Regeneracja aksonów w nerwie kulszowym myszy po urazie zmiażdżenia

Zacznij od nerwu kulszowego odizolowanego od myszy.

Neurony w nerwie zostały transfekowane w celu ekspresji fluorescencyjnych białek cytoplazmatycznych.

Nerw został zmiażdżony w celu wywołania urazu, który został oznaczony szwem.

Uszkodzone segmenty aksonów w tym miejscu ulegają degeneracji, a zrekrutowane makrofagi usuwają szczątki.

Komórki Schwanna namnażają się, tworząc ścieżki prowadzące i wydzielają czynniki neurotroficzne, które sprzyjają odrastaniu aksonów. Aksony rozciągają się wzdłuż tych ścieżek, regenerując nerw.

Napraw nerw, aby zachować struktury komórkowe, a następnie usuń wszelkie przyczepione tkanki nieneuronalne.

Przemyć buforem, aby usunąć resztki utrwalaczy.

Umieść nerw na szkiełku mikroskopowym, nałóż podłoże mocujące i umieść szkiełko nakrywkowe.

Spłaszcz nerw, aby ustawić aksony w tej samej płaszczyźnie ogniskowej do obrazowania.

Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego prześledź aksony od miejsca zgniecenia do ich dystalnych końców, aby

zmierzyć długość regeneracji.

Oddziel DRG razem z korzeniami nerwowymi i nerwem kulszowym, ostrożnie za pomocą mikronożyczek i mikrokleszczyków pod mikroskopem preparacyjnym.

Następnie przenieś nerw kulszowy bezpośrednio w 4% PFA przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby zobrazować i zmierzyć znakowane fluorescencyjnie aksony czuciowe pod mikroskopem preparacyjnym, ostrożnie zdejmij przyczepioną tkankę i błonę na utrwalonym nerwie kulszowym za pomocą mikronożyczek i mikrokleszczyków. Następnie trzykrotnie przemyj nerw PBS.

Następnie umieść nerw kulszowy na szkiełku i trzymaj go prosto. Dodaj 80 mikrolitrów roztworu zapobiegającego blaknięciu wokół nerwu, a następnie połóż na nim szkiełko nakrywkowe. Spłaszcz całą zamontowaną tkankę pod naciskiem.

Następnie umieść spłaszczoną tkankę pod odwróconym mikroskopem epifluorescencyjnym, wyposażonym w akcesorium do akwizycji mozaiki i przetwarzania obrazu. Mierząc długość zregenerowanych aksonów, prześledź wszystkie możliwe do zidentyfikowania fluorescencyjnie znakowane aksony w nerwie kulszowym od miejsca zmiażdżenia do dystalnych końców aksonów.