JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:40 min • August 29th, 2025
Zacznij od nerwu kulszowego odizolowanego od myszy.
Neurony w nerwie zostały transfekowane w celu ekspresji fluorescencyjnych białek cytoplazmatycznych.
Nerw został zmiażdżony w celu wywołania urazu, który został oznaczony szwem.
Uszkodzone segmenty aksonów w tym miejscu ulegają degeneracji, a zrekrutowane makrofagi usuwają szczątki.
Komórki Schwanna namnażają się, tworząc ścieżki prowadzące i wydzielają czynniki neurotroficzne, które sprzyjają odrastaniu aksonów. Aksony rozciągają się wzdłuż tych ścieżek, regenerując nerw.
Napraw nerw, aby zachować struktury komórkowe, a następnie usuń wszelkie przyczepione tkanki nieneuronalne.
Przemyć buforem, aby usunąć resztki utrwalaczy.
Umieść nerw na szkiełku mikroskopowym, nałóż podłoże mocujące i umieść szkiełko nakrywkowe.
Spłaszcz nerw, aby ustawić aksony w tej samej płaszczyźnie ogniskowej do obrazowania.
Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego prześledź aksony od miejsca zgniecenia do ich dystalnych końców, aby
zmierzyć długość regeneracji.
Oddziel DRG razem z korzeniami nerwowymi i nerwem kulszowym, ostrożnie za pomocą mikronożyczek i mikrokleszczyków pod mikroskopem preparacyjnym.
Następnie przenieś nerw kulszowy bezpośrednio w 4% PFA przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby zobrazować i zmierzyć znakowane fluorescencyjnie aksony czuciowe pod mikroskopem preparacyjnym, ostrożnie zdejmij przyczepioną tkankę i błonę na utrwalonym nerwie kulszowym za pomocą mikronożyczek i mikrokleszczyków. Następnie trzykrotnie przemyj nerw PBS.
Następnie umieść nerw kulszowy na szkiełku i trzymaj go prosto. Dodaj 80 mikrolitrów roztworu zapobiegającego blaknięciu wokół nerwu, a następnie połóż na nim szkiełko nakrywkowe. Spłaszcz całą zamontowaną tkankę pod naciskiem.
Następnie umieść spłaszczoną tkankę pod odwróconym mikroskopem epifluorescencyjnym, wyposażonym w akcesorium do akwizycji mozaiki i przetwarzania obrazu. Mierząc długość zregenerowanych aksonów, prześledź wszystkie możliwe do zidentyfikowania fluorescencyjnie znakowane aksony w nerwie kulszowym od miejsca zmiażdżenia do dystalnych końców aksonów.