Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest bezpośrednia wizualizacja i ilościowe określenie aktywności białek wiążących DNA w żywych komórkach bakteryjnych. Osiąga się to poprzez wizualizację komórek eksponujących fotoaktywowalne białko fluorescencyjne połączone z badanym białkiem wiążącym DNA. Drugim etapem procedury jest zarejestrowanie filmu przedstawiającego fotoaktywację poszczególnych białek podczas obrazowania.

Następnie analizuje się dane w celu określenia lokalizacji białek oraz śledzenia ich ruchu w pojedynczych komórkach. Zdarzenia wiązania DNA są identyfikowane na podstawie zmiany współczynnika dyfuzji pojedynczych białek w momencie kontaktu z chromosomami. W rezultacie, poprzez zliczanie liczby białek związanych i dyfundujących w każdej komórce, możliwe jest uzyskanie ilościowej miary oddziaływań białko-DNA na poziomie pojedynczej komórki.

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny naprawy DNA, takie jak tempo naprawy in vivo oraz przestrzenny rozkład miejsc naprawy. Teraz zademonstrujemy tę metodę, mierząc aktywność naprawczą polimerazy DNA I w żywych komórkach e coli. Najpierw przygotuj szkiełka nakrywkowe pozbawione tła cząsteczek fluorescencyjnych w piecu w temperaturze 500 °C przez godzinę. Wypal zapas szkiełek nakrywkowych o grubości nr 1,5 i przechowuj je w temperaturze pokojowej w folii aluminiowej.

Przechowują się one przez kilka kolejnych tygodni. Następnie w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml skoncentruj 1 ml hodowli E coli szczepu AB 1157 poly a PA m cherry w wczesnej fazie wzrostu wykładniczego; wirować komórki przy 2 300 G przez pięć minut.

Usunąć nadosód i resuspender osad komórkowy w 20 µL pozostałego medium, a następnie wymieszać komórki w wirówce typu vortex do całkowitego rozpuszczenia. Następnie przygotować 1,5% roztwór niskofluorescencyjnego agarosy w wodzie destylowanej. W eksperymentach dotyczących uszkodzeń DNA z użyciem metanosulfonianu metylu (MMS), zachowując niezbędne środki ostrożności, wymieszać 500 µL roztopionej agarosy z 500 µL dwukrotnie stężonego medium minimalnego, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół kilka razy.

Dodaj 8,3 µL MMS do 500 µL minimalnego medium przed zmieszaniem z aros, zanim mieszanina ostygnie. Rozprowadź ją na wypalonym szkiełku podstawowym. Rozprowadź preparat równomiernie i centralnie, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.

Wypłaszcz kropelkę za pomocą drugiego wypalonego szkiełka nakrywkowego. Po ostygnięciu usuń górne szkiełko z kropelki i dodaj 1 µL skoncentrowanej zawiesiny komórek. Unieruchom komórki, przykrywając kropelkę nowym wypalonym szkiełkiem nakrywkowym i bardzo delikatnie dociskając.

Obrazowanie komórek należy przeprowadzić w ciągu 45 minut, aby zapobiec ich wysychaniu. W celu wydłużenia tego czasu, w eksperymentach dotyczących uszkodzeń DNA, podkładkę można uszczelnić za pomocą silikonowej uszczelki. Przed obrazowaniem należy inkubować komórki na podkładce przez 20 minut.

W nawilżanym pojemniku w temperaturze pokojowej mikroskop wyposażony jest w laser do fotoaktywacji o długości fali 405 nanometrów oraz laser wzbudzający o długości fali 561 nanometrów. Czułość na poziomie pojedynczych cząsteczek uzyskuje się poprzez wzbudzanie wyłącznie fluoroforów w cienkiej warstwie nad powierzchnią szkiełka podstawowego przy użyciu oświetlenia pod dużym kątem; emisja fluorescencji jest rejestrowana przez kamerę CCD z mnożeniem elektronów. Umieść próbkę na stole mikroskopu i ustaw ostrość na komórkach.

Przy oświetleniu światłem przechodzącym zdefiniuj przycięte pole widzenia, aby zmniejszyć rozmiar danych i zwiększyć prędkość odczytu kamery. Osłoń próbkę przed światłem otoczenia i włącz wzmocnienie kamery EMCCD dla detekcji pojedynczego fluoroforu. Ustaw częstotliwość klatek na 15.26 milisekund na klatkę.

Obejmuje to czas odczytu kamery wynoszący 0,26 ms. Czasy ekspozycji muszą być wystarczająco krótkie, aby zaobserwować ostre plamki fluorescencyjne przy minimalnym rozmyciu ruchu. Z drugiej strony, ścieżki muszą być próbkowane w odpowiednio długich odstępach czasu, aby wyraźnie odróżnić cząsteczki związane od dyfundujących. Teraz wyświetl dane z kamery, aby sprawdzić sygnał tła w ciemności.

Włącz laser o długości fali 561 nanometrów i sprawdź sygnał tła wzbudzenia. Włącz laser o długości fali 405 nanometrów w celu fotoaktywacji białek fuzyjnych Paul one PA M cherry i zwiększaj jego intensywność, aż pojawią się fluorescencyjne plamki pojedynczych cząsteczek. Następnie dostosuj kąt wiązki wzbudzenia tak, aby oświetlić jedynie cienką sekcję próbki.

Przykryj powierzchnię szkiełka podstawowego lamellką. Metoda ta opiera się na detekcji i precyzyjnej lokalizacji pojedynczych białek fluorescencyjnych, dlatego kluczowe dla jakości danych będzie optymalne ustawienie i czułość mikroskopu. W tym celu skup wiązkę lasera w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu 100 x o aperturze numerycznej 1,4.

Przesunięcie soczewki skupiającej prostopadle do wiązki oddala ognisko od centrum obiektywu, co powoduje, że wiązka opuszcza obiektyw pod kątem. Należy dążyć do takiego ustawienia wiązki, aby zmaksymalizować intensywność fluorescencji i zminimalizować tło. W trybie mikroskopii w świetle przechodzącym należy znaleźć nowe pole widzenia komórek i ustawić ostrość obrazu.

Wykonaj zdjęcie aparatem, aby zarejestrować obrysy komórek. Włącz laser 561 nanometr i wybiel autofluorescencję komórkową oraz plamy tła na szkiełku nakrywkowym przez kilka sekund.

Przed rozpoczęciem akwizycji danych rozpocznij rejestrację filmu PALM przy ciągłym pobudzeniu falą o długości 561 nm. Włącz laser 405 nm i stopniowo zwiększaj jego intensywność w trakcie trwania filmu, aż do osiągnięcia wartości 1 W/cm². Unikaj wyższych intensywności lasera 405 nm, które powodują autofluorescencję komórkową.

Należy zwrócić uwagę na gęstość cząsteczek fluorescencyjnych. Ważne jest, aby utrzymać niskie tempo aktywacji, tak aby plamki fluorescencyjne były wyraźnie odizolowane w każdej klatce. Należy zarejestrować około 10 000 klatek na film, co przy przyciętym polu widzenia zajmuje zazwyczaj do trzech minut i do jednego gigabajta miejsca na dysku twardym.

Należy pamiętać, że po obrazowaniu danego pola widzenia fluorofory pa m cherry ulegają nieodwracalnemu wybieleniu i nie mogą być ponownie obserwowane. Ponownie zaznaczamy, że poniższa procedura wykorzystuje specjalistyczne oprogramowanie w środowisku matlab. Pojedyncze fluorofory widoczne są jako funkcje rozproszenia punktu lub psf.

W filmie psf są najpierw identyfikowane na obrazie przefiltrowanym filtrem pasmowym przy użyciu jądra Gaussa o średnicy siedmiu pikseli; pozycje kandydatów odpowiadają PSF z intensywnością szczytowego piksela o 4,5 odchylenia standardowego wyższą od tła. Lokalnie najjaśniejszy piksel dla każdego kandydata PSF służy jako wartość początkowa do dopasowania eliptycznej funkcji Gaussa. Wolnymi parametrami dopasowania są pozycja X, pozycja Y, szerokość X, szerokość Y, kąt obrotu, amplituda oraz przesunięcie tła.

Eliptyczna maska Gaussa uwzględnia ruch cząsteczek podczas czasu ekspozycji, który powoduje rozmycie i odkształcenie wykresu PSF. Wynikowe lokalizacje XY ze wszystkich klatek filmu PALM naniesione na obraz mikroskopii światła przechodzącego tego samego pola widzenia dla lokalizacji PAM Cherry powinny znajdować się w obszarze centralnym komórek E. coli. Automatyczne śledzenie pozwala zmierzyć ruch białek, jednak kluczowy jest właściwy dobór okna śledzenia.

Najpierw uruchom algorytm śledzenia dla zakresu parametrów okna śledzenia. Przedstaw na wykresie liczbę zmierzonych ścieżek na komórkę w funkcji okna śledzenia, aby zidentyfikować najmniejsze możliwe okno śledzenia, które nie powoduje rozdzielania ścieżek, a następnie wyświetl uzyskane ścieżki na obrazie z mikroskopii światła przechodzącego tego samego pola widzenia. Aby zwizualizować rozkład przestrzenny ruchu cząsteczek wewnątrz komórek, ścieżki powinny wykazywać dyfuzję ograniczoną do pojedynczych komórek; jeśli część ścieżek wydaje się przechodzić między komórkami, sugeruje to, że oddzielne cząsteczki zostały błędnie połączone z powodu zbyt dużego okna śledzenia i/lub zbyt wysokiej częstotliwości fotoaktywacji.

Należy wykreślić skumulowany rozkład długości kroków pomiędzy kolejnymi lokalizacjami. Krzywa rośnie i nasyca się płynnie dla wystarczająco dużych okien śledzenia, natomiast wykazuje krawędź odcięcia, jeśli wybrane okno było zbyt małe. Po wyborze odpowiedniego okna śledzenia można przeanalizować charakterystykę dyfuzyjną Paul one.

Oblicz średni kwadrat przemieszczenia (MSD) pomiędzy kolejnymi lokalizacjami dla każdego toru o całkowitej liczbie n kroków; aby zmniejszyć niepewność statystyczną MSD, należy wykorzystać wyłącznie tory posiadające co najmniej pięć lokalizacji. Następnie wyznacz pozorny współczynnik dyfuzji dla każdego toru na podstawie MSD. Drugi człon koryguje szacowany błąd lokalizacji.

Są to wartości dla drugiego składnika. W tym przykładzie należy teraz narysować histogram zmierzonych wartości współczynnika dyfuzji dla wszystkich ścieżek w polu widzenia dla pol one w komórkach nieuszkodzonych oraz dla pol one w komórkach poddanych działaniu MMS w celu wywołania uszkodzeń DNA; czerwone słupki identyfikują populację pojedynczych cząsteczek pol one, które wydają się być związane z chromosomem i dyfundują z prędkością mniejszą niż 0,15 µm²/s. Natomiast cząsteczki dyfundujące swobodnie poruszają się z prędkością około 0,9 µm²/s.

Po zidentyfikowaniu cząsteczek związanej polimerazy pol one, można zwizualizować położenie miejsc wiązania w nieuszkodzonych komórkach oraz w komórkach z uszkodzeniami indukowanymi przez MMS. Ułamek śladów związanych w stosunku do całkowitej liczby zaobserwowanych śladów stanowi bezpośrednią miarę ilościową aktywności naprawy DNA polimerazy pol.

Fotoaktywację in vivo białek fuzyjnych pol one PA m cherry przeprowadzono w żywych komórkach E. coli. Fotoaktywację można było ograniczyć do pojedynczego fluoroforu PA m cherry w jednej komórce; wyższe tempo fotoaktywacji ujawniało więcej cząsteczek fluorescencyjnych. Analizę lokalizacji przeprowadzono dla każdej klatki filmu PALM.

Precyzję zmierzono przy użyciu nieruchomych cząsteczek w utrwalonych komórkach lub cząsteczek związanych w żywych komórkach i stwierdzono, że wynosi ona 40 nanometrów, co jest zgodne z przewidywaniami teoretycznymi. Następnie ustalono próg lokalizacji, ponieważ zbyt niski próg powodował błędne wybieranie losowych pików w szumie tła jako pozycji kandydackich, natomiast przy zbyt wysokim progu pomijano niektóre plamki.

Powstałe lokalizacje Paul one zajmowały centralny obszar komórki, w dużym stopniu odtwarzając organizację przestrzenną nukleoidu e coli. Większość śladów Paul one w nieuszkodzonych komórkach wykazuje dyfuzję. Typowa komórka zawiera kilkaset śladów Paul one, co jest zgodne z liczbą kopii wynoszącą około 400 cząsteczek Paul one na komórkę e coli.

Różne rodzaje ruchu molekularnego można zidentyfikować poprzez obliczenie wartości MSD w zakresie czasów opóźnienia; ruch kierunkowy daje krzywą paraboliczną. Ruch Browna charakteryzuje się linią prostą. Krzywa dyfuzji ograniczonej osiąga plateau, a przesunięcie krzywej MSD dla cząsteczek nieruchomych reprezentuje niepewność lokalizacji.

Wynikowa krzywa MSD dla Paul one rosła liniowo przy krótkich czasach opóźnienia, co wskazuje na ruchy Browna, a przy dłuższych czasach opóźnienia osiągała nasycenie z powodu ograniczenia przestrzennego w komórce. Zastosowanie tych metod pozwoliło na pomiar aktywności naprawy DNA białka Paul one w odpowiedzi na egzogenne uszkodzenia alkilacyjne DNA w nieuszkodzonych komórkach. Histogram współczynnika dyfuzji Paul one wykazuje dominującą populację dyfundujących cząsteczek.

Nieliczne związane cząsteczki mogą brać udział w replikacji DNA oraz naprawie endogennych uszkodzeń DNA przy ciągłym narażeniu na działanie 100 milimolowego MMS. Częstotliwość występowania ścieżek z współczynnikami dyfuzji bliskimi zeru znacznie wzrasta. Potwierdza to model, według którego w proces naprawy DNA w obecności mutagenu, po przeprowadzeniu tej procedury, muszą być zaangażowane więcej niż jedna cząsteczka.

W celu ilościowego określenia przestrzennego rozkładu białek w komórce oraz zbadania obecności większych kompleksów białkowych zaangażowanych w naprawę DNA można zastosować inne metody analizy danych, takie jak lokalizacja czy klasteryzacja.