Iniekcja dokomorowa in utero i elektroporacja zarodków myszy E15

Cześć, nazywam się William Tis i pracuję w Krete Lab. Dzisiaj ja i inni pokażemy Wam wewnątrzmaciczne zastrzyki z mysich zarodków E 15. Cześć, nazywam się Laura Elias.

Dzisiaj pokażę Ci, jak przygotować pipety do mikroiniekcji i załadować pipety do iniekcji dokomorowych i elektroporacji, które będziemy wykonywać. Nazywam się David Castaneda i dzisiaj będę asystował przy iniekcjach in vivo in utero zarodków myszy. Będziemy wstrzykiwać plazmidowe DNA do bocznej komory rozwijających się zarodków myszy.

Celujemy w korę CE tych zarodków, aby uzyskać ekspresję różnych cząsteczek przez komórki glejowe, które staną się neuronami w późniejszym rozwoju. Podczas wykonywania tych zastrzyków wewnątrzmacicznych jest kilka ważnych narzędzi, których będziesz musiał użyć, a ja ci je pokażę. Teraz. Używamy swobodniejszych, kilku dodatkowych kleszczy.

Jedna, jedna para, która jest ząbkowana, a druga para, która ma mały ząb na końcu. Używamy pary hemostatów. To jest para nożyczek.

A potem używamy tych dwóch zszywaczy. To są te większe, które, których używamy dla szczurów. Jest to mniejszy, którego używamy dla myszy.

Używa zszywki w rozmiarze siedem, a to oznacza zszywkę w rozmiarze dziewięć i są one po prostu obciążone sprężyną. Niektóre z rzeczy, których tutaj używamy do pomocy przy operacjach, po prostu używamy prostego światłowodowego źródła światła z podwójną głowicą. Używamy podgrzewanej podkładki, która po prostu krąży tam ciepła i podgrzana woda, aby ją ogrzać.

Na powierzchni roboczej używamy tego systemu elektroporacji por firmy BTX. Mamy kilka różnych rozmiarów łopatek, których używamy w zależności od tego, jak duże i jak duże są zarodki. Niebieska strona to pozytywna strona.

Okej, więc dla myszy używamy waporyzatora iso fluorowego. Odkryliśmy, że zwiększa to nasz wskaźnik przeżywalności matki i zarodków. Pozwala nam to również na bardzo szybkie i kontrolowane przywracanie zwierzęcia do przytomności i przywracanie mu przytomności.

Z tego powodu uznaliśmy to za bardzo przydatne. W porządku, więc teraz zajmiemy się ukosowaniem naszych pipet iniekcyjnych. Jest to bardzo ważne, aby twoja pipeta miała wystarczająco duży otwór, abyś mógł załadować swoje DNA, ale także, aby była bardzo, bardzo ostra, aby nie uszkodziła zarodka podczas wstrzykiwania.

A jeśli uszkodzisz zarodek podczas wstrzykiwania, będziesz miał znacznie wyższy wskaźnik śmiertelności. A więc to nie jest dobre. Jest to więc bardzo ważny proces, podobnie jak w przypadku tej operacji.

Najpierw po prostu nalejemy trochę wody na ten skośny kamień, który się tutaj obraca. A potem weźmiemy, zobaczmy tutaj, po prostu, a, kij. Umieścimy naszą pipetę, którą właśnie naciągnęliśmy na ten patyczek za pomocą taśmy.

Użyjemy jednego z tych mikromanipulatorów, aby przytrzymać pipetę na skosie i pozwolić jej na ukosowanie tutaj. Tak więc, po prostu umieść to i używamy mikroskopu, aby uwidocznić końcówkę pipety. I po prostu umieścimy go w wodzie na szczycie skosu, aby było trochę nacisku.

I możesz zobaczyć, jak końcówka naciska na kamień, tutaj. I pozwól mu się ukosować przez jakiś czas przez co najmniej 15 minut. Lubię je zostawiać nawet na, no wiesz, godzinę.

Czasami są po prostu bardzo, bardzo ostre, ale zdecydowanie zależy to od każdej osoby, jak długo ukosują swoje pipety. W porządku, więc mamy tutaj, na górze widzimy, że mamy wyciągniętą pipetę, która nie została jeszcze ścięta. Więc chociaż jest ostry, nie ma żadnego otworu, przez który mógłbyś załadować swoje DNA.

Teraz dolna pipeta została ścięta i możesz zobaczyć ten ładny kątowy otwór, który teraz pozwoli ci załadować swoje DNA, ale nadal ma ostrą końcówkę, dzięki czemu możesz wstrzykiwać bez powodowania żadnych uszkodzeń. W porządku, więc teraz napełnimy nasze pipety iniekcyjne DNA. Dlatego ważne jest, aby przygotować swoje DNA w sposób wolny od endotoksyn, aby nie wstrzykiwać żadnego z lipopolisacharydów podczas wstrzykiwania DNA.

Weźmiemy więc nasze DNA i przygotujemy naszą paraformę. Więc po prostu stworzycie tutaj swoją paraformę i będziecie chcieli zebrać swoje DNA i po prostu umieścić je jako małą kropkę na tym filmie para. A potem weźmiemy, więc zwykle biorę na każde 10 mikrolitrów mojego DNA, które zwykle używam w ilości około 1,5 do 1,7 mikrograma z mikrolitra.

Użyję około jednego mikrolitra tego szybkiego zielonego barwnika. A to tylko po to, aby pomóc nam zlokalizować nasze wstrzyknięcie i upewnić się, że udało nam się wstrzyknąć do komory. Więc po prostu zmieszam ten szybki zielony barwnik z moim DNA.

Następnie bierzesz elektrodę do wstrzykiwań, a my po prostu napełniamy pipetę, pociągając za tłok. I możesz zobaczyć tutaj, czy to, jeśli pipeta jest prawidłowo ścięta i ma wystarczająco duży otwór, DNI powinien się dość łatwo załadować. Czasami wystarczy przesunąć tłok do przodu i do tyłu, aby pomóc w prawidłowym załadowaniu.

I tak można załadować pipetę w ten sposób. I tak mamy DNA załadowane w pełni do tej pipety i jest ona gotowa do wstrzyknięcia. Okej, więc zamierzam teraz umyć zwierzę alkoholem i jodem, ale najpierw oczywiście chcę uszczypnąć palec u nogi, aby upewnić się, że zwierzę jest całkowicie pod spodem i dobrze wygląda.

Więc mogę iść dalej i zacząć. Zaczynam od tego, że tak jak u szczurów, robimy serię trzech, zaczynając od etanolu. Dobra, jod.

Aby zminimalizować ryzyko infekcji, należy zauważyć, że kiedy William otworzył chusteczki, czyścił zwierzę częścią, która nie została dotknięta jego palcami. Tak, aby maksymalizować, że obszar jest czysty. Po drugie, wykonuje tylko jedno przetarcie, aby uniknąć rozprzestrzeniania się zarazków po powierzchni brzucha.

Okej, świetnie. Teraz idę trochę posprzątać i założymy rękawiczki chirurgiczne. Ok, Ok, Okej. Więc teraz otworzę mysz i wyjmę rogi macicy, a zacznę od małego uszczypnięcia skóry.

Pozwól, że zrobię tutaj kolejne uszczypnięcie palca u nogi, aby upewnić się, że jest w pełni pod spodem i to dobrze. Więc uszczypnę skórę i zrobię tam tylko małą falę, która będzie wystawać, co ułatwi mi cięcie. I znowu, chcemy wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej zwierzęcia, aby uniknąć jakichkolwiek naczyń krwionośnych.

Zazwyczaj w ten sposób przecinam skórę i oddzielam ją i odsłaniam mięsień. A kiedy już to zrobisz, możesz łatwo zobaczyć linię środkową w mięśniu. Jest bardzo zdefiniowany.

Zamierzam złapać tam trochę mięśni, ciąt I to jest nacięcie dobrej wielkości. Naprawdę nie chciałbym iść dalej niż to. A potem używam tego wolnego, aby podnieść mięsień i skórę, odciągnąć go na bok, a następnie wykonuję bardzo delikatną sondę tutaj i próbuję umieścić wolniejszy między dwoma zarodkami, pomiędzy dwoma zarodkami, tak że mogę je delikatnie wyciągnąć, nie uszkadzając ich w ogóle.

Czasami jest to łatwiejsze niż inne. No to jedziemy. Więc po prostu delikatnie to przeciągnij, a kiedy już to zrobię, mogę je po prostu popchnąć.

Ważne jest, aby nigdy nie szczypać zarodków, ale po prostu chcesz je prowadzić, po prostu je szturchać. A kiedy już je wyjmiesz, chcę mieć pewność, że zawsze będą bardzo mokre. Nie chcesz pozwolić, aby wyschły

I zobaczmy, znowu używam tutaj mojego swobodnika, sonduj dookoła. No to jedziemy. To świetnie.

Dlatego zawsze chcę się upewnić, że mam je wszystkie na zewnątrz, ponieważ łatwo jest zostawić jeden tam, jeśli nie sprawdzisz, czy są jajniki. Dlatego zawsze wyciągam je bardzo delikatnie, ale szukam i szukam jajników na końcu, czyli właśnie tam. Wygląda to po prostu jak mała masa czerwonej tkanki u tego zwierzęcia.

A potem odwróć je, wróć i sprawdź drugą stronę, a ja je tam widzę. Więc po prostu pamiętaj, aby je nawodnić i jesteśmy gotowi do pracy. Coś, na co chcę zwrócić uwagę, to to, że nie powinniście chwytać zarodków bardzo delikatnie i chwytać tylko zarodki.

Nie chwytaj się miejsca, w którym znajdują się naczynia krwionośne, ponieważ staną się, mogą bardzo łatwo ulec uszkodzeniu i będą miały, zwierzę będzie miało krwotok, a wskaźnik przeżycia drastycznie spadnie. Pierwszą rzeczą, którą chcemy ustalić, jest to, gdzie w zarodku znajduje się głowa, którą chcemy wstrzyknąć z DNA. Robimy to, delikatnie obracając zwierzę i patrząc na brzuszną, każdą część brzuszną.

Tak więc w tym konkretnym przykładzie mamy to, że głowa jest po mojej prawej stronie, a ogon jest blisko mojej lewej strony. Linia środkowa znajduje się w tej pozycji, a William zamierza przystąpić do ułożenia zarodka w odpowiedni sposób, abym mógł go wstrzyknąć, tak jak u szczurów. Zawsze kładę je głową, prawą stroną matki skierowaną w moją stronę.

Zacznę od tego. Okej, więc możesz zobaczyć lewy słupek podłogowy, przesuń się trochę i na pewno zobaczysz linię środkową właśnie tam. Postaram się go trochę rozkręcić, żeby był w dobrej pozycji dla Davida.

Dobra, a teraz zamierzam przystąpić do wstrzykiwania w lewą komorę. Widzimy tutaj, że lewa komora jest całkowicie, całkowicie wypełniona DNA. Widzimy, że niektóre kości rozprzestrzeniły się na prawą komorę, a także na trzecią i czwartą komorę tutaj.

To dobry wskaźnik dobrego wtrysku. Teraz przejdziemy do elektrownikowania DNA do komórek. Ważną kwestią jest tutaj ustalenie, która elektroda jest stroną dodatnią.

Wiemy, że ta z niebieskim uchwytem jest tutaj elektrodą dodatnią i ta strona powinna wchodzić w stronę, w którą chcemy być elektroporowani DNA. Skoro już mamy, wstrzyknęliśmy do lewej komory większość DNA, które umieści elektrodę dodatnią po lewej stronie w ten sposób, a następnie zastosujemy pięć impulsów i to wszystko. Ważne jest, aby elektrody były całkowicie mokre w PBS, aby kontakt między elektrodami a macicą był dobry, a transmisja impulsów elektrycznych była odpowiednia.

Dobra, teraz, gdy eksploracja została zakończona, zamierzam iść dalej i włożyć rogi z powrotem do środka. Zrobię to w ten sposób, że bardzo delikatnie przesunę rogi na bok, sięgnę w dół i złapię mięśnie i skórę i delikatnie, delikatnie łatwiej z powrotem tam. W porządku, ładnie.

Uważaj na pęcherz. Mogę zrobić drugą stronę. A potem po prostu lekko ją potrząsamy, żeby ją tam uspokoiła.

Można użyć trochę swobodniejszego, aby delikatnie je spłaszczyć. A potem zamierzam spłukać trzy miliony antybiotyku przeciwgrzybiczego. Zróbmy szczypanie palca u nogi, aby upewnić się, że jest całkowicie wyjęta, zanim zacznę szyć.

I to wygląda dobrze. Zamierzam użyć Henry'ego Shine'a. Numer sześć, szew chirurgiczny.

Wolę robić ściegi blokowe. Myślę, że trzymają się lepiej. Zaczniemy od wbicia tam igły, przeciągnięcia jej, owinięcia trzy razy, złapania za koniec, przeciągnięcia.

1, 2, 3, odetnij nadmiar. Więc chcesz po prostu kontynuować schodzenie w dół linii w równych odstępach i mocno ciągnąć. I chcesz wyjść tuż poza miejsce, w którym kończy się nacięcie i ponownie związać.

I teraz do tego się zbliżam. Odciągnij tkankę do tyłu lub trochę skórę do tyłu. Jest tam trochę krwawienia.

Powinno być dobrze. Trzymamy kauteryzator pod ręką na wypadek krwawienia, co zdarza się od czasu do czasu. I jego kauteryzator działa dobrze, aby to powstrzymać.

Więc, w porządku, jestem poza nacięciem. Na tym poprzestanę. Przeciągnij, zrób pętlę, obróć się trzy razy, chwyć pętlę i pociągnij ją w dół.

Zakręć trzy razy, chwyć pętlę, przeciągnij ją i wyłącz nadmiar. Wbij igłę w ostre narzędzia. A potem użyjemy zszywacza.

Będziemy używać zszywek w rozmiarze siódmym na tym zwierzęciu. Używamy siedmiu dla myszy. Dziewięć dla szczurów.

Po prostu chwyć skórę, podciągnij ją trochę do góry i zacznij przycinać. Chwyć klip ponownie. Chcemy iść w równych odstępach aż do momentu, gdy wyjdą nieco poza nacięcie i to jest dobre.

Następnie przetrzyj cały obszar alkoholem. A potem damy jej zastrzyk z buprenorfiny, żeby upewnić się, że odczuwa ból. Będziemy ją nadal monitorować przez kilka następnych dni, aby upewnić się, że pozostaje zdrowa i nie odczuwa żadnego bólu.

Okej, więc teraz, gdy daliśmy jej zastrzyk z buprenorfiny, umieścimy ją z powrotem w jej pierwotnej klatce, aby czuła się komfortowo, gdy się obudzi, włożymy ją do inkubatora i pozwolimy jej pozostać tam przez około 20 minut, aż w pełni się obudzi i wysuszy. Mamy Pokaż, jak wykonać in vivo in utero, elektroporację osocza, DNA. Możemy wstrzyknąć dowolną cząsteczkę.

Może to być krata D lub mogą to być narkotyki. Czynniki wzrostu umierają. Jeśli potrzebujesz tych cząsteczek dostarczonych do komórek i nie przechodzą one przez pasywną dyfuzję, będziesz potrzebować elektroporacji, a do tego cząsteczki będą musiały zostać naładowane.

Ale w zasadzie możliwości są nieograniczone. Jeden z przykładów alternatywnego wektora dostarczania genów do komórki. Nasze wirusy.

W przeszłości używaliśmy retrowirusów do oznaczania gls DNA i pokazywania, jak dzielą się i stają się neuronami, ostatecznie migrując do kory mózgowej po oznaczeniu komórek wirusem lub użyciu elektroporacji, lub wstrzyknięciu leków lub innych cząsteczek, aby wpłynąć na rozwój mózgu. Możesz to zbadać za pomocą kilku technik. Jednym z nich jest wykonanie TimeLapse, w którym wykonasz organotypowe kultury plastrów.

A potem będziesz śledzić losy komórek za pomocą mikroskopu. Jak widać tutaj, czas 0.0. Zaczynamy od skupiska komórek, które znajdują się bardzo blisko komory bocznej.

Z biegiem czasu widzimy, że komórki zaczynają migrować ze strefy komorowej w kierunku płytki korowej. Ponadto naprawiamy zarodki i przeprowadzamy immunohistochemię, aby zbadać różne rozmieszczenie różnych cząsteczek lub określić los tych różnych komórek. Inną możliwością jest elektrofizjologia.

Identyfikujemy komórki etykiety, a następnie badamy ich właściwości elektryczne. Cóż, dziękujemy, że jesteś dziś z nami. Mamy nadzieję, że nasze pokazy przypadną Państwu do gustu i że uda Wam się przeprowadzić eksperymenty.

Jeśli masz jakiekolwiek pytania, skontaktuj się z nami. Wiesz, powodzenia.