Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Ogólnym celem tej procedury jest bezpośrednia wizualizacja i ilościowe określenie aktywności białek wiążących DNA w żywych komórkach bakteryjnych. Osiąga się to poprzez wizualizację komórek, które wyrażają aktywowane zdjęciem białko fluorescencyjne połączone z interesującym białkiem wiążącym DNA. Drugim krokiem procedury jest uzyskanie filmu przedstawiającego poszczególne białka, które są aktywowane fotograficznie podczas obrazowania.

Następnie dane są analizowane w celu określenia lokalizacji białek i śledzenia białek w pojedynczych komórkach. Zdarzenia wiązania DNA są identyfikowane na podstawie zmiany współczynnika dyfuzji pojedynczych białek w momencie ich kontaktu z chromosomami. Ostatecznie wyniki mogą dostarczyć ilościowej miary interakcji DNA białek na poziomie pojedynczej komórki poprzez zliczanie białek związanych i dyfuzyjnych na komórkę.

Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie naprawy DNA, takie jak wskaźniki naprawy in vivo i rozkład przestrzenny miejsc naprawy. Teraz zademonstrujemy metodę, mierząc aktywność naprawczą polimerazy DNA jeden w żywych komórkach E. coli: Najpierw wykonaj szkiełka nakrywkowe bez fluorescencyjnych cząstek tła w piecu w temperaturze 500 stopni Celsjusza przez godzinę. Spalić zapas szkiełek nakrywkowych o grubości 1,5, przechowywać je w temperaturze pokojowej w folii aluminiowej.

Są dobre na nadchodzące tygodnie. Następnie skoncentruj mililitr wczesnej fazy wykładniczej E coli w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej szczepu. AB 1157 poly a PA m wiśnia odwirować komórki w temperaturze 2,300 G przez pięć minut.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 mikrolitrach pozostałej pożywki i przetoczyć komórki do roztworu. Następnie przygotuj 1,5% roztwór aros o niskiej fluorescencji w wodzie destylowanej. Wymieszaj 500 mikrolitrów stopionego aerosu z 500 mikrolitrami dwóch x minimalnej pożywki, delikatnie pipetując kilka razy w górę iw dół w celu przeprowadzenia eksperymentów z uszkodzeniem DNA przy użyciu sulfonianu metylosanu lub MMS, zachowując środki ostrożności.

Dodaj 8,3 mikrolitra MMS do 500 mikrolitrów minimalnej pożywki przed zmieszaniem jej z aros, zanim mieszanina ostygnie. Rozprowadź go na przypalonym szkiełku nakrywkowym. Rozprowadź go równomiernie i wyśrodkowanie, nie tworząc bąbelków.

Spłaszcz podkładkę za pomocą drugiego spalonego szkiełka nakrywkowego. Po schłodzeniu zdejmij górną pokrywę z podkładki i dodaj mikrolitr skoncentrowanej zawiesiny komórkowej. Unieruchomij komórki, przykrywając podkładkę nowym spalonym szkiełkiem nakrywkowym i bardzo delikatnie dociskając.

Komórki należy zobrazować w ciągu 45 minut przed wyschnięciem. Aby przedłużyć ten czas, podkładkę można zapieczętować w silikonowej uszczelce w celu przeprowadzenia eksperymentów z uszkodzeniem DNA. Przed obrazowaniem komórki inkubuj je na podkładce przez 20 minut.

W nawilżonym pojemniku o temperaturze pokojowej mikroskop wyposażony jest w laser do fotoaktywacji o długości 405 nanometrów i laser wzbudzający o długości 561 nanometrów. Czułość pojedynczej cząsteczki osiąga się poprzez wzbudzenie tylko czwórek fluorowych w cienkim przekroju nad powierzchnią szkiełek nakrywkowych przy użyciu silnie nachylonego oświetlenia, emisja fluorescencji jest rejestrowana na kamerze CCD zwielokrotniającej elektrony. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość komórek.

Przy oświetleniu w świetle przechodzącym zdefiniuj przycięte pole widzenia, aby zmniejszyć rozmiar danych i zwiększyć prędkość odczytu kamery. Przykryj próbkę przed światłem otoczenia i włącz wzmocnienie kamery CCD zwielokrotniające elektrony w celu wykrycia pojedynczego fluoru cztery. Ustaw liczbę klatek na sekundę na 15,26 milisekundy na klatkę.

Obejmuje to odczyt z kamery 0,26 milisekundy Czas ekspozycji musi być wystarczająco krótki, aby obserwować ostre plamy fluorescencyjne z niewielkimi błyskami ruchu. Z drugiej strony, ślady muszą być próbkowane w wystarczająco długich odstępach czasu, aby wyraźnie odróżnić cząsteczki związane od dyfuzyjnych. Teraz wyświetl dane z kamery, aby sprawdzić sygnał ciemnego tła.

Włącz laser 561 nanometrów i sprawdź sygnał tła wzbudzenia. Włącz laser 405 nm, aby uzyskać fotoaktywację białek fuzyjnych wiśni Paul one PA M i zwiększaj intensywność, aż pojawią się fluorescencyjne plamki pojedynczych cząsteczek. Teraz dostosuj kąt wiązki wzbudzenia, aby oświetlić tylko cienką część próbki.

Zamknij powierzchnię szkiełka nakrywkowego. Metoda ta opiera się na wykrywaniu i precyzyjnej lokalizacji pojedynczych białek fluorescencyjnych, dlatego optymalne ustawienie i czułość mikroskopu będą miały kluczowe znaczenie dla jakości danych. W tym celu skoncentruj wiązkę lasera na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu 1.4 o aperturze numerycznej 100 x.

Przesunięcie soczewki skupiającej prostopadle do wiązki przesuwa ostrość od środka obiektywu, powodując, że wiązka opuszcza obiektyw pod kątem. Celuj w wiązkę, aby zmaksymalizować intensywność fluorescencji i zminimalizować tło. Znajdź nowe pole widzenia komórek w trybie mikroskopii światła przechodzącego i ustaw ostrość obrazu.

Zrób zdjęcie z kamery, aby nagrać kontury komórek. Włącz laser 561 nm i wybiel komórkową autofluorescencję i plamy tła na okładce. Poślizgnij się na kilka sekund.

Przed rozpoczęciem zbierania danych rozpocznij akwizycję filmu dłoniowego w ciągłym wzbudzeniu 561 nanometrów. Włącz laser o długości fali 405 nanometrów i stopniowo zwiększaj intensywność w trakcie trwania filmu, osiągając nawet jeden wat na centymetr kwadratowy. Unikaj wyższych intensywności 405 nanometrów, które powodują autofluorescencję komórkową.

Zwróć uwagę na gęstość cząsteczek fluorescencyjnych. Ważne jest, aby utrzymywać szybkość aktywacji na niskim poziomie, tak aby plamki fluorescencyjne były wyraźnie odizolowane w każdej klatce. Nagrywaj około 10 000 klatek na film, co przy przyciętym polu widzenia zwykle zajmuje do trzech minut i do gigabajta miejsca na dysku twardym.

Należy zauważyć, że po zobrazowaniu pola widzenia fluorofory wiśni są nieodwracalnie wybielone i nie można ich zaobserwować. Ponownie, poniższa procedura wykorzystuje niestandardowe oprogramowanie w matlabie. Pojedyncze fluorofory pojawiają się jako funkcje rozproszenia punktowego lub psfs.

W filmie psf są po raz pierwszy identyfikowane na obrazie z filtrem pasmowo-przepustowym przy użyciu jądra Gaussa z siedmioma pozycjami kandydującymi o średnicy pikseli odpowiadającymi P SFS ze szczytową intensywnością pikseli 4,5 razy większą niż odchylenie standardowe tła. Lokalnie najjaśniejszy piksel na kandydata na PSF służy jako wstępne przypuszczenie do dopasowania eliptycznej funkcji Gaussa. Parametry swobodnego dopasowania to pozycja X y, pozycja X szerokość, obrót szerokości Y, kąt, amplituda i przesunięcie tła.

Eliptyczna maska Gaussa odpowiada za ruch molekuł w czasie ekspozycji, co rozmywa i deformuje wykres PSF. Wynikowe lokalizacje XY ze wszystkich klatek filmu palmowego na obrazie mikroskopowym w świetle przechodzącym o tych samych lokalizacjach pola widzenia Paul one PAM Cherry powinny pojawić się w centralnym obszarze komórek E. coli. Automatyczne śledzenie mierzy ruch białek, ale kluczowy jest pomyślny wybór okna śledzenia.

Najpierw uruchom algorytm śledzenia dla szeregu parametrów okna śledzenia. Wykreśl liczbę zmierzonych ścieżek na komórkę w stosunku do okna śledzenia, aby zidentyfikować najmniejsze możliwe okno śledzenia, które nie dzieli ścieżek, wyświetl wynikowe ścieżki na obrazie mikroskopii światła przechodzącego o tym samym polu widzenia. Aby zobrazować przestrzenny rozkład ruchu cząsteczek w komórkach, ścieżki P one powinny wykazywać dyfuzję ograniczoną w pojedynczych komórkach, jeśli część ścieżek wydaje się przechodzić między komórkami, co sugeruje, że oddzielne cząsteczki zostały błędnie połączone, ponieważ okno śledzenia zostało wybrane zbyt duże i/lub szybkość aktywacji zdjęcia była zbyt wysoka.

Wykreśl skumulowany rozkład długości kroków między kolejnymi lokalizacjami. Krzywa wznosi się i nasyca płynnie dla wystarczająco dużych okien śledzenia, ale pokazuje krawędź odcięcia, jeśli okno zostało wybrane jako zbyt małe. Po wybraniu odpowiedniego okna śledzenia można przeanalizować charakterystykę dyfuzji Paul One.

Obliczanie średniego przemieszczenia kwadratowego lub MSD między kolejnymi lokalizacjami dla każdej ścieżki z sumą n kroków służy tylko do ścieżek z co najmniej pięcioma lokalizacjami, aby zmniejszyć niepewność statystyczną MSD. Następnie oblicz pozorny współczynnik dyfuzji na ścieżkę z MSD. Drugi termin koryguje szacowany błąd lokalizacji.

To są wartości dla drugiego terminu. W tym przykładzie wykreśl teraz histogram zmierzonych wartości współczynnika dyfuzji ze wszystkich ścieżek w polu widzenia dla pol one w nieuszkodzonych komórkach i dla pol one w komórkach poddanych leczeniu uszkodzenia DNA za pomocą MMS, czerwone paski identyfikują populację pojedynczych cząsteczek pol one, które wydają się być związane z chromosomem i dyfundują z prędkością mniejszą niż 0,15 mikrona kwadratowego na sekundę. Natomiast swobodnie dyfundujące cząsteczki poruszają się wokół 0,9 mikrona kwadratowego na sekundę.

Po związanym Paulu zidentyfikowano jedną cząsteczkę. Położenie miejsc wiązania można uwidocznić w komórkach nieuszkodzonych oraz w komórkach z uszkodzeniem MM MS. Frakcja związanych śladów w stosunku do całkowitej liczby obserwowanych śladów stanowi bezpośrednią ilościową miarę aktywności naprawczej DNA pol.

Przeprowadzono jedną fotoaktywację in vivo białek fuzyjnych wiśni pol one PA m w żywych komórkach E. coli. Aktywacja zdjęć może być ograniczona do pojedynczego fluoroforu wiśniowego PA m w jednej komórce, wyższe wskaźniki aktywacji zdjęć ujawniły więcej cząsteczek fluorescencyjnych. Analiza lokalizacji została przeprowadzona dla każdej klatki filmu z palmą.

Precyzja została zmierzona za pomocą nieruchomych cząsteczek w nieruchomych komórkach lub związanych cząsteczek w żywych komórkach i okazało się, że wynosi 40 nanometrów, co jest zgodne z przewidywaniami teoretycznymi. Następnie ustawiano próg lokalizacji, gdy był zbyt niski. Losowe szczyty w szumie tła były błędnie wybierane jako pozycje kandydujące, natomiast jeśli próg był zbyt wysoki, niektóre miejsca były pomijane.

Powstałe w ten sposób lokalizacje Paul one zajmowały centralny obszar komórki, szeroko rekapitulując organizację przestrzenną nukleoidu E. coli. Większość śladów Paula One w nieuszkodzonych komórkach wykazuje dyfuzję. Typowa komórka zawiera kilkaset śladów Paula One zgodnych z liczbą kopii około 400 cząsteczek Paul one na komórkę E coli.

Różne rodzaje ruchu molekularnego można zidentyfikować, obliczając wartości MSD w zakresie czasów opóźnienia: ruch kierowany daje krzywą paraboliczną. Ruch Browna charakteryzuje się linią prostą. Ograniczona krzywa dyfuzji osiąga plateau, a przesunięcie krzywej MSD dla cząstek nieruchomych reprezentuje niepewność lokalizacji.

Wynikowa krzywa MSD dla Paula One rosła liniowo dla krótkich czasów opóźnienia, co wskazuje na ruchy Browna i nasycała się w dłuższych czasach opóźnienia z powodu uwięzienia komórek. Korzystając z tych metod, mierzono aktywność naprawczą DNA Paula, jedną z nich w odpowiedzi na egzogenne uszkodzenia alkilacyjne DNA w nieuszkodzonych komórkach. Histogram współczynnika dyfuzji Paula One pokazuje dominującą populację cząsteczek dyfuzyjnych.

Kilka związanych cząsteczek może być zaangażowanych w replikację DNA i naprawę endogennych uszkodzeń DNA pod ciągłym 100-milimolowym uszkodzeniem MMS. Częstotliwość ścieżek o niemal zerowych współczynnikach dyfuzji znacznie wzrasta. Potwierdza to model, w którym więcej cząsteczek Paul one musi być zaangażowanych w naprawę DNA z mutagenem obecnym po tej procedurze.

Inne metody analizy danych, takie jak lokalizacja, grupowanie, mogą być wykonywane w celu ilościowego określenia przestrzennego rozmieszczenia białek w komórce i zbadania obecności większych kompleksów białkowych zaangażowanych w naprawę DNA.