cefalosporyny trzeciej generacji (blaCTX-M-55), a także oporność na aminoglikozydy (aac(3)-IIa i aadA1), fenikole (catA2), tetracykliny (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) i sulfonamidy (sul3); w chromosomie SW4955 nie znaleziono genów oporności na antybiotyki. Plazmid p101718 (z SW7037) niesie tylko jeden gen oporności na antybiotyki (blaCMY-2), który prawdopodobnie nadaje oporność na cefalosporyny trzeciej generacji (blaCTX-M-55). Ponownie, w chromosomie SW7037 nie znaleziono genów oporności na antybiotyki.
Po kojeniu oczekiwano wykrycia transferu dwóch plazmidów koniugacyjnych niosących wszystkie wspomniane powyżej geny oporności. Pozytywny wynik wykrywania koniugacji oznacza, że biorcy zidentyfikowani jako transkonjuganty powinny nabyć plazmidy koniugacyjne. Oczekiwano również obecności diagnostycznych genów oporności dla plazmidów koniugacyjnych w transkonjugantach (wykrytej za pomocą PCR).
Aby zilustrować opisane tutaj metody, przetestowano zdolność dwóch izolatów środowiskowych E. coli do przenoszenia plazmidowego DNA drogą koniugacji. Schematyczny przedstawienie układu eksperymentalnego pokazano na Rysunku 1. Dwa szczepy donora (E. coli SW4955 i SW7037) oraz jeden szczep biorcy (E. coli LMB100) poddano niezależnym procesom koniugacji. Mapa genetyczna plazmidów koniugacyjnych znalezionych w E. coli SW4955 (p134797) i SW7037 (p101718) przedstawiona jest na Rysunku 2.
Plazmidy koniugacyjne wyselekcjonowano za pomocą karbenicyliny, a kontrselekcję przeprowadzono przy użyciu ryfampicyny i streptomycyny, których determinanty oporności znajdują się w chromosomie biorcy. Agar MacConkeya został wykorzystany do odróżnienia dawców laktozo-dodatnich (które tworzą duże, różowe kolonie) od biorcy i transkonjugantów (które są laktozo-ujemne i tworzą mniejsze, bladożółte kolonie) (Rysunek 3).
<img alt="Porównanie wzrostu bakterii na płytkach z agarem; zbliżenie kolonii od dawców SW4955, SW7037 oraz biorcy LMB100." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ilustracja różnicujących markerów koloru dla kolonii dawców i biorców na agarze MacConkey. Kolonie odpowiadające dawcom są różowe na agarze MacConkey, ponieważ są laktozo-dodatnie. Pozwala to odróżnić kolonie dawców od kolonii biorców, które są bladożółte i mniejsze (laktozo-ujemne). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wykryto mobilizację plazmidu koniugacyjnego p134797, przy czym każdy z pięciu antybiotyków odpowiadał pięciu różnym klasom genów oporności obecnych w plazmidzie.
Przedstawiono przykład obliczania wydajności koniugacji (CE) dla szczepu SW4955. W badaniu z użyciem szczepu SW4955 na płytce z rozcieńczeniem 10-2 naliczono 172 CFU transkonjugantów; liczba biorców z odpowiadającego rozcieńczenia (10-2) wyniosła 10 300 000 CFU/mL (Tabela 4).
Wartość CE oblicza się w następujący sposób:
CE = (174 CFU/mL)/(10,300,000 CFU/mL)
CE= 1,67 x 10-5 transkonjugantów/biorcy
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">LMB100</td>
			<td>Transkonjuganty szczepu SW4955 wyselekcjonowane na karbelicylinie</td>
			<td rowspan="2">Wydajność koniugacji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozcieńczenie</td>
			<td>CFU (płytka zliczalna)</td>
			<td>Przybliżone CFU/mL</td>
			<td>CFU (płytka zliczalna)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>zrośnięte</td>
			<td>1.03E+09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-1</td>
			<td>zrośnięte</td>
			<td>1.03E+08</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-2</td>
			<td>zrośnięte</td>
			<td>10300000</td>
			<td>172</td>
			<td>1.67 x 10-5 transkonjugantów/rekrypienta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-3</td>
			<td>zrośnięte</td>
			<td>1030000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-4</td>
			<td>zrośnięte</td>
			<td>103000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-5</td>
			<td>zrośnięte</td>
			<td>10300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-6</td>
			<td>zrośnięte</td>
			<td>1030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-7</td>
			<td>103</td>
			<td>103</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">Wartości wykorzystane do obliczenia CE są zaznaczone pogrubieniem.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Przykład obliczania wydajności koniugacji (CE) dla szczepu SW4955.
Wyniki przedstawiono w Tabeli 5, wyrażone jako wydajność koniugacji na biorcę. Pięć wartości wydajności koniugacji uzyskanych z wykorzystaniem szczepu SW4955 jako donora mieściło się w tym samym rzędzie wielkości. Wyniki te wskazują, że mobilizację plazmidu koniugacyjnego można wykryć niezależnie od rodzaju selekcji zastosowanej do identyfikacji transkonjugantów.
Przy użyciu szczepu SW7037 jako donora uzyskana wydajność koniugacji była o trzy rzędy wielkości niższa; wyniki te pozwalają na porównanie wydajności koniugacji różnych donorów i typów plazmidów przy zastosowaniu tych samych biorców.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="5">Wydajność koniugacji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szczep</td>
			<td>Karbenycylina (100 mg/L)</td>
			<td>Gentamycyna (2 mg/L)</td>
			<td>Chlorampfenikol (25 mg/L)</td>
			<td>Tetracyklina (10 mg/L)</td>
			<td>Trimetoprim (20 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW4955</td>
			<td>1,67 x 10-5</td>
			<td>5,67 x 10-5</td>
			<td>2,17 x 10-5</td>
			<td>7,62 x 10-5</td>
			<td>1,36 x 10-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW7037</td>
			<td>2,14 x 10-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Wydajność koniugacji szczepów donora E. coli SW4955 i SW7037 w zależności od antybiotyku użytego do selekcji.
W transkonjugantach obecność replikonów oraz wszystkich genów oporności zakodowanych w dwóch testowanych plazmidach koniugacyjnych, a także ich odpowiednich replikonów, sprawdzono za pomocą PCR. Warunki zastosowane w tych diagnostycznych reakcjach PCR przedstawiono w Tabeli 3.
Żele diagnostyczne przedstawiono na Rysunku 4. Żele te potwierdzają obecność oczekiwanych replikonów u transkonjugantów (IncFIC i IncFIB w p1347975 oraz IncI1 w p101718). Potwierdzają one również obecność oczekiwanych genów oporności na antybiotyki, mianowicie grupy blaCTX-M-55 (beta-laktamy), aac(3)-II i aadA (aminoglikozydy), catA2 (fenikole), tet(A) (tetracyklina), dfrA14 (trimetoprim) i sul3 (sulfonamidy) dla p1347975 oraz blaCMY-2 dla p101718 (Rysunek 4).
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej; wzory prążków DNA; drabinka 1 kb; analiza molekularna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Diagnostyczne żele elektroforetyczne. Elektroforeza żelowa produktów PCR genów oporności na antybiotyki i replikonów plazmidowych znalezionych w koniugacyjnych plazmidach p134797 i p101718 w komórkach donora (odpowiednio szczepy SW4955 i SW7037) oraz w odpowiadających im transkonjugantach LMB100. Do selekcji plazmidów użyto karbenicyliny. Skróty. -: kontrola negatywna (jako kontrolę negatywną wykorzystano DNA szczepu LMB100); D: donor; T: transkonjugant. Oczekiwane wielkości amplikonów: blaCTX-M-55: 864 pb; aac(3)-IIa: 237 bp; aadA1: 283 bp; catA2: 225 bp; tet(A): 957 bp; dfrA14: 302 bp; sul3: 799 bp; IncFIC(FII): 262 bp; IncFIB: 683 bp; blaCMY-2: 1,855 bp; IncI1-I: 139 bp. Żel zawiera 1% agarozy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Koniugacja pośredniczy w poziomym transferze genów poprzez mobilizację plazmidowego DNA przez dwie różne komórki, ułatwiając rozprzestrzenianie korzystnych genów. W pracy opisano szeroko stosowaną metodę skutecznego wykrywania sprzęgającego transferu plazmidu, opartą na zastosowaniu markerów różnicowych u plazmidu koniugacyjnego, dawcy i biorcy w celu wykrycia transkoniugacji.

Wykrywanie horyzontalnego transferu genów, w którym pośredniczą naturalne plazmidy koniugacyjne w E. coli

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the ...

Bakterie takie jak E. coli przenoszą geny oporności na antybiotyki w plazmidach koniugacyjnych. Bakterie te można znaleźć w szpitalach, żyjąc jako komensale u zwierząt oraz w środowiskach wodnych. Naturalne plazmidy koniugacyjne poziomy transfer genów między różnymi liniami bakteryjnymi.Prezentujemy metale do wykrywania plazmidów koniugacyjnych i skuteczności koniugacji powstawania. Ta technika jest prosta i wrażliwa. Jest wrażliwy, ponieważ wykorzystuje markery dla plazmidu, dawcy i biorcy.Markery te są wybieralne, co oznacza, że mogą identyfikować pojedyncze zdarzenia w bardzo dużych populacjach. Przedstawione przez nas protokoły są przydatne do badania ewolucji oporności na antybiotyki oraz do nadzoru epidemiologicznego, czyli monitorowania przepływu genów oporności na leki. Procedurę zademonstrują Caison Warner, doktorantka z mojego laboratorium, oraz Pepper St. Clair, studentka studiów licencjackich z laboratorium CAMS.Pierwszego dnia oddzielnie nałóż dawców i biorcę z zapasów glicerolu na pożywkę C, którą jest agar MacConkey bez antybiotyków i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Drugiego dnia oznacz 14-mililitrową probówkę hodowlaną dla każdego dawcy i biorcy. Wybierz pojedynczą kolonię każdego dawcy i biorcy i hoduj je w dwóch mililitrach bulionu Mueller Hinton przy 200 obr./min przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Trzeciego dnia zmierz gęstość optyczną 10-krotnie rozcieńczonej solą fizjologiczną kultury uprawianej przez noc w temperaturze 600 nanometrów bez wirowania. W razie potrzeby użyj wysterylizowanego roztworu soli fizjologicznej, aby dostosować gęstość optyczną do dwóch. Oznacz 1,5-mililitrową probówkę wirówkową jako probówkę łączącą, wskazując szczepy dawcy i biorcy.Przenieść 500 mikrolitrów dostosowanej zawiesiny każdego dawcy i biorcy do probówki współpracującej i delikatnie wymieszać zawiesinę przez odwrócenie. Odwirować probówkę współpracującą w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 500 G. Odpipetować 800 mikrolitrów supernatantu z probówki współpracującej, nie naruszając osadu, pozostawiając 200 mikrolitrów w probówce. Inkubować probówkę łączącą przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Ponadto, jako kontrolę negatywną, należy prześledzić nocną hodowlę dawców na pożywce B i biorców na pożywce A i inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji, w czwartym dniu, dodaj 800 mikrolitrów roztworu soli fizjologicznej do probówki współpracującej i ponownie zawieś przez wirowanie. Wykonać seryjne rozcieńczenia pasującej zawiesiny i dodać 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na płytkach z podłożami.Po wysuszeniu płytek inkubuj je przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i oblicz częstotliwość koniugacji na dawcę lub biorcę, jak opisano w manuskrypcie. Po wyekstrahowaniu DNA ze ścian komórkowych bakterii przy użyciu prostej metody ekstrakcji z przygotowaniem do gotowania, oznacz 1,5-mililitrową probówkę jako pulę w wymaganych probówkach PCR nazwą genu i próbki. W probówce oznaczonej jako basen dodaj sterylną wodę, mieszankę wzorcową PCR, startery i polimerazę.Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy w chłodnym miejscu. Dodaj DNA z matrycy do odpowiedniej probówki i zabezpiecz probówki PCR nakrętkami. Umieść probówki PCR w termocyklerze i uruchom program dla genów oporności i replikonów, jak opisano w manuskrypcie.W celu potwierdzenia amplikonu przygotuj 1% żel agarozowy, dodając agarozę i bufor TAE do kolby o pojemności 250 mililitrów i rozpuść agarozę za pomocą kuchenki mikrofalowej. Gdy roztwór agarozy ostygnie do około 55 stopni Celsjusza, pod wyciągiem dodaj sześć mikrolitrów SYBR Green i wymieszaj. Wlej żel do tacki uszczelnionej taśmą klejącą, aby uniknąć rozlania i pozwól żelowi zastygnąć przez 15 do 25 minut, aż pojawi się zmętnienie.Po usunięciu taśmy klejącej umieść żel w komorze elektroforetycznej i dodaj bufor TAE w celu pokrycia żelu. Wymieszaj pięć mikrolitrów sześciokrotnego barwnika ładującego żel DNA z 25 mikrolitrami każdej reakcji, pipetując w górę iw dół co najmniej 10 razy. Następnie załaduj mieszaninę do studzienek, unikając pęcherzyków.Po dodaniu czterech mikrolitrów jednej drabinki DNA z jedną parą kilozasad do pierwszej studzienki, zamknij pokrywę komory i uruchom żel na 60 minut przy napięciu 120 woltów i 400 miliamperach. Wizualizuj żel w świetle UV i zapisz obraz. Agar MacConkey rozróżniał dawców laktozo-dodatnich, którzy wytwarzali duże różowe kolonie od biorcy i transkoniugantów, którzy byli laktozo-ujemni i wytwarzali mniejsze bladożółte kolonie.Pięć wydajności koniugacji szczepu dawcy SSW4955 mieściło się w tym samym rzędzie wielkości, co wskazuje, że mobilizację plazmidu koniugacyjnego można wykryć niezależnie od selekcji użytej do identyfikacji transkoniugantu. Natomiast szczep dawcy wykazał SSW7037 trzykrotnie niższą sprawność koniugacji, co pozwala na porównanie efektywności koniugacji różnych dawców i typów plazmidów z tymi samymi biorcami. Elektroforeza żelowa produktów PCR potwierdziła obecność spodziewanych replikonów w transkoniugantach.Ten test całkowicie zależy od markerów, które można wybrać. Należy przeprowadzić kontrole w celu potwierdzenia, że każda selekcja działa, a transkoniuganty muszą być potwierdzone kolorymetrycznie lub metodą PCR. Przedstawione tutaj protokoły mogą być zaadaptowane do badania koniugacji in vivo lub modeli biofilmu, a także do badania zmiennych modulujących efektywność koniugacji.Ten protokół wykrywania zdolnych do mobilizacji plazmidów na dużą skalę znacznie wzbogaci nasze zrozumienie przepływu genów w środowisku i zbadanie zmiennych wpływających na efektywność koniugacji.

detection-horizontal-gene-transfer-mediated-natural-conjugative

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Źródło: Erdogan, F. i wsp., Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych zaangażowanych w koniugację bakteryjną. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia procedurę przenoszenia plazmidu F od dawcy do biorcy komórek E. coli przy użyciu plazmidu ratunkowego i selekcji transkoniugantów poprzez podwójną oporność na antybiotyki. Proces obejmuje mieszanie kultur bakteryjnych, inkubację bez wstrząsania, przerywanie par kojarzeniowych i posiewanie na...

F Transfer plazmidu i podwójna selekcja antybiotyków w E. coli

Tutaj prezentujemy protokół do wyeliminowania interesującego genu zaangażowanego w koniugację plazmidu, a następnie analizujemy wpływ jego braku za pomocą testów kojarzenia. Funkcja genu jest dalej badana w określonym regionie jego sekwencji za pomocą mutacji delecyjnych lub punktowych.

Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych biorących udział w koniugacji bakteryjnej

Opisujemy tutaj trzy różne protokoły do badania in vitro koniugacji, transdukcji i naturalnej transformacji u Staphylococcus aureus.

Metodologia badania horyzontalnego transferu genów u Staphylococcus aureus

Tutaj prezentujemy eksperymentalną metodę testowania roli wielokopijnych plazmidów w ewolucji oporności na antybiotyki.

Badanie roli plazmidów wielokopijnych w ewolucji oporności na antybiotyki

Mając na celu zrozumienie zachowań różnych bakteryjnych elementów koniugującego DNA w różnych warunkach, opisujemy protokół wykrywania różnic w częstotliwości koniugacji, z wysoką rozdzielczością, aby oszacować, jak skutecznie bakteria dawcy inicjuje koniugację.

Porównanie częstości koniugacji bakteryjnej w wysokiej rozdzielczości

Nasze eksperymentalne podejście dostarcza strategię śledzenia obfitości plazmidów i oporności na antybiotyki w czasie w populacjach bakterii.

Kwantyfikacja oporności na antybiotyki za pośrednictwem plazmidu w podejściu ewolucji eksperymentalnej

Obecne badanie opisuje przepływ pracy dla sekwencjonowania nanoporami plazmidów, gdy sekwencja chromosomowa jest już znana lub nie jest istotna. Początkowy krok wzbogacania DNA plazmidowego zapewnia optymalną głębokość sekwencji plazmidu i maksymalizuje liczbę próbek, które mogą być sekwencjonowane na jednej komórce przepływowej.

Sekwencjonowanie i montaż długich plazmidów za pomocą przepływów opartych na sekwencjonowaniu Nanopore

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

Mutanty delecji genów generowane przez rekombinację homologiczną są złotym standardem w badaniach funkcji genów. Opisano metodę OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) służącą do szybkiego generowania konstruktów delecyjnych. Następuje przemiana grzybów za pośrednictwem Agrobacterium. Na koniec przedstawiono metodę potwierdzania delecji genów w transformantach grzybowych opartą na PCR.

Szybkie wytwarzanie delecji u grzybów za pośrednictwem Agrobacterium transformacji konstruktów delecji OSCAR

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Poznaj metodę wykrywania horyzontalnego transferu genów za pośrednictwem plazmidów koniugacyjnych w E. coli. Technika wykorzystuje różnicowe markery do identyfikacji transkonjugantów w dużych populacjach bakteryjnych.

Wykrywanie horyzontalnego transferu genów, w którym pośredniczą naturalne plazmidy koniugacyjne w E. coli

Przeglądaj więcej filmów