Wykorzystanie chipów mikroprzepływowych do obrazowania na żywo i badania reakcji na urazy u larw Drosophila
7 lutego 2014
Larwy Drosophila są atrakcyjnym systemem modelowym do obrazowania na żywo ze względu na ich przezroczyste naskórki i silną genetykę. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać jednowarstwowe urządzenie PDMS, zwane "chipem larwowym" do obrazowania na żywo procesów komórkowych w neuronach larw Drosophila w trzecim stadium
rozwojowym.Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest nieinwazyjne unieruchomienie larw Drosophila w celu obrazowania na żywo przy użyciu zmodyfikowanej komory mikroprzepływowej. Trzecia larwy gwiazd jest umieszczana w chipie z odrobiną oleju, aby pomóc uszczelnić larwy. Następnie chip umieszcza się na larwach tak, aby jego ciało zmieściło się w komorze.
Chip jest podłączony do strzykawki, dzięki czemu można zastosować podciśnienie. Ruchliwość larw zostaje ograniczona, a struktury w brzusznej części zwierzęcia są popychane blisko szkiełka nakrywkowego. Za pomocą mikroskopu konfokalnego można łatwo zobrazować struktury, takie jak szczegóły zakończeń aksonów neuronów czuciowych i regeneracja nerwów segmentowych po indukowanym uszkodzeniu nerwów.
Inne metody unieruchomienia josepha do obrazowania na żywo, ogromny eter chloroformowy lub znieczulenie ISO. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala uniknąć ogromnej ilości takich toksyn, które zaburzają fizjologię zwierzęcia. Dodatkową korzyścią wynikającą z braku toksyn jest to, że larwa GB jest bezpieczna i można z nią pracować. Solidne unieruchomienie pozwala na obrazowanie szybkich zdarzeń, takich jak szybszy transport aksonalny i zmiany wewnątrzkomórkowego wapnia.
Pojedyncza larwa może być wielokrotnie unieruchomiona i zobrazowana w chipie. Pozwala to na życie w czasie. Obrazowanie procesów zachodzących w ciągu do 72 godzin Rozpocznij od uzyskania próbki chipa PDMS, aby wypróbować ten protokół.
Instrukcję, jak wykonać chip A-P-D-M-S z formy SU ósemki, można odczytać w protokole tekstowym za pomocą igły dozującej o rozmiarze 21. Zrób otwór w porcie próżniowym chipa PDMS dla odwróconego mikroskopu. Wyjmij igłę o rozmiarze 23 z podstawy, piastę zamka za pomocą kilku przekręceń.
Następnie włóż końcówkę igły do małego kawałka rurki polietylenowej tak, aby rurka zakrywała co najmniej milimetr igły. Użyj żyletki, aby odciąć nadmiar rurek. Pozostawia to plastikowy pierścień, który może wykonać uszczelnienie.
Włóż końcówkę igły o rozmiarze 23 do otworu w porcie próżniowym. W przypadku mikroskopu pionowego przebij drugi otwór z boku chipa PDMS za pomocą igły dozującej o rozmiarze 21. Ten otwór zapewni dostęp do pierwszego otworu z boku.
Następnie włóż końcówkę igły o rozmiarze 23 i pierścień rurki do bocznego otworu. Umieść kawałek taśmy dwustronnej na górze chipa PDMS, aby uszczelnić górny otwór. Podłącz rurkę polietylenową o długości 20 centymetrów między końcówką igły włożoną w port próżniowy chipa a jednym z portów zaworu trójdrogowego.
Następnie podłącz strzykawkę o pojemności 20 mililitrów do jednego z dwóch pozostałych portów zaworu, pozostawiając ostatni port otwarty. Wyczyść chip PDMS przezroczystą taśmą klejącą. Przymocuj kawałek taśmy do dolnej części chipa.
Upewnij się, że taśma dotyka całej powierzchni PDMS, a następnie odklej taśmę. Powtórz tę metodę czyszczenia trzy razy. Ponieważ chip PDMS jest wielokrotnego użytku, bardzo ważne jest usunięcie pozostałości oleju, ponieważ może to wpłynąć na przyczepność PDM do szkła Transfer wczesne żerowanie.
Larwy trzeciego stadium rozwojowego z pożywienia na szalkę Petriego zawierającą wodę. Musi mieć od 3,5 do czterech milimetrów długości, aby prawidłowo pasował do chipa. Wykąpać larwy, aby usunąć pożywkę hodowlaną.
Następnie odtwarza małą kroplę oleju halo carbon 700 na środku szklanego szkiełka nakrywkowego, za pomocą kleszczy delikatnie podnosi umyte larwy. Na krótko umieść go na lekkiej chusteczce, aby wytarć go ręcznikiem, a następnie przenieś go do oleju na 10 sekund. Kropla powinna być na tyle mała, aby tchawica larw nie była pokryta.
Następnie umieść larwy na czystym szklanym szkiełku nakrywkowym na krótko i przenieś je na inne szkiełko nakrywkowe. W ten sposób usuwa się nieco więcej oleju. Zwróć uwagę na orientację larw, aby zobrazować rdzeń nerwowy i nerwy segmentowe.
Strona brzuszna powinna być skierowana w dół. Łatwo zidentyfikowane rurki dotchawicze powinny być skierowane do góry. Teraz delikatnie umieść chip PDMS na larwach.
Wyrównaj larwy do środka mikrokomory. Z tyłem skierowanym w stronę portu próżniowego, larwa nie powinna dotykać krawędzi komory. Po wyrównaniu dociśnij chip PDMS do szkiełka pokrywy, aby uzyskać dobre uszczelnienie.
Następnie dokładnie sprawdź, czy larwy są całkowicie zamknięte w mikrokomorze. Teraz przełącz zawór trójdrogowy na strzykawkę. Przytrzymaj mocno zespół PDMS i pociągnij tłok strzykawki, aby pobrać od dwóch do 2,5 milimetra powietrza, aż poczujesz opór.
W ten sposób powstaje próżnia. Następnie wyłącz zawór. Aby dokładnie utrzymać próżnię, dokładnie sprawdź larwy.
Jego ciało powinno być unieruchomione wewnątrz mikrokomory, a tchawica powinna być widoczna. Reszta chipa PDMS powinna stykać się ze szkiełkiem nakrywkowym Takie orientacje nie są prawidłowe. Teraz wyobraź sobie larwy.
Jeśli używasz mikroskopu pionowego, przymocuj górną stronę chipa do stolika za pomocą taśmy dwustronnej. Po zakończeniu obrazowania zwolnij podciśnienie. Następnie odłącz chip PDMS od szkiełka nakrywkowego.
Larwa powinna być natychmiast ruchliwa za pomocą kleszczy. Umieść larwy z powrotem na talerzu z sokiem winogronowym w celu odzyskania. Umieść pojedynczą znieczuloną larwę na talerzu z sokiem winogronowym.
Pod mikroskopem stereoskopowym odwróć zwierzę brzuszną stroną do góry. Aby uwidocznić brzuszny rdzeń nerwowy i nerwy segmentowe, upewnij się, że larwa jest całkowicie nieruchoma. Zlokalizuj rdzeń nerwowy i gruczoły ślinowe.
Ważne jest, aby nie uszkodzić tych konstrukcji. Zlokalizuj koniec trzeciego segmentu brzucha. Uraz w tym miejscu uszkadza najwięcej nerwów i jest najłatwiejszy do odtworzenia bez zabijania zwierzęcia.
Uraz można również przeprowadzić w bardziej tylnych segmentach za pomocą podwójnej gwiazdy numer pięć, kleszczy. Ściśnij mocno nerwy segmentowe przez naskórek przez pięć do 10 sekund. Przy prawidłowym wykonaniu naskórek pozostaje nienaruszony, a ściana ciała nie jest przekłuwana.
Mistrzostwo będzie wymagało praktyki po tym, jak kontuzja umieściła zwierzę brzuszną stroną do dołu na wielkim talerzu. Powinien być w stanie poruszać głową i jeść. Jeśli uraz się powiódł, tylna połowa larw zostanie sparaliżowana.
Chip larwy wykorzystano do zobrazowania transportu pęcherzyków synaptycznych za pośrednictwem kinezyny w obrębie poszczególnych aksonów obwodowych. Ruch tych pęcherzyków w stopniu entero mierzono na poziomie około 1,0 mikronów na sekundę. Ruch wsteczny był taktowany z prędkością 0,8 mikrona na sekundę.
Technikę unieruchomienia zastosowano w mikrochirurgii laserowej z wykorzystaniem pulsacyjnego lasera barwnikowego UV. Poziom wapnia obserwowano w określonych neuronach dzięki genetycznie kodowanemu wskaźnikowi. Obóz G 3.0 skok wapnia jest wykrywany po neuronze czuciowym.
Dendryt jest transektowany. Pozwolenie zwierzęciu na odpoczynek między sesjami obrazowania pozwala na oglądanie zdarzeń komórkowych w czasie. Po zmiażdżeniu aksonów szemerycznych neuronów ruchowych, kikut bliższego aksonu uległ nowemu kiełkowaniu.
Tymczasem dystalne aksony tworzyły żylaki i ulegały fragmentacji w procesie zwyrodnienia walleriana. Możliwe jest również wykorzystanie larw do śledzenia przekształconych białek fluorescencyjnych in vivo. Białko fuzyjne DRA dwóch alfa-tubuliny ulegające ekspresji w neuronach czuciowych klasy czwartej uległo fototransformacji w ciałach komórek.
W ciągu dwóch dni znaczna ilość białka przekształconego w światło została przeniesiona do zakończeń aksonów neuronów czuciowych w odległości około milimetra od pierwotnego miejsca w ciele komórki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać chip larwalny do obrazowania larw larw drosophila na żywo i jak przeprowadzić uraz zmiażdżenia nerwu. Po opanowaniu tych technik larwy można umieścić pod mikroskopem w ciągu zaledwie kilku minut.
Zmiażdżenie nerwów jest równie szybkie. Dlatego procedury te mogą być wykorzystywane do eksperymentów na dużą skalę, takich jak stopnie genetyczne. Chip może być wykorzystany do obrazowania struktur po brzusznej stronie larw Drosophila.
Należą do nich między innymi mięśnie, synapsy połączeń nerwowo-mięśniowych, neurony czuciowe, nerwy obwodowe i brzuszny rdzeń nerwowy. Procedura ta może być również stosowana do przeprowadzania obrazowania na żywo serca larw, gruczołów ślinowych i tchawicy. Chip larwy użyty w tym filmie ma rozmiar dla zwierzęcia o długości od 3,5 do czterech milimetrów.
Do obrazowania jest mniejszy lub większy, można łatwo wykonać chip zwierzęcy z mniejszą lub większą komorą. Zobacz dodatkowy plik projektowy i instrukcję tworzenia chipów PDMS. Instrukcja wykonania chipów PDMS znajduje się w pisemnym protokole.
Możemy wysłać Ci próbkę chipa, jeśli się z nami skontaktujesz.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę nieinwazyjnego unieruchamiania larw Drosophila do obrazowania in vivo przy użyciu zmodyfikowanej mikrofluidynacznej komory. Technika ta pozwala na obserwację procesów komórkowych w neuronach, szczególnie w kontekście transportu aksonowego i regeneracji nerwów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania in vivo
Tło
- Larwy Drosophila są cennym modelem do badania procesów neuronowych ze względu na swoją przezroczystość i dostępność genetyczną.
- Obrazyowanie in vivo może zapewnić wgląd w dynamiczne zdarzenia komórkowe w czasie rzeczywistym.
- Tradycyjne metody unieruchamiania często wymagają szkodliwych środków znieczulających, które mogą wpływać na fizjologię.
- Ten protokół ma na celu zapewnienie bezpieczniejszej alternatywy dla obrazowania bez toksycznych substancji.
Cel badania
- Opracowanie nieinwazyjnej metody unieruchamiania larw Drosophila do obrazowania.
- Ułatwienie obserwacji struktur i procesów neuronowych.
- Możliwość wielokrotnego obrazowania tej samej larwy przez dłuższy okres.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie mikrofluidynacznego urządzenia PDMS do unieruchamiania larw.
- Zastosowanie próżni do ograniczenia ruchliwości larw.
- Obrazyowanie za pomocą mikroskopu konfokalnego do wizualizowania struktur neuronowych.
- Szczegółowa przygotowanie chipu PDMS i pozycjonowanie larw dla optymalnego obrazowania.
Główne wyniki
- Skuteczna unieruchomienie larw bez użycia toksycznych środków znieczulających.
- Wyraźne obrazyowanie zakończeń aksonów neuronów czuciowych i regeneracji nerwów segmentalnych.
- Możliwość przeprowadzania obrazowania time-lapse przez 72 godziny.
- Demonstracja transportu wezykul synaptycznych za pośrednictwem kinezyn.
Wnioski
- Zmodyfikowana komora mikrofluidynaczna zapewnia bezpieczną i skuteczną metodę obrazowania in vivo larw Drosophila.
- Podejście to umożliwia badanie szybko zachodzących zdarzeń neuronowych i procesów regeneracyjnych.
- Protokół może być dostosowany do różnych zastosowań obrazowania w badaniach neuronauki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Non-invasive immobilization of model organisms enables longitudinal imaging of dynamic cellular processes without pharmacological confounders, supporting mechanistic de-risking in target validation. The larva chip facilitates repeated imaging sessions over 72 hours, allowing assessment of axonal transport, injury responses, and regeneration in a physiologically relevant system. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by preserving native biology during observation of neuronal dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct visualization of axonal transport and calcium signaling in neurons.
- Operational Value: Supports functional target validation by allowing repeated imaging of the same larva to assess target engagement and pathway modulation over time.
- Predictive Value: Provides quantitative readouts of organelle trafficking and injury-induced responses, improving target confidence in neuroscience discovery.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by immobilizing larvae for consistent, high-resolution imaging of ventral structures.
- Reproducibility: Enables standardized preparation and sealing of larvae in PDMS microchambers, reducing variability in live imaging assays.
- Scalability: Facilitates rapid immobilization and imaging cycles, supporting medium-throughput evaluation of genetic or pharmacological perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models axonal injury and regeneration processes relevant to neurodegenerative disease mechanisms.
- Translational Continuity: Bridges discovery imaging with preclinical validation by enabling time-lapse studies of Wallerian degeneration and axonal sprouting.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying regenerative versus degenerative responses to nerve crush injury.
Pipeline & Workflow Integration
The larva chip integrates into early discovery workflows by enabling live imaging of neuronal processes prior to lead identification, supporting hypothesis testing and pathway clarification in Drosophila-based models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through direct imaging of kinesin-mediated vesicle transport and calcium fluxes in sensory neurons.
- Screening: Delivers assay readiness via reproducible immobilization and ventral-side proximity to coverslip for consistent imaging.
- Analytics: Enables quantitative measurement of axonal transport rates (1.0 µm/s anterograde, 0.8 µm/s retrograde) and calcium spike detection using genetically encoded indicators.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling axonal injury responses, including sprouting and fragmentation, over extended time courses.
- Enterprise Reuse: Positions the PDMS microfluidic chip as a reusable platform for longitudinal studies across multiple experimental sessions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by enabling observation of rapid neuronal events without anesthetic-induced physiological disruption.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized chip preparation, vacuum-based immobilization, and cleaning protocols to prevent oil residue interference.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by allowing repeated use of single larvae, reducing animal numbers needed for longitudinal studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through quantifiable imaging of degeneration and regeneration metrics post-injury.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, vacuum system operation, and confocal microscopy for optimal imaging.
- Depends on access to PDMS molding tools, syringe-based vacuum ports, and polyethylene tubing for sealing and fluidic connections.
- Necessitates cross-team standardization of larval preparation, oil application, and chamber alignment to ensure consistent immobilization.
- Involves adaptation considerations for different larval sizes, requiring chip dimension adjustments based on body length (3.5–4 mm for standard chip).
- Includes practical limitations such as the need to avoid tracheal oil coating and ensure proper ventral-side orientation for nerve cord visualization.
