Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

Cześć, jestem William Tis z laboratorium Krete. Dzisiaj wraz z zespołem zaprezentujemy wam wykonywanie wlewów dopłaciowych u embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E 15). Cześć, nazywam się Laura Elias.

Dzisiaj pokażę Państwu, jak przygotować pipety do mikroiniekcji oraz jak napełnić pipety do iniekcji dokomorowych i elektroporacji, które będziemy przeprowadzać. Nazywam się David Castaneda i będę pomagać w iniekcjach in vivo in utero embrionów myszy. Będziemy wstrzykiwać plazmidowe DNA do komory bocznej rozwijających się embrionów myszy.

Celujemy w korę CE tych embrionów, aby uzyskać ekspresję różnych cząsteczek w komórkach glejowych, które w późniejszym etapie rozwoju przekształcą się w neurony. Przy wykonywaniu tych zastrzyków wewnątrzmacicznych należy użyć kilku ważnych narzędzi, które teraz zaprezentuję. Używamy pęsety typu freer oraz kilku pęset pomocniczych.

Jedna, jedna para z ząbkowaniem oraz druga para z małym ząbkiem na końcówce. Używamy kleszczyków hemostatycznych. To są nożyczki.

Następnie używamy tych dwóch zszywek. Ta większa służy do pracy ze szczurami, a ta mniejsza do pracy z myszami.

Używa zszywek rozmiaru siedem, a tutaj używane są zszywki rozmiaru dziewięć, które są po prostu sprężynowe. Do wsparcia zabiegów chirurgicznych używamy prostego źródła światła światłowodowego z podwójną głowicą. Stosujemy matę grzewczą, przez którą krąży podgrzana woda, aby utrzymać ciepłotę.

Do pracy wykorzystujemy system elektroporacji marki BTX. Dysponujemy kilkoma różnymi rozmiarami elektrod, których dobieramy w zależności od wielkości embrionów. Strona niebieska jest stroną dodatnią.

W przypadku myszy stosujemy parowarzapaszę do izofluranu. Stwierdziliśmy, że zwiększa ona przeżywalność matek oraz embrionów. Pozwala nam to również na bardzo szybkie i kontrolowane wprowadzanie zwierzęcia w stan utraty przytomności oraz wybudzanie go z niego.

Z tego powodu uznaliśmy to za bardzo przydatne. Dobrze, teraz będziemy ści przewody pipet do iniekcji. Jest to bardzo ważne, aby pipeta miała wystarczająco duży otwór, umożliwiający wprowadzenie DNA, a jednocześnie była bardzo ostra, aby nie uszkodzić embrionu podczas iniekcji.

A jeśli uszkodzą Państwo embrion podczas iniekcji, wskaźnik śmiertelności będzie znacznie wyższy. A to nie jest pożądane. Dlatego jest to w rzeczywistości bardzo ważny etap tego zabiegu.

Najpierw polejemy wodą ten obracający się kamień do szlifowania. Następnie weźmiemy, sprawdźmy tutaj, po prostu patyczek. Do tego patyczka przykleimy za pomocą taśmy pipetę, którą przed chwilą odcięliśmy.

Użyjemy jednego z tych mikromanipulatorów, aby unieruchomić pipetę na skosie i umożliwić jej odpowiednie ustawienie. Umieszczamy ją w ten sposób, korzystając z mikroskopu w celu wizualizacji końcówki pipety. Umieścimy ją bezpośrednio w wodzie na powierzchni skosu, tak aby wytworzyć niewielki nacisk.

Widać, że końcówka naciska na kamień. Pozostawiamy ją w tej pozycji, aby doznać ścięcia przez jakiś czas, co najmniej przez 15 minut. Osobiście preferuję pozostawić je nawet na godzinę.

Czasami stają się one naprawdę bardzo ostre, ale to zdecydowanie zależy od osoby, jak długo ściina się końcówki pipet. Dobrze, tutaj mamy, jak widać na górze, pipetę, która została wyciągnięta, ale jeszcze nie została ścięta. Zatem, choć jest ostra, nie posiada otworu, przez który można by nałożyć DNA.

Dolna część pipety została ścięta, co stworzyło ładny otwór pod kątem. Pozwoli to na załadowanie DNA, a jednocześnie zachowana została ostra końcówka, dzięki której wstrzyknięcie można przeprowadzić bez wyrządzenia szkód. Dobrze, teraz wypełnimy pipety do mikroiniekcji DNA. Ważne jest, aby przygotować DNA w sposób wolny od endotoksyn, tak aby podczas wstrzykiwania DNA nie wprowadzić żadnych lipopolisacharydów.

Teraz weźmiemy nasze DNA; w tym miejscu przygotujemy parafilm. Należy przygotować kawałek parafilmu, a następnie pobrać DNA i nanieść je w postaci małej kropelki na tę folię. Zazwyczaj przyjmuję, że na każde 10 µL mojego DNA, którego stężenie zazwyczaj wynosi od 1,5 do 1,7 µg/µL.

Użyję około 1 µL tego barwnika fast green. Służy on jedynie do zlokalizowania miejsca iniekcji i upewnienia się, że udało się pomyślnie wstrzyknąć substancję do komory mózgu. Następnie wymieszam barwnik fast green z moim DNA.

Następnie należy wziąć elektrodę do wstrzykiwania i napełnić pipetę, wycofując tłok. Można zauważyć, że jeśli końcówka pipety jest odpowiednio ścięta i ma wystarczająco szeroki otwór, DNA powinno zostać zassane dość łatwo. Czasami konieczne jest przesuwanie tłoka w przód i w tył, aby pomóc w prawidłowym napełnieniu.

W ten sposób można napełnić pipetę. DNA zostało w pełni pobrane do pipety i jest gotowe do wstrzyknięcia. Dobrze, teraz przemyję zwierzę alkoholem i jodyną, ale najpierw oczywiście wykonam test odruchowy uciśnięcia palca, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełnej narkozie i wszystko jest w porządku.

Zatem mogę przejść do rozpoczęcia procedury. Podobnie jak w przypadku szczurów, wykonuję serię trzech takich powtórzeń, zaczynając od etanolu. Dobrze, jod.

Aby zminimalizować ryzyko zakażenia, należy zwrócić uwagę, że podczas otwierania chusteczek William oczyszcza zwierzę fragmentem, którego nie dotykały jego palce. Ma to na celu maksymalne zapewnienie czystości obszaru. Po drugie, wykonuje tylko jedno przetarcie, aby uniknąć roznoszenia drobnoustrojów po powierzchni brzucha.

Dobrze, świetnie. Teraz trochę posprzątam i założę rękawiczki chirurgiczne. Dobrze. Dobrze. Zatem teraz otworzę jamę brzuszną myszy i wyjmę rogi macicy, zaczynając od lekkiego ściśnięcia skóry.

Ucisnę teraz ponownie palec u stopy, aby upewnić się, że zwierzę jest całkowicie pod narkozą; jest w porządku. Chwycę skórę i utworzę niewielką fałdę, która będzie wystawać, co ułatwi mi nacięcie. Ponownie zaznaczam, że nacięcie chcemy wykonać dokładnie wzdłuż linii środkowej ciała zwierzęcia, aby uniknąć uszkodzenia naczyń krwionośnych.

Zazwyczaj w ten sposób nacinam skórę, a następnie oddzielam ją, aby odsłonić mięsień. Po wykonaniu tej czynności można łatwo dostrzec linię środkową w mięśniu. Jest ona bardzo wyraźnie zaznaczona.

Chwytam teraz fragment mięśnia i odcinam go. To cięcie ma odpowiednią wielkość; nie chciałbym go powiększać. Następnie używam kleszczyków, aby unieść mięsień i skórę i odsunąć je na bok, po czym bardzo ostrożnie sonduję wnętrze, próbując umieścić kleszczyki pomiędzy dwoma embrionami, aby móc je delikatnie wyciągnąć, nie powodując żadnych uszkodzeń.

Czasami jest to łatwiejsze niż innym razem. I gotowe. Teraz należy po prostu delikatnie przeciągnąć całość, a gdy już to zrobię, będę mógł je po prostu wysunąć.

Ważne jest, aby nigdy nie ściskać zarodków, a jedynie je prowadzić lub delikatnie popychać. Po ich wyjęciu należy upewnić się, że są one stale i bardzo dobrze nawilżone. Nie wolno dopuścić do ich wyschnięcia.

A teraz zobaczmy, ponownie używam frezu, aby zbadać obszar. I gotowe. Świetnie.

Dlatego zawsze chcę mieć pewność, że wszystkie zostały wyjęte, ponieważ łatwo pominąć jedną z nich, jeśli nie sprawdzi się obecności jajników. Ponownie wyciągam je bardzo delikatnie, szukając jajników na końcach, które znajdują się tutaj. U tego zwierzęcia wyglądają one jak mała masa czerwonej tkanki.

Następnie odwróć je, wróć i sprawdź drugą stronę – widzę, że tam są. Należy więc pamiętać o utrzymaniu ich nawodnienia i jesteśmy gotowi do dalszych działań. Chciałbym podkreślić, że zarodki należy chwytać bardzo delikatnie i przejmować wyłącznie same zarodki.

Nie chwytaj w miejscach, gdzie znajdują się naczynia krwionośne, ponieważ mogą one zostać bardzo łatwo uszkodzone, co doprowadzi do krwotoku u zwierzęcia i drastycznego spadku przeżywalności. Dlatego w pierwszej kolejności musimy ustalić położenie głowy w embrionie, w który chcemy wstrzyknąć DNA. Robimy to, delikatnie obracając zwierzę i oglądając jego stronę brzuszną.

W tym konkretnym przykładzie głowa znajduje się po mojej prawej stronie, a ogon blisko lewej. Linia środkowa znajduje się w tej pozycji, a William przystąpi do odpowiedniego ułożenia zarodka, abym mógł go wstrzyknąć. Podobnie jak u szczurów, zawsze układam je tak, aby głowa znajdowała się po prawej stronie matki i była skierowana w moją stronę.

Zatem zaczynam teraz. Dobrze, tutaj widać lewy słup podłogowy, przesuwam go nieco i teraz wyraźnie widać linię środkową. Spróbuję go trochę obrócić, aby znajdował się w odpowiedniej pozycji dla Davida.

Dobrze, a teraz przystąpię do wstrzyknięcia do lewej komory. Możemy tutaj zauważyć, że lewa komora jest całkowicie i w pełni wypełniona DNA. Widać, że część barwnika przedostała się do prawej komory, a także do trzeciej i czwartej komory w tym miejscu.

Jest to dobry wskaźnik prawidłowej iniekcji. Teraz przejdziemy do elektroporacji DNA do komórek. Istotnym aspektem jest tutaj ustalenie, która elektroda jest stroną dodatnią.

Wiemy, że elektroda z niebieską rączką jest elektrodą dodatnią i powinna ona zostać umieszczona po stronie, w której chcemy przeprowadzić elektroporację DNA. Ponieważ większość DNA wstrzyknęliśmy do lewej komory, umieszczę elektrodę dodatnią po lewej stronie w ten sposób, a następnie zastosujemy pięć impulsów i to wszystko. Ważne jest, aby elektrody były całkowicie zwilżone w PBS, aby zapewnić dobry kontakt między elektrodami a macicą oraz odpowiednią transmisję impulsów elektrycznych.

Dobrze, teraz gdy badanie jest zakończone, zamierzam umieścić rogi z powrotem wewnątrz. Zrobię to w następujący sposób: bardzo delikatnie przesunę rogi na jedną stronę, sięgnę w głąb i chwycę mięsień oraz skórę, a następnie powoli i ostrożnie wsunę je z powrotem. Dobrze, gotowe.

Uważaj na pęcherz. Mogę zająć się drugą stroną. Następnie delikatnie potrząśniemy, aby osadzić je wewnątrz.

Można użyć pęsety, aby delikatnie je spłaszczyć. Następnie przepłukzę obszar 3 ml roztworu antybiotyku i antymykotyku. Wykonam test uciśnięcia palca, aby upewnić się, że zwierzę jest całkowicie znieczulone, zanim zacznę szyć.

Wygląda to dobrze. Użyję nici chirurgicznej Henry Shine, rozmiar 6.

Preferuję wykonywać szwy blokowe. Myślę, że lepiej się trzymają. Zaczniemy od wprowadzenia igły, przeciągnięcia nici, owinięcia jej trzy razy, chwycenia końca i przeciągnięcia go przez pętlę.

1, 2, 3, odetnij nadmiar. Należy kontynuować wzdłuż linii, zachowując równomierne odstępy i mocno naciągając szew. Należy wyjść nieco poza miejsce, w którym kończy się nacięcie, i ponownie zawiązać węzeł.

A teraz do tego dążę. Odciągnij nieco tkankę lub skórę. Pojawiło się tam niewielkie krwawienie.

Wszystko powinno być w porządku. Mamy pod ręką kauteryzator na wypadek krwawienia, które zdarza się sporadycznie. Kauteryzator działa skutecznie, aby je zatamować.

Dobrze, jestem już za linią nacięcia. Tu się zatrzymam. Przeciągam nitkę, tworzę pętlę, obracam trzy razy, chwytam pętlę i ściągam ją w dół.

Obróć pętlę trzy razy, chwyć ją, przeciągnij i odetnij nadmiar. Umieść igłę w pojemniku na odpady ostre. Następnie użyj staplera.

W przypadku tego zwierzęcia będziemy używać zszywek rozmiaru siedem. Rozmiar siedem stosujemy u myszy, a rozmiar dziewięć u szczurów.

Chwyć skórę, delikatnie ją unieś i zacznij zapinać klipsy. Chwyć kolejny klips. Powinny być rozmieszczone w równych odstępach aż do miejsca nieco poza linią nacięcia i tak będzie dobrze.

Następnie przetrzyj cały obszar gazikiem nasączonym alkoholem. Potem podamy jej iniekcję buprenorfiny, aby mieć pewność, że nie odczuwa żadnego bólu. Będziemy kontynuować monitorowanie jej stanu przez następne kilka dni, aby upewnić się, że pozostaje zdrowa i nie odczuwa żadnego dyskomfortu.

Dobrze, teraz gdy podaliśmy jej zastrzyk buprenorfiny, umieścimy ją z powrotem w oryginalnej klatce, aby czuła się komfortowo po przebudzeniu, włożymy ją do inkubatora i pozostawimy tam przez około 20 minut, aż całkowicie się obudzi i wyschnie. Pokazaliśmy Państwu, jak przeprowadzić elektroporację plazmidowego DNA in vivo i in utero. Możemy wstrzyknąć dowolną cząsteczkę.

Mogą to być plazmidy lub leki. Mogą to być również czynniki wzrostu. Jeśli konieczne jest dostarczenie tych cząsteczek do wnętrza komórek, a nie przenikają one drogą dyfuzji pasywnej, niezbędna będzie elektroporacja, do której cząsteczki muszą być naładowane.

W zasadzie możliwości są nieograniczone. Jednym z przykładów alternatywnego wektora do dostarczania genów do komórek są wirusy.

W przeszłości wykorzystywaliśmy retrowirusy do znakowania gls za pomocą DNA, aby wykazać, w jaki sposób się dzielą i przekształcają w neurony, które ostatecznie migrują do kory; znakowanie komórek można przeprowadzić za pomocą wirusa lub elektroporacji, bądź poprzez wstrzykiwanie leków lub innych cząsteczek w celu wywarcia wpływu na rozwój mózgu. Można to badać za pomocą kilku technik. Jedną z nich jest wykonywanie zdjęć TimeLapse w hodowlach organotypowych skrawków tkanki.

Następnie za pomocą mikroskopu będą Państwo śledzić losy komórek. Jak widać tutaj, czas 0,0. Zaczynamy od skupiska komórek znajdujących się bardzo blisko komory bocznej.

Z upływem czasu można zaobserwować, że komórki zaczynają migrować z strefy komorowej w kierunku płytki korowej. Ponadto utrwalamy zarodki i przeprowadzamy immunohistochemię, aby zbadać rozkład różnych cząsteczek lub określić losy tych różnych komórek. Innym rozwiązaniem jest zastosowanie elektrofizjologii.

Identyfikujemy komórki oznakowane, a następnie badamy ich właściwości elektryczne. Dziękujemy za obecność z nami. Mamy nadzieję, że prezentacje były dla Państwa przydatne i że odniosą Państwo sukces w przeprowadzaniu swoich eksperymentów.

W przypadku jakichkolwiek pytań prosimy o kontakt. Życzymy powodzenia.