Solidna i wysoce odtwarzalna generacja organoidów korowych mózgu do modelowania starzenia się neuronów mózgu in vitro

Protokół ten rozwiązuje kilka kluczowych problemów związanych z generowaniem organoidów, takich jak solidność i niezawodność, a my byliśmy w stanie zastosować te ulepszone organoidy do innowacyjnych badań nad starzeniem się neuronów. Heterogeniczność i odtwarzalność są istotnymi kwestiami podczas generowania organoidów korowych mózgu. Aby je przezwyciężyć, najpierw różnicujemy hPSC w kolonie neuroektodermalne, a następnie sferoidy nabłonka nerwowego, które generują odtwarzalną architekturę tkanki.

Te korowe organoidy mózgowe zaczynają wykazywać typowe oznaki starzenia się po długotrwałej hodowli in vitro, co czyni je użyteczną platformą do badania procesów neuronalnych związanych ze starzeniem się. Na początek umieść kolonie hPSC na matrycy błony podstawnej kwalifikowanej do hESC z jednej studzienki z sześciodołkowej płytki przy 60% konfluencji do trzech dołków, aby osiągnąć gęstość od 20 do 30%, a następnie przystąp do indukcji kolonii neuroektodermalnych 2D. Dodawaj świeże podłoże N2 uzupełnione podwójnymi inhibitorami SMAD codziennie do każdej studzienki przez następne trzy dni.

Aby wygenerować sferoidy neuroektodermalne 3D z indukowanych kolonii neuroektodermalnych 2D, usuń dwa mililitry pożywki N2 z płytki sześciodołkowej i przemyj jeden raz HBSS, aby upewnić się, że cała pożywka N2 została usunięta. Dodaj jeden mililitr dypazy do każdej dobrze zawierającej kolonię. Inkubuj płytkę przez 20 do 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i regularnie sprawdzaj, czy kolonia nie została oderwana.

Pod koniec inkubacji, aby zatrzymać aktywność enzymu dyspazy, dodaj jeden mililitr pożywki N2 do dołka. Używając końcówki do pipety P1000 o szerokim otworze lub zmodyfikowanej końcówki do pipety P1000 wyciętej sterylnymi nożyczkami, przenieś kolonie do rurki o pojemności 15 mililitrów i pozwól, aby grudki kolonii opadły na dno rurki pod wpływem grawitacji. Następnie za pomocą standardowej końcówki do pipet P1000 ostrożnie usuń supernatant.

Zastąp go jednym mililitrem świeżej pożywki N2 i powtórz mycie trzy razy, aby zapewnić całkowite usunięcie dypazy. Po ponownym zawieszeniu grudek komórek i pożywki N2 przenieś zawiesinę komórek do jednego dołka płytki sześciodołkowej i dodaj 40 nanogramów na mililitr bFGF. Po kriosekcji organoidów należy usunąć nadmiar roztworu montażowego, przenosząc szkiełka do pojemnika do barwienia szkiełek z pokrywką i umyć podzieloną tkankę organoidu trzykrotnie PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie inkubuj szkiełka przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza ze świeżo przygotowanym roztworem barwiącym beta-galaktozydazę. Przemyć zabarwione tkanki trzykrotnie PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia roztworu beta-galaktozydazy. Teraz zamontuj umyte chusteczki za pomocą szklanego środka zapobiegającego blaknięciu i pozwól roztworowi montażowemu zestalić się przez 30 minut w temperaturze pokojowej przed obejrzeniem go pod mikroskopem.

Przed różnicowaniem neuroektodermalnym kolonie hPSC wykazywały ciasną płaską morfologię jednowarstwową bez zróżnicowanych komórek zanieczyszczających kolonie. Ekspresja NANOG potwierdziła również pluripotencję kolonii hPSC. Po różnicowaniu kolonii hPSC w kolonie neuroektodermalne zaobserwowano dłuższą morfologię w kształcie kolumny, która była ujemna dla NANOG.

Po leczeniu dyspazą i ekspozycji na FGF2 w N2, nerwowe komórki macierzyste w tych sferoidach namnażały się i tworzyły znaczną liczbę rozet nerwowych, które wykazywały wierzchołkowo-podstawową polaryzację sferoidy poprzez ekspresję Z01 w komórkach w środku i na zewnętrznej krawędzi sferoidy. Po osadzeniu sferoida szybko się namnaża i zaczyna pączkować, na co wskazuje obecność zwartych węzłów tkankowych i ich rozszerzanie się na zewnątrz od głównego ciała w okresie od jednego do trzech tygodni, co zostało dodatkowo potwierdzone przez analizę ilościową, a średnica sferoidy znacznie wzrosła w ciągu trzech tygodni. Barwienie immunofluorescencyjne potwierdziło obecność neuroprogenitorowych komórek progenitorowych i markerów warstwy korowej w organoidach z wyraźnymi warstwami, które można było zaobserwować w różnych punktach czasowych.

Badano również wpływ procesów związanych ze starzeniem się neuronów na mózg. Z czasem zaobserwowano znaczny wzrost obecności beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem się, a w 13. tygodniu wykryto obecność p21, co wskazuje na starzenie się. Ważne jest, aby upewnić się, że cały nadmiar dypazy został usunięty i że delikatnie odłączasz i ponownie zasiewasz nienaruszone kolonie neuroektodermalne, aby utworzyć zdrowe sferoidy.

Ta platforma naszej wyjątkowej okazji do badania biologii starzenia się ludzkiego mózgu, pozwala również na badania nad krytycznym rozwojem mózgu, pod warunkiem, że organoidy te są hodowane przy użyciu bioreaktora.