Kriokonserwacja bloków tkanki korowej w celu wytworzenia wysoko wzbogaconych kultur neuronalnych

Cześć, mam na imię Alan i jestem laboratorium dr Horney Lu na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine na Wydziale Neurobiologii i Zachowania. A ja jestem Bob. Dzisiaj dr Haro pokaże Ci szybki, wydajny i niezawodny protokół rutynowej kriokonserwacji bloków tkanki korowej w celu późniejszej degeneracji wysokiej jakości pierwotnych kultur neuronalnych.

Więc zacznijmy. Oczyszczoną i rozdrobnioną tkankę umieszcza się w fiolkach kriogenicznych zawierających 10% TMSO. Medium do zamrażania.

Fiolki kriogeniczne są ładowane do pojemnika do zamrażania i umieszczane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na co najmniej cztery godziny. Zamrożone fiolki kriogeniczne są następnie umieszczane w ciekłym azocie w celu długotrwałego przechowywania. Do hodowli fiolki kriogenicznej AC topi się w ciepłej łaźni wodnej i spłukuje ciepłym HBSS w celu usunięcia pozostałego DMSO.

Świeży HBSS jest dodawany wraz z próbą dysocjacji, po czym dodaje się DMM z 10% EBS. Aby zatrzymać dysocjacyjną aktywność enzymatyczną, komórki są wirowane, a osad ponownie zawieszany w świeżym DMM plus 10% EBS i powlekany na wstępnie pokrytych szalkach polilizynowych. Po 24 godzinach DMM zmienił się w uzupełnioną pożywkę neuro podstawową i rósł przez 10 dni.

W protokole tym wykorzystuje się stalową żyletkę do siekania tkanki korowej przed użyciem. Maszynkę do golenia należy sterylizować w 70% etanolu przez co najmniej dwie godziny. Jeden x buforowany roztwór soli Hanka HBSS jest tworzony przez rozcieńczenie 10 x roztworu podstawowego w wysterylizowanej wodzie, jeden X-H-B-S-S jest następnie trzymany na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu przetworzenia tkanki.

Tlenek dimetylosulfosulfu lub DMSO jest stosowany jako krioochrona w pożywce do zamrażania. Protokół ten wykorzystuje 10% objętości i objętościowe rozcieńczenie DMSO w jednym X-H-B-S-S-D-M-S-O powinno całkowicie wymieszać się przed przechowywaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nalgene i pojemnik do zamrażania służą do kontrolowania szybkości zamrażania próbek.

Pojemnik do zamrażania jest załadowany 2,5-mililitrowymi fiolkami kriogenicznymi, które zostały wcześniej oznaczone. Dobrym pomysłem jest również oznaczenie samych pojemników do zamrażania, jeśli masz więcej niż jeden i zanotowanie odpowiedniego pojemnika na żółci. Wcześniej schłodzone 10% DMSO, środek do zamrażania, a także pojemnik do zamrażania są umieszczane w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Tutaj jeden mililitr pożywki do zamrażania jest powoli dodawany do każdej z fiolek kriogenicznych Po upewnieniu się, że nakrętki są bezpieczne, umieść pojemnik do zamrażania z fiolkami w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej dwie godziny tuż przed przetwarzaniem tkanek. Wcześniej wysterylizowaną żyletkę należy dokładnie wypłukać. Trzy, trzyminutowe prania.

Użycie wysterylizowanej wody powinno wystarczyć do usunięcia pozostałego etanolu. Ta procedura mycia powinna być szybka, ponieważ maszynka do golenia jest podatna na utlenianie się w wyniku długotrwałego zanurzenia i sterylnej wody. Przed czyszczeniem chusteczkę należy położyć na okład z lodu.

Lekko spłucz zimnym X-H-B-S-S, aby usunąć wszelkie swobodnie pływające zanieczyszczenia. Wysterylizowane igły służą do oczyszczania kawałków tkanek z wszelkich pozostałych błon i naczyń krwionośnych. Należy zachować ostrożność, aby zachować integralność strukturalną tkanki podczas czyszczenia.

Wraz ze wzrostem tej skuteczności siekania czystej tkanki będzie ona widocznie inna niż w przypadku tkanki surowej i powinna zostać usunięta większość błon lub naczyń krwionośnych. Po oczyszczeniu i wypłukaniu chusteczki można rozpocząć siekanie. Ważne jest, aby wykonać czyste cięcia tkanki, tworząc bloki o wielkości około jednego milimetra sześciennego.

Bloki, które są zbyt duże, obniżają wydajność komórek podczas rozmrażania. W przypadku mniejszych bloków należy jednak również unikać nadmiernego przetwarzania. Posiekaną tkankę można pobrać za pomocą pipety automatycznej i jakiejś fajnej X-H-B-S-S.

Pamiętaj, aby spłukać naczynie HBSS, aby odzyskać całą zebraną tkankę. Tkankę dodaje się następnie do dużej objętości jednego X-H-B-S-S i pozostawia do opadnięcia na dno, tworząc luźno upakowany granul. To usuwa wszelkie pozostałe zanieczyszczenia, które mogą być obecne, gdy tkanka osiada w HBSS, odzyskaj wcześniej schłodzony pojemnik do zamrażania i fiolki kriogeniczne przed przydzieleniem tkanki.

Upewnij się, że odkręciłeś wszystkie fiolki, aby przyspieszyć proces napełniania tkanki. Narażenie na DMSO w temperaturze pokojowej powinno być ograniczone do nie więcej niż 10 minut. Dobrym pomysłem jest praca z jednym pojemnikiem do zamrażania na raz, aż cała tkanka zostanie zużyta.

Zacznij odsysać supernację luźnej tkanki, granuluj kukurydzę jak najbliżej granulki, nie naruszając jej. Następnie dopasuj końcówkę kryzy o szerokości 200 mikrolitrów do pipety. Nie używaj mniejszego otworu na końcówkę, ponieważ naruszy to strukturę bloków schodzących na dno osadu tkankowego.

Zbierz powoli 200 mikrolitrów tkanki. Dodaj tę tkankę do fiolki kriogenicznej i przejdź do następnej, aż wszystkie fiolki zostaną wypełnione. Może być potrzebna reguła 10 minut.

Szybko umieść pojemnik do zamrażania w fiolkach kriogenicznych w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza na co najmniej cztery godziny lub na noc, jeśli czas jest ograniczony. Po upływie odpowiedniego czasu wyjmij pojemnik do zamrażania z zamrażarki i jak najszybciej umieść fiolki kriogeniczne w pojemniku kriogenicznym. Umieść pudełko kriogeniczne w stojaku na ciekły azot w celu długotrwałego przechowywania.

Usuń kriowirus z ciekłego azotu tak szybko, jak to możliwe, ograniczając kriopojemniki Wystawienie na działanie temperatury pokojowej szybko stopić próbkę, zanurzając ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zawsze trzymaj nakrętkę nad wodą. Sprawdzaj często i rozmrażaj, aż zaobserwuje się mały lód P.

Przed umieszczeniem go w szafie bezpieczeństwa wysterylizuj kriogeniczny olej za pomocą 70% etanolu. Przystąp do dodawania rozmrożonej tkanki do dużej objętości ciepłego jednego X-H-B-S-S, jeśli tkanka pozostaje na ściankach kriogenicznego podłości. Delikatnie zebrane za pomocą HBSS.

Po pobraniu całej tkanki. Odwróć rurkę trzy do czterech razy i pozwól tkance osiąść na dnie. Ten krok zapewnia wystarczające rozcieńczenie DMSO.

Gdy tkanka się uspokoi, odessać jak najwięcej super natin. Następnie dodaj do tego 10 mililitrów ciepłego, świeżego X-H-B-S-S. Dodaj 300 mikrolitrów 0,25% trypsyny i 50 mikrolitrów DNA.

Przystąp do dysocjacji tkanki z delikatnym mieszaniem, tworząc mętną zawiesinę komórkową po dysocjacji tkanki. Zatrzymaj aktywność enzymatyczną, dodając ciepłą masę oraz 10% wzbogaconą zawiesinę komórek centrfuzyjnych EPS w surowicy bydlęcej w stężeniu 1200 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżym DMEM plus 10% EBS i płytkę na płytkach pokrytych polilizyną.

Pozwól komórkom przyczepić się do naczyń przez 30 minut. Następnie wymień nośnik na świeży DM plus 10% EBS. Po 24 godzinach zastąp pożywkę zawierającą DM pożywką neuro podstawową uzupełnioną N 2 i B 27 i hoduj przez 10 dni.

Właśnie szczegółowo opisaliśmy obszerny, wydajny i niezawodny protokół z rutynowym zabezpieczaniem bloków tkanki korowej. A więc powodzenia.