Jakie narzędzia są wymagane do tej metody?

Mikroskop fluorescencyjny i oprogramowanie do analizy obrazów są niezbędne.

Jak przygotowywane są komórki bakteryjne do obrazowania?

Komórki są oznaczane specyficznymi markerami fluorescencyjnymi przed wykonaniem obrazów.

Czym jest obraz z-stack?

Obraz z-stack to seria obrazów wykonanych na różnych płaszczyznach ogniskowania w celu stworzenia trójwymiarowego widoku.

Dlaczego analiza pojedynczej komórki jest ważna?

Umożliwia precyzyjne zbadanie rozmieszczenia białek w pojedynczych komórkach.

Wizualizacja rozkładu białek bakteryjnych w trzech wymiarach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Q: Jakim jest głównym celem tego protokołu?

Wizualizacja rozmieszczenia białek bakteryjnych w trzech wymiarach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.

JoVE Encyclopedia of Experiments

Microbiology

0 views • 2:52 min • March 31st, 2026

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zacznij od szczelnego preparatu zawierającego komórki bakteryjne oznaczone cytoplazmatycznym czerwonym markerem fluorescencyjnym oraz białkowo-specyficznym zielonym markerem fluorescencyjnym.

Obserwuj preparat pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Zlokalizuj pole zawierające dobrze izolowane komórki bakteryjne i skup się na centrum reprezentatywnej komórki.

Ustaw pierwszy kanał fluorescencyjny i uzyskaj obraz stosu z w określonych parametrach, aby uchwycić trójwymiarowy kształt reprezentatywnej komórki i jej pobliskich komórek.

Następnie przełącz się na drugi kanał fluorescencyjny i wykonuj kolejny obraz stosu z tych samych komórek o tych samych parametrach.

Rejestruje rozmieszczenie białek bakteryjnych w komórkach.

Przytnij pojedyncze komórki z każdego stosu z, aby wyizolować je do analizy pojedynczych komórek.

Zrównaj te obrazy, aby zobrazować rozmieszczenie białek bakteryjnych względem kształtu komórki, co umożliwia precyzyjną analizę podczas interakcji gospodarz–patogen.

Zaraz po uszczelnieniu pokrywy umieść szkiełko na stole mikroskopu i po pięciu minutach termicznego wyrównania użyj kółek ostrości mikroskopu, aby wyostrzyć środek komórki. W powiązanym oprogramowaniu mikroskopowym w sekcji ND Acquisition zaznacz pole Z, aby uzyskać stos Z, i kliknij przycisk Home, aby ustawić środek komórki jako punkt startowy. Ustaw rozmiar kroku na 0,1 mikrometra, a zakres na cztery mikrometry, i upewnij się, że urządzenie Z jest ustawione na poziom piezo.

Kluczowe jest, aby na górze i dole komórki było wystarczające rozmycie, tak aby komórka była niemal nie do odróżnienia od tła. Ustaw kanały fluorescencyjne pod oknem lambda na ustawienia dla obrazowanych cząsteczek fluorescencyjnych i potwierdzi, że kolejność eksperymentu jest ustawiona na lambda, aby uzyskać pełny stos Z w każdym kanale kolorowym przed przełączeniem. Następnie kliknij Run teraz, aby rozpocząć akwizycję obrazu.

Gdy wszystkie obrazy zostaną pobrane, otwórz pliki w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazów. Narysuj ramkę wokół pojedynczej komórki i powtórz ją dwa razy, po raz dla każdego kanału, upewniając się, że pole Duplicate hyperstack jest zaznaczone, i zmień kanał na jeden lub dwa. Gdy oba stosy są dostępne, wybierz Obrazy, Stosy, Narzędzia i Konkatenację, aby połączyć obrazy.