Name: Kriokonserwacja bloków tkanki korowej w celu wytworzenia wysoko wzbogaconych kultur neuronalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj metodę kriokonserwacji bloków tkanki korowej w celu uzyskania wysoko wzbogaconych kultur neuronalnych. Protokół zapewnia wydajne mrożenie z DMSO i rozmrażanie w łaźni wodnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania te były wspierane przez granty z programu Undergraduate Research Opportunities Program na UCI (A.R. i S.P.) oraz granty z State of California Alzheimer's Disease Initiative i National Institutes of Health nr HD38466, a także grant z Alzheimer's Disease Research Center nr AG16573 (J.B.)

1. Kriokonserwacja bloków tkanki kory
Przygotowanie materiałów
<ol>
 <li>Przygotuj 1X zbuforowany roztwór soli Hanksa (HBSS), rozcieńczając 10X roztwór zapasowy w wodzie sterylnej (1:9). Przechowuj HBSS w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Przygotuj 10% medium do mrożenia DMSO, rozcieńczając DMSO w HBSS (1:9). Medium do mrożenia powinno zostać przygotowane bezpośrednio przed kriokonserwacją i przechowywane w temperaturze 4°C do momentu schłodzenia.</li>
 <li>Do systematycznego siekania tkanki należy użyć stalowego ostrza do golenia. Przed użyciem ostrze sterylizuje się poprzez zanurzenie w 70% etanolu na 2 h. Bezpośrednio przed obróbką tkanki trzykrotnie opłucz ostrze wodą sterylną. Unikaj pozostawiania ostrza w wodzie sterylnej przez zbyt długi czas, ponieważ jest ono podatne na utlenianie.</li>
 <li>Pojemnik do mrożenia Nalgene należy wypełnić kriotubkami (2,5 mL), a następnie przenieść do sterylnej komory biologicznej. Do każdej probówki dodaje się 1 mL schłodzonego medium do mrożenia. Następnie pojemnik do mrożenia umieszcza się w temperaturze 4°C na co najmniej 2 h.</li>
</ol>
Czyszczenie, siekanie i mrożenie
<ol>
 <li>Tkankę mózgu przeznaczoną do mrożenia należy oczyścić z błon oponowych i naczyń krwionośnych. Używając sterylnych końcówek do igieł, ostrożnie usuń zanieczyszczenia z tkanki, pracując na wkładce chłodzącej. Oczyszczoną tkankę należy lekko przepłukać zimnym HBSS i przenieść do nowej szalki Petriego w celu posiekania.</li>
 <li>Pracując na wkładce chłodzącej, użyj wysterylizowanego ostrza żyletki, aby szybko posiekać tkankę na bloki o rozmiarach około 1 mm3. Praca z małymi porcjami oczyszczonej tkanki na raz zapewnia lepszą kontrolę nad procedurą siekania, co pozwala uzyskać bardziej jednorodne rozmiary bloków.</li>
 <li>Powoli przenieś posiekaną tkankę do 50 mL HBSS w probówce stożkowej o pojemności 50 mL. Delikatnie wypłucz szalkę Petriego za pomocą HBSS, aby zebrać wszystkie pozostałe bloki tkanki. Pozostaw bloki tkanki, aż opadną na dno probówki, tworząc luźny osad bloków tkankowych.</li>
 <li>Podczas osiadania tkanki, przenieś wcześniej schłodzony pojemnik do mrożenia oraz krioprobówki do komory bezpieczeństwa biologicznego. Otwórz wszystkie krioprobówki, aby przyspieszyć proces dodawania tkanki.</li>
 <li>Po osadzeniu się wszystkich bloków tkanki, delikatnie odessaj nadmiar HBSS, pozostawiając bardzo cienką warstwę medium nad osadem. Odradza się wirowanie, ponieważ spowoduje ono przyleganie bloków tkanki do siebie, co znacznie obniży efektywność mrożenia.</li>
 <li>Powoli pobierz 20 μL z dna luźnego osadu bloków tkankowych, używając końcówki pipety z szerokim otworem (odciętej sterylnymi nożyczkami). Przenieś materiał do jednej krioprobówki i przejdź do następnej, ponownie pobierając tkankę z dna osadu. Niezbędne jest, aby cała procedura rozdziału tkanki nie trwała więcej niż 3-4 min na jeden pojemnik do mrożenia. Zapewnia to, że tkanka jest wystawiona na działanie DMSO tylko przez krótki czas przed zamrożeniem. Po przeniesieniu tkanki do probówek, umieść pojemnik do mrożenia w zamrażarce -80oC na co najmniej 4 godz. Alternatywnie, pojemnik do mrożenia można pozostawić na noc w temperaturze -80 oC. Powtórz ten proces dla wszystkich pozostałych pojemników do mrożenia.</li>
 <li>Przenieś krioprobówki z pojemnika (pojemników) do mrożenia do krioboksu i umieść w zbiorniku z ciekłym azotem do długoterminowego przechowywania.</li>
</ol>
2. Rozmrażanie i hodowla zamrożonych bloków tkanki korowej
Przygotowanie materiałów
<ol>
 <li>Na jeden dzień przed rozmrożeniem próbek tkanek, poly-L– przygotowuje się szalki Petriego/szkiełka podstawowe powlekane lizyną. W przypadku neuronów korowych zazwyczaj przygotowujemy powlekane szalki z 500 μg/ml lub 1 mg/ml. Dodać odpowiednią ilość poli-L-roztwór lizyny (przygotowany w buforze boratowym), aby całkowicie zakryć dno naczynia. Jeśli wymagane jest użycie szklanych lamelki, należy upewnić się, że są one całkowicie zanurzone w roztworze poli-Lroztwór lizyny. Inkubować przez co najmniej 12 h. Przed użyciem dokładnie wypłukać szalki obfitą ilością sterylnej wody 3 razy, przez 5 min za każdym razem.</li>
 <li>Do oczyszczania rozmrożonej tkanki, a także do jej dysocjacji w celu uzyskania zawiesin komórkowych, stosuje się ocieplony HBSS. Wymagana objętość HBSS różni się w zależności od ilości rozmrażanej tkanki, jednak zazwyczaj jedną krioprobetkę rozcieńcza się w 50 mL HBSS i dysocjuje w 10 mL HBSS.</li>
 <li>podłoże Dulbecco's Modified Eagle Medium z dodatkiem 10% serum cielęcego wzbogaconego żelazem (EBS) i 1% mieszanki antybiotyków i antymikotyków (AA) (DMEM(++)) należy umieścić w 37°C łaźnia wodna</li>
 <li>Pożywka do wysiewania (NB(+++)) powinna być przygotowana bezpośrednio przed użyciem. Pożywkę tę sporządza się poprzez dodanie 1% antybiotyku/antymykotyku oraz suplementów B27 i N2.</li>
</ol>
Uwaga: Nazwy pożywek z dopisanymi krzyżykami (+) wskazują na dodatek substancji pomocniczych do składu podstawowego pożywki. W niniejszym tekście DMEM(++) oznacza DMEM oraz 10% EBS oraz 1% AA, natomiast NB(+++) oznacza NB oraz 1% AA oraz B27 oraz N2.
Rozmrażanie i hodowla
<ol>
 <li>Wyjmij krioprobówki z pojemnika z ciekłym azotem i szybko rozmroź w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C, aż wewnątrz probówki pozostanie jedynie niewielka grudka lodu.</li>
 <li>Ostrożnie przenieś zawartość probówki do 50mL ciepłego HBSS w probówce stożkowej. Użyj końcówki o szerokim otworze, aby delikatnie usunąć wszelkie pozostałe fragmenty tkanki przyklejone do ścianek krioprobówki. Odwróć probówkę 3-4 razy i pozwól tkance powoli opaść na dno. Tkanka powinna osiaść szybko, ale jeśli fragmenty są zbyt małe, może tak się nie stać i zaleca się lekkie wirowanie (~20 x g).</li>
 <li>Odsakcyj nadmiar HBSS.</li>
 <li>Dodaj do osadu tkankowego 10 mL ciepłego HBSS, 300 μL 0,25% trypsyny oraz 50 μL DNAazy. Inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 5 min, następnie umieść w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną ustawionej na 80 rpm i 37°C przez kolejne 5 min.</li>
 <li>Po tym czasie przenieś fragmenty tkanki do komory bezpiecznej biologicznie i za pomocą pipety 10 mL ostrożnie wymieszaj fragmenty tkanki, aż powstanie mętna zawiesina komórkowa. Zneutralizuj trypsynę, dodając 10 mL ciepłego DMEM(++) do zawiesiny komórkowej.</li>
 <li>Odwiruj rozdzielone komórki przy 1200 x g przez 5 min. Odsakcyj i odrzuć nadsącz, resuspenduj osad komórkowy w 10 mL ciepłego DMEM(++) i określ liczbę komórek za pomocą komory countingowej (hemocytometru).</li>
 <li>Wysiej komórki na płytki powlekane poli-L-lizyną. Zazwyczaj na płytce 60-mm wysiewa się 1x106 komórek.</li>
 <li>Pozostaw komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych na około 1 h, aby przyłączyły się do płytki/szkiełek podstawowych. Zaleca się monitorowanie procesu przyłączania na jednej płytce co 10 min, aż do uzyskania skutecznej adhezji. Następnie delikatnie wymień medium na świeży DMEM(++).</li>
 <li>Po 24 h zastąp DMEM(++) ciepłym NB(+++). Częściowe wymiany medium (50%) wykonuje się co 5 dni przy użyciu świeżego NB(+++). Zdrowe kultury zazwyczaj wykazują oznaki różnicowania i wzrostu wypustek po 24 h. W tych warunkach, przy dokonywaniu częściowych wymian medium co 4-5 dni, kultury można utrzymywać przez dłuższy czas, aż do 4-6 tygodni.</li>
 <li>W celu generowania neuronalnych komórek prekursorowych (NPCs) stosuje się podobny protokół, z wyjątkiem tego, że po wirowaniu używa się DMEM bez EBS. Komórki wysiewa się do kolb T-25 w medium DMEM/F12 (1:3) uzupełnionym o B27 i EGF (20 ng/ mL), aby umożliwić tworzenie neurosfer. Aby zróżnicować NPCs, neurosfery wysiewa się na szkiełka podstawowe powlekane lamininą (10 ug/ mL) w medium DMEM/F12 (1:3) uzupełnionym o N2.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Zdrowe hodowle wykażą znaczący wzrost i różnicowanie 5 dni po rozmrożeniu i zazwyczaj ustabilizują swój wzrost do 10. dnia (Rycina 1). Barwienie immunocytochemiczne tych hodowli ujawnia liczne astrocyty (Rycina 2A) i neurony (Rycina 2B) zarówno w przypadku pierwotnych hodowli neuronalnych ludzkich, jak i szczurzych. Niniejszy protokół nadaje się również do generowania NPC w formie wolno pływających neurosfer (Rycina 3A), które w warunkach różnicowania prowadzą do powstania wysokiej jakości hodowli mieszanych (Rycina 3B,C).
<img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig1.jpg" alt="Postęp wzrostu komórek w ciągu 10 dni; obrazy mikroskopowe pokazujące zmiany w gęstości i morfologii komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Hodowle komórkowe z zamrożonej tkanki kory mózgu człowieka. Zamrożone bloki tkanki kory mózgu człowieka poddano rozmrażaniu, a następnie wyłożono na szkiełka podstawkowe pokryte poli-lizyną i hodowano przez 10 dni. W 5. dniu widoczna była ekspansja komórek, a w 10. dniu osiągnięto pełną konfluencję. Pasek skali: 100 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig2.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna ludzkich i szczurzych komórek neuronalnych, przedstawiająca markery białkowe w kolorze czerwonym, zielonym oraz ich nakładanie się." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rysunek 2. Barwienie immunocytochemiczne kultur komórkowych. (A) Hodowle zabarwiono markerem glejowym – gliałkowym kwaśnym białkiem włókienstym (GFAP, grube strzałki). (B) Neurony wykryto za pomocą markera neuronalnego – beta-tubuliny III (TIII, cienkie strzałki). (C) Zarówno hodowle ludzkie, jak i szczurze wykazują obfitą obecność gleju i neuronów po 10 dniach hodowli. Przeciwciała pierwotne: mysie anty-GFAP (1:10) i królicze anty-TIII (1:100). Przeciwciała wtórne: anty-mysie Alexa 594 (1:50) i anty-królicze Alexa 48 (1:50). Barwienie jąder: błękitny Hoechst (1:100). Pasek skali: 50 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig3.jpg" alt="Różnicowanie komórek macierzystych; obrazy mikroskopowe przedstawiające sferoid, strukturę komórkową oraz wzrost filamentów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rysunek 3. Generowanie neurosfer. (A) Zamrożone tkanki przetworzono zgodnie z powyższym opisem i przeprowadzono ich propagację w formie neurosfer. (B) Neurosfery wysiano na szkiełka podstawkowe w warunkach różnicowania i hodowano przez 10 dni, co doprowadziło do migracji komórek z neurosfery. (C) Zarówno neurony, jak i astrocyty występują w rozszerzającym się obrzeżu różnicującej się neurosfery. Barwienie kontrastowe jąder oraz przeciwciała pierwotne i wtórne zastosowano tak jak na Rys. 2.

<ol><li>Robbins, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human brain tissue.</a> Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).</li>
<li>Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled-rate+freezing+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Controlled-rate freezing of human ES cells.</a> Biotechniques. 38, 879-880 (2005).</li>
<li>Paynter, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+practical+issues+for+cryopreservation+of+nerve+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells.</a> Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).</li>
<li>Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+stromal+vascular+fraction+of+adipose+tissue+in+a+serum-free+freezing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium.</a> J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Kriokonserwacja daje możliwość bankowania cennych próbek tkanki mózgowej do przyszłego wykorzystania. Opisujemy tutaj prosty, ale skuteczny protokół generowania zarówno kultur wzbogaconych w neurony, jak i neuronalnych komórek prekursorowych z zamrożonych bloków tkanki mózgowej. Ta ekonomiczna procedura pozwala uniknąć kosztów tradycyjnych technik kriokonserwacji, które wykorzystują droższe zamrażarki z kontrolowaną szybkością chłodzenia. Protokół umożliwia uzyskanie żywotnych kultur neuronalnych po rozmrażaniu, zapewniając szybki i skuteczny sposób zamrażania bloków tkankowych. Cały proces zamrażania może trwać zaledwie 20 minut. Oprócz pierwotnych kultur neuronalnych, z wykorzystaniem tej metody bloki tkankowe można rozmrażać w celu uzyskania NPC hodowanych jako wolno pływające neurosfery. W tym względzie brak surowicy w naszym medium do zamrażania zapewnia zachowanie komórek w stanie niedróżnicowanym. W warunkach różnicowania neurosfery wytworzone z zamrożonej tkanki wykazują tempo ekspansji i różnicowania bardzo zbliżone do neurosfer generowanych z tkanki świeżej.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td>Wysoka zawartość glukozy 1X</td></tr><tr><td>surowica cielęca bydlęca z dodatkiem</td><td>Hyclone</td><td>SH30072.03</td><td>Do pożywki hodowlanej </td></tr><tr><td>Pożywka Neurobasal-A (1X), płynna</td><td>Invitrogen</td><td>1088-022</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Suplement do pożywki Neurobasal</td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Suplement do pożywki Neurobasal</td></tr><tr><td>Trypsyna (10X)</td><td>Cellgro</td><td>25-054CI</td><td>Dysocjacja tkanki</td></tr><tr><td>Deoksiribonukleaza 1 z trzustki bydlęcej (DNaza)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-30KU</td><td>Dysocjacja tkankowa</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) (10X)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14065</td><td>Oczyszczanie tkanki, płukanie i medium do mrożenia</td></tr><tr><td>poli-L-lizyna- 500 mg</td><td>Invitrogen</td><td>P2636</td><td>Podłoże do adhezji komórek neuronalnych</td></tr><tr><td>antybiotyk-antymykotyk (100X), roztwór</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Aby zapobiec kontaminacji</td></tr><tr><td>Nawki do pipet z szerokim otworem (1-200 µl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-141</td><td>Aby zapobiec naprężeniom ścinającym komórek</td></tr><tr><td>Graduowane końcówki do pipet (101-1000 ul)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>precyzyjne igły prowadzące G1 21 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td>Oczyszczanie tkanki</td></tr><tr><td>pipeta 10 ml </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1071-0810</td><td>Opakowane indywidualnie</td></tr><tr><td>probówki 50 ml</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>926-9-04</td><td></td></tr><tr><td>Jednostronne ostrze do żyletek</td><td>Smith &amp;amp; Nephew Inc.</td><td>67-0238</td><td>Rozdrabnianie tkanki</td></tr><tr><td>szalka Petri z polistyrenu 60 x 15 mm </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td>Do hodowli ogólnej</td></tr><tr><td>szalka Petri z polistyrenu 100 x 15 mm </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0010</td><td>Do oczyszczania tkanek</td></tr><tr><td>Pojemnik kriogeniczny </td><td>Nalge Nunc international</td><td>5026-1010</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik do mrożenia</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5100-0001</td><td>&quot;Mr. Frosty&quot;</td></tr><tr><td>probówki kriogeniczne 2,0 ml</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td>Do medium do mrożenia</td></tr><tr><td>Etanol 200 proof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Do sterylizacji żyletki</td></tr></tbody></table>

kriokonserwacja bloków tkanki kory mózgowej w celu generowania silnie wzbogaconych kultur neuronalnych

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

W niniejszym badaniu przedstawiamy zestandaryzowany protokół skutecznej kriokonserwacji i rozmrażania bloków tkanki kory mózgu w celu generowania silnie wzbogaconych kultur neuronalnych. W tym protokole jako medium do mrożenia zastosowano 10% dimetylosulfoksyd (DMSO) rozcieńczony w buforze Hanksa (HBSS). Bloki tkanki korowej przeniesiono do krioprobówek zawierających medium do mrożenia i powoli zamrożono w tempie -1°C/min w pojemniku do mrożenia z kontrolowaną szybkością spadku temperatury. Przetwarzanie po rozmrożeniu i dysocjacja zamrożonych bloków tkankowych konsekwentnie pozwalały na uzyskanie kultur wzbogaconych w neurony, które wykazywały szybki wzrost neurytowy w ciągu pierwszych 5 dni hodowli oraz znaczną ekspansję sieci neuronalnej w ciągu 10 dni. Barwienie immunocytochemiczne z użyciem markera astrocytarnego – białka kwaśnego włókienka gliaz (GFAP) – oraz markera neuronalnego – beta-tubuliny klasy III, wykazało wysoką liczbę neuronów i astrocytów w kulturach. Generowanie kultur komórek prekursorowych neuronów po dysocjacji bloków tkankowych doprowadziło do powstania szybko rozwijających się neurosfer, które w warunkach różnicowania wytworzyły liczne neurony i astrocyty. Ten prosty protokół kriokonserwacji umożliwia szybkie, wydajne i niedrogie przechowywanie bloków tkanki kory mózgu, co zapewnia większą elastyczność przy późniejszym generowaniu kultur neuronów, astrocytów i komórek prekursorowych neuronów.

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę efektywnej kriokonserwacji i rozmrażania bloków tkanki kory mózgu w celu uzyskania silnie wzbogaconych kultur neuronalnych. Ten prosty protokół zapewnia elastyczność przy późniejszym generowaniu kultur neuronów, astrocytów oraz komórek prekursorowych neuronów.

Kriokonserwacja bloków tkanki kory mózgowej w celu generowania silnie wzbogaconych kultur neuronalnych

W niniejszym badaniu przedstawiamy zestandaryzowany protokół skutecznej kriokonserwacji i rozmrażania bloków tkanki kory mózgowej w celu wygenerowania wysokiej...

Witajcie, nazywam się Alan i pracuję w laboratorium dr Horney Lu na University of California Irvine w Departamencie Neurobiologii i Behawiorystyki. A ja jestem Bob. Dzisiaj dr Haro zaprezentuje szybki, wydajny i niezawodny protokół rutynowej krio konserwacji bloków tkanki kory mózgowej w celu późniejszej regeneracji wysokiej jakości pierwotnych kultur neuronowych.Zacznijmy zatem. Oczyszczoną i posiekaną tkankę umieszcza się w probówkach kriogenicznych zawierających 10% TMSO medium do mrożenia.Probówki kriogeniczne są umieszczane w pojemniku do zamrażania i przechowywane w temperaturze -80°C przez co najmniej cztery godziny. Zamrożone probówki kriogeniczne są następnie przenoszone do ciekłego azotu w celu długoterminowego przechowywania. W celu hodowli probówka kriogeniczna z AC jest rozmrażana w ciepłej kąpieli wodnej, a następnie płukana ciepłym HBSS w celu usunięcia pozostałego DMSO.Dodaje się świeże HBSS wraz z trypsyną w celu dysocjacji, po czym dodaje się DMM z 10% EBS. Aby zatrzymać enzymatyczną aktywność dysocjacyjną, komórki są wirowane, a osad resuspendTime w świeżym DMM z dodatkiem 10% EBS i wysiewany na naczynia powlekane polilizyną. Po 24 godzinach DMM zostaje zastąpiony suplementowanym medium neurobasal i komórki są hodowane przez 10 dni.W niniejszym protokole do siekania tkanki korowej przed użyciem wykorzystuje się stalowe ostrze żyletki. Ostrze musi być sterylizowane w 70% ethanolu przez co najmniej dwie godziny. Roztwór soli buforowej Hanksa HBSS o stężeniu 1x przygotowuje się poprzez rozcieńczenie 10-krotnego roztworu zapasowego w sterylnej wodzie; tak przygotowany roztwór 1x HBSS przechowuje się następnie na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu obróbki tkanki.Dimetylosulfotlenek lub DMSO jest stosowany jako krioprotektant w medium do mrożenia. Niniejszy protokół wykorzystuje rozcieńczenie DMSO w objętości 10% v/v w 1X-H-B-S-S-D-M-S-O; roztwór należy całkowicie wymieszać przed przechowywaniem w temperaturze 4 °C. Do kontrolowania szybkości zamrażania próbek wykorzystuje się pojemnik do mrożenia Nalgene.Pojemnik do mrożenia wypełnia się wcześniej oznakowanymi probówkami kriogenicznymi o pojemności 2,5 mililitra. W przypadku korzystania z kilku pojemników do mrożenia zaleca się ich odpowiednie oznakowanie i zaznaczenie przypisanego pojemnika na probówce. Wcześniej schłodzone medium do mrożenia z 10% DMSO oraz pojemnik do mrożenia zostają przeniesione do sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego.W tym miejscu do każdej z fiolek kriowych powoli dodaje się jeden mililitr medium do mrożenia. Po upewnieniu się, że zakrętki są szczelnie zamknięte, należy umieścić pojemnik do mrożenia z fiolkami w temperaturze czterech stopni Celsius za co najmniej dwie godziny przed obróbką tkanki. Wcześniej wysterylizowane ostrze żyletki należy dokładnie wypłukać, wykonując trzy trzyminuotowe płukania.Użycie sterylnej wody powinno być wystarczające do usunięcia pozostałości etanolu. Procedura płukania powinna być szybka, ponieważ żyletka jest podatna na utlenianie podczas przedłużonego zanurzenia w sterylnej wodzie. Przed oczyszczaniem tkankę należy umieścić w okładzie z lodu.Przepłucz lekko zimnym roztworem X-H-B-S-S, aby usunąć wszelkie swobodnie pływające zanieczyszczenia. Do oczyszczenia fragmentów tkanki z pozostałości błon i naczyń krwionośnych należy użyć wysterylizowanych igieł. Podczas oczyszczania należy zachować szczególną ostrożność, aby nie naruszyć strukturalnej integralności tkanki.Wraz ze wzrostem tej wartości, efektywność siekania oczyszczonej tkanki będzie wyraźnie inna niż w przypadku tkanki surowej; większość błon lub naczyń krwionośnych powinna zostać usunięta. Po oczyszczeniu i wypłukaniu tkanki można przystąpić do siekania. Ważne jest, aby wykonywać precyzyjne cięcia tkanki, tworząc bloki o wielkości około jednego milimetra sześciennego.Bloki o zbyt dużym rozmiarze powodują niższy odzysk komórek podczas rozmrażania. W przypadku mniejszych bloków należy jednak unikać nadmiernego przetwarzania. Posiekane tkanki można zbierać za pomocą autopipety i niewielkiej ilości schłodzonego X-H-B-S-S.Należy wypłukać naczynie za pomocą HBSS, aby odzyskać całą zebraną tkankę. Następnie tkankę dodaje się do dużej objętości 1X HBSS i pozwala jej opaść na dno, tworząc luźny osad. Pozwala to usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia; w czasie, gdy tkanka osiada w HBSS, należy przygotować wcześniej schłodzony pojemnik do mrożenia oraz probówki kriogeniczne przed rozdziałem tkanki.Należy odkręcić wszystkie fiolki, aby przyspieszyć proces napełniania tkanką. Ekspozycja na DMSO w temperaturze pokojowej nie powinna przekraczać 10 minut. Zaleca się pracę z jednym pojemnikiem do mrożenia na raz, aż do wykorzystania całej tkanki.Zacznij od aspiracji supernatu z luźnej tkanki, zbliżając końcówkę tak blisko osadu, jak to możliwe, aby go nie naruszyć. Następnie załóż na pipetę końcówkę o szerokim otworze o pojemności 200 µL. Nie należy używać końcówek o mniejszym otworze, ponieważ mogłoby to naruszyć strukturę bloków osiadających na dnie pelletu tkankowego.Należy powoli pobrać 200 µL tkanki. Umieścić tkankę w probówce kriogenicznej i powtarzać czynność dla kolejnych próbek, aż wszystkie probówki zostaną wypełnione. Może być wymagane zastosowanie zasady 10 minut.Szybko przenieś pojemnik z probówkami kriogenicznymi do zamrażarki w temperaturze -80°C na co najmniej cztery godziny lub na noc, jeśli czas jest ograniczony. Po upływie odpowiedniego czasu wyjmij pojemnik z zamrażarki i jak najszybciej umieść probówki kriogeniczne w pudełku kriogenicznym. Umieść pudełko kriogeniczne w statywie z pojemnikiem na ciekły azot w celu długoterminowego przechowywania.Wyjmij probówkę kriogeniczną z ciekłego azotu tak szybko, jak to możliwe, ograniczając czas ekspozycji pudełek kriogenicznych na temperaturę pokojową. Szybko rozmroź próbkę, zanurzając ją w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Zawsze utrzymuj zakrętkę powyżej poziomu wody. Często sprawdzaj stan próbki i kontynuuj rozmrażanie, aż do momentu zaobserwowania małego kryształka lodu.Przed wprowadzeniem do komory bezpiecznej sterylizuj probówkę kriogeniczną 70% ethanolem. Jeśli tkanka pozostanie na ściankach probówki kriogenicznej, dodaj do rozmrożonej tkanki dużą objętość ciepłego roztworu one X-H-B-S-S. Ostrożnie zbierz materiał za pomocą HBSS.Po zebraniu całej tkanki należy odwrócić probówkę trzy do czterech razy i pozwolić tkance opaść na dno. Krok ten zapewnia odpowiednie rozcieńczenie DMSO.Po osadzeniu tkanki odessać jak największą ilość supernatantu. Następnie dodać do niej 10 milliliters ciepłego, świeżego 1X HBSS. Dodać 300 microliters 0,25% trypsyny oraz 50 microliters DNase.Następnie należy rozdzielić tkankę poprzez delikatne wytrząsanie, aż do uzyskania zmętnionej zawiesiny komórkowej. Aktywność enzymatyczną należy zatrzymać, dodając ciepłe DMEM z dodatkiem 10% wzbogaconego surowicy bydlęcej (EBS). Zawiesiny komórkowe należy wirować przy 1200 G przez pięć minut. Osad komórkowy należy zawiesić ponownie w świeżym DMEM z dodatkiem 10% EBS i wysiać na płytki pokryte polilizyną.Pozostaw komórki do przyczepienia do naczyń na 30 minut. Następnie wymień pożywkę na świeże DM z dodatkiem 10% EBS. Po 24 godzinach wymień pożywkę DM na pożywkę neurobasal uzupełnioną o N2 i B27 i hoduj przez 10 dni.Przedstawiliśmy właśnie obszerny, wydajny i niezawodny protokół rutynowej kriokonserwacji bloków tkanki korowej. Życzymy powodzenia.

cryopreservation-cortical-tissue-blocks-for-generation-highly

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Kriokonserwacja bloków tkanki korowej w celu wygenerowania wysoce wzbogaconych kultur neuronów

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania kultur neuronalnych z kory mózgu myszy w późnym stadium embrionalnym i wczesnym okresie postnatalnym. Kultury te mogą być wykorzystywane do immunocytochemii, biochemii, elektrofizjologii, obrazowania wapnia i sodu, a także stanowią platformę do badania rozwoju neuronalnego zwierząt transgenicznych posiadających postnatalnie letalną mutację genu.

Przygotowanie dysocjowanych kultur neuronów korowych myszy

Niniejszy protokół opisuje etapy niezbędne do wyizolowania, transfekcji metodą elektroporacji oraz hodowli neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Hodowle krótkoterminowe mogą być wykorzystywane do badań nad wzrostem i prowadzeniem aksonów, natomiast hodowle długoterminowe mogą służyć do badań nad synaptogenezą i analizy kolców dendrytycznych.

Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

Opisano prostą i niezawodną metodę izolacji oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych z odrzuconej ludzkiej tkanki kory płodowej. Hodowle pochodzące z rozpoznanych neurologicznych schorzeń człowieka mogą być wykorzystywane do charakteryzacji patologicznych procesów komórkowych i molekularnych, a także stanowić platformę do oceny skuteczności farmakologicznej.

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Źródło: Palma-Tortosa, S., et.al. Hodowle organotypowe dorosłej ludzkiej kory mózgowej jako model ex vivo do przeszczepiania i walidacji ludzkich komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje przeszczep neuronalnych komórek progenitorowych pochodzących z komórek macierzystych do wycinków ludzkiej tkanki korowej. Procedura polega na wyizolowaniu i ponownym zawieszeniu komórek progenitorowych w macierzy błony podstawnej, a następnie wstrzyknięciu ich do wycinka korowego...

Przeszczepianie progenitorów neuronalnych pochodzących z komórek macierzystych do ludzkich wycinków korowych

Ten film demonstruje metodę hodowli kriokonserwowanych neuronów embrionalnych, obejmującą kontrolowane rozmrażanie, rozcieńczanie pożywką neurobazalną i wysiewanie na płytkę pokrytą poli-L-lizyną. Późniejsza inkubacja wspomaga wzrost i utrzymanie połączeń neuronalnych.

Generowanie hodowli neuronów pierwotnych o niskiej gęstości z zamrożonych neuronów embrionalnych

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania Ca2+ w neuronach i komórkach glejowych, który umożliwia analizę sygnałów Ca2+ w rozdzielczości subkomórkowej. Proces ten ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, które umożliwiają ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 +.

Analiza lokalnych sygnałów Ca2 + w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca2 +

Prezentowany tutaj jest protokół spontanicznego generowania neurosfer wzbogaconych w neurony progenitorowe neuronów o dużej gęstości. Podczas tego samego eksperymentu, gdy neurony są powlekane o mniejszej gęstości, protokół powoduje również przedłużone hodowle pierwotnych neuronów szczurów.

Generowanie neurosfer z mieszanych pierwotnych neuronów hipokampa i kory mózgowej wyizolowanych z zarodka szczura E14-E16 Sprague Dawley

Tutaj prezentujemy proste podejście wykorzystujące specyficzne podłoża hodowlane, które pozwala na tworzenie kultur wzbogaconych o neurony i astrocyty, lub kultur gleju neuronów z kory embrionalnej, o wysokiej wydajności i odtwarzalności.

Model hodowli komórkowej do badania roli interakcji neuron-glej w niedokrwieniu

W tym badaniu przedstawiamy szczegółową technikę prostego, ale solidnego systemu hodowli organoidów korowych przy użyciu standardowych kultur hPSC bez karmienia. Jest to szybki, wydajny i powtarzalny protokół generowania organoidów, które modelują aspekty starzenia się mózgu in vitro.

Solidna i wysoce odtwarzalna generacja organoidów korowych mózgu do modelowania starzenia się neuronów mózgu in vitro

Gotowy do użycia zamrożony zasób neuronów jest potężnym narzędziem do oceny funkcji synaptycznych. Tutaj wprowadzamy łatwą hodowlę pierwotną o niskiej gęstości z zamrożonego wywaru przy użyciu 96-dołkowej płytki.

Łatwa i powtarzalna hodowla pierwotna o niskiej gęstości przy użyciu zamrożonego materiału embrionalnych neuronów hipokampa

Poznaj metodę kriokonserwacji bloków tkanki korowej w celu uzyskania wysoko wzbogaconych kultur neuronalnych. Protokół zapewnia wydajne mrożenie z DMSO i rozmrażanie w łaźni wodnej.

Kriokonserwacja bloków tkanki kory mózgowej w celu generowania silnie wzbogaconych kultur neuronalnych

Przeglądaj więcej filmów