Name: Skuteczne dostarczanie genów do wielu terytoriów OUN za pomocą elektroporacji in utero (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji in utero do precyzyjnego dostarczania genów do rozwijającego się układu nerwowego myszy. Technika umożliwia badanie funkcji genów podczas embriogenezy OUN.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Evie Hadzimovie, Pierre'owi Mattarowi oraz Christopherowi Kovachowi za ich wstępną pracę nad wdrożeniem technologii elektroporacji in utero w laboratorium CS. Praca ta była finansowana z grantu Canadian Institute of Health Research (CIHR) (MOP 44094) oraz grantu CIHR/Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging Team Grant (00933-000) przyznanego CS, a także z grantu Alberta Children's Hospital Research Foundation przyznanego DMK. RD otrzymał wsparcie w ramach CIHR Canada Hope Scholarship, RC korzysta ze wsparcia FFB Studentship, a LML otrzymał wsparcie z grantu szkoleniowego CIHR w zakresie genetyki i rozwoju dziecka.

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotować pole operacyjne zgodnie z rys. 1A,A'. Kluczowe elementy zestawu obejmują mikroinżektor Eppendorf Femtojet, mikromanipulator Narishige z uchwytem do igieł, stereomikroskop Leica, światłowodowy system oświetlenia, system elektroporacji prostokątnej ECM 830 z elektrodami, matę grzewczą oraz waporyzator do znieczulenia izofluranem.</li> 
	<li>Oczyścić wszystkie narzędzia w myjce ultradźwiękowej Bransonic, używając nisko pieniącego roztworu Metriclean2 do sonikacji narzędzi chirurgicznych. Sterylizować narzędzia w autoklawie. Sterylne narzędzia przechowywać w Germex.</li>
	<li>Przygotować strzykawki z ciepłą sterylną solą fizjologiczną oraz sterylnym roztworem Lactated Ringer’s.</li>
</ol>
2. Znieczulenie
<ol>
	<li>Umieść zwierzę w małej (12cm x 20cm) komorze anestezjologicznej. Za pomocą waporyzatora podawaj 5% izofluranu i tlen z przepływem 1L/min (Ryc. 1A,A'). Należy zwrócić szczególną uwagę na odprowadzanie wyczerpanego izofluranu za pomocą systemu ewakuacyjnego.</li> 
	<li>Wyjmij zwierzę z komory, gdy oddech stanie się głęboki i regularny. Aby upewnić się, że znieczulenie jest pełne, przeprowadź testy poprzez uciskanie palców u stóp oraz sprawdzenie odruchu mrugania oka.</li> 
	<li>Umieść ciężarną mysz na grzbiecie na podkładce grzewczej (37°C). Podkładkę grzewczą należy najpierw wysterylizować, przecierając ją 70% etanolem, a następnie przykryć sterylną gazą niepozostawiającą włókien. Podczas operacji stosuj aparat z rurką i maską oddechową do podawania izofluranu (2,25%).</li>
	<li>Wstrzyknij buprenorfinę (0,1mg/kg masy ciała) podskórnie w okolicy karku.</li>
	<li>Przez cały czas trwania operacji monitoruj oddech zwierzęcia, aby upewnić się, że jest głęboki i regularny. Zwierzę nie powinno łapać powietrza ani oddychać płytko lub szybko. Płytki, szybki oddech może być oznaką zbyt płytkiej anestezji, w takim przypadku należy zwiększyć przepływ izofluranu. Jeśli zwierzę zacznie łapać powietrza, należy zmniejszyć przepływ izofluranu. W przypadku zatrzymania oddechu wyłącz izofluran i zwiększ przepływ tlenu, aż zwierzę odzyska przytomność. Następnie ponownie podaj izofluran w niższym stężeniu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zwierząt do zabiegu chirurgicznego
<ol>
	<li>Przyklej przednie kończyny zwierzęcia do mata grzewczego i ponownie sprawdź reakcję cofania, ściskając tylną stopę tępą pęsetą.</li>
	<li>Za pomocą sterylnego patyczka z watą nałóż grubą warstwę kremu do depilacji (np. Nair) na brzuch. Pewnymi ruchami upewnij się, że podszerstka została całkowicie pokryta. Pozostaw preparat średnio na trzy minuty, okresowo sprawdzając usuwanie włosów za pomocą sterylnego, czystego patyczka. Zwilż sterylną gazę sterylną wodą i przemyj brzuch, aż do całkowitego usunięcia pozostałości kremu. Powtórz czynność, używając środka do oczyszczania skóry z chlorheksydyną (np. Stanhexidine) oraz wody. Osusz brzuch czystą, sterylną gazą.</li>
	<li>Zdezynfekuj miejsce nacięcia chlorheksydyną (np. Stanhexidine), a następnie sterylną wodą. Osusz brzuch czystą, sterylną gazą. Powtórz ten krok, używając 70% etanolu i nowego, wysterylizowanego patyczka z watą.</li>
	<li>Umieść na brzuchu sterylną gazę z nacięciem w środku, przez które podczas operacji zostaną wyprowadzone rogi macicy.</li>
</ol>
4. Nacięcie i odsłonięcie rogów macicy
<ol>
	<li>Aby odsłonić rogi macicy, najpierw zlokalizuj linię białą (linea alba) jako słabą linię pod skórą w linii środkowej. Używając pincety, odciągnij skórę od ściany brzusznej i wykonaj małe, proste nacięcie od środka brzucha w dół za pomocą nożyczek do skóry (o długości około 1 cm).</li>
	<li>Powtórz tę procedurę w odniesieniu do otrzewnej, używając zakrzywionej pincety i nożyczek.</li>
	<li>Umieść sterylną gazę z małym pionowym nacięciem nad rozcięciem i zwilż ją ogrzaną sterylną solą fizjologiczną.</li>
	<li>Wsuń pincetę do rozcięcia i zlokalizuj macicę. Trzymaj rozcięcie otwarte za pomocą pincety podczas wyciągania rogów macicy.</li>
	<li>Ostrożnie chwyć macicę pomiędzy pierwszym a drugim widocznym embrionem i wyciągnij embriony na gazę. Usuń obie strony rogów macicy, kładąc je na sterylnej gazie, a następnie policz embriony, odnotowując wszelkie resorpcje lub embriony „niezdrowe” (np. o mniejszym rozmiarze ciała). Zwilż rogi macicy solą fizjologiczną i ostrożnie wprowadź połowę macicy z powrotem do jamy brzusznej.</li>
</ol>
5. Wstrzykiwanie DNA do komór mózgu
<ol>
	<li>Igły chirurgiczne przygotowuje się za pomocą wyciągacza mikropipet Sutter Flaming Micropipette Puller, wykorzystując mikropipety borokrzemianowe z kapilarami (program: heat=750, Pull=30, Vel= 90, Time= 150). Za pomocą sterylnego ostrza skalpela końcówka igły jest delikatnie ścięta pod kątem 45 stopni.</li>
	<li>Aby napełnić igłę, pipety Pasteura są wyciągane do wąskiej średnicy nad płomieniem. Do pipety do napełniania dołącza się końcówkę ustną, aby pobrać ˜10 μl DNA wolnego od endotoksyn w stężeniu 3 mg/ml zmieszanego z 0,01% zieleni metylowej (uwaga: barwnik w postaci zieleni metylowej umożliwia wizualizację wstrzykniętego DNA). Napełnioną igłę montuje się następnie na statywie mikromanipulatora i podłącza do injektora Femtojet.</li> 
	<li>Zaczynając od zarodka położonego najbliżej jajnika, za pomocą pęsety okrągłej delikatnie obraca się zarodek w obrębie błony蜕decidua, tak aby był on ustawiony „przodem”, co umożliwia wykonywanie wstrzyknięć w kierunku od strony rostralnej do kaudalnej. Do oświetlenia i wizualizacji linii środkowej mózgu zarodkowego, która w obszarach rostralnych jest flankowana przez duże komory boczne, używa się światłowodowego źródła światła (Rys. 1B,B').</li> 
	<li>Zarodek jest utrzymywany w pozycji za pomocą pęsety okrągłej. Igłę ustawia się nad macicą tak, aby kąt wejścia do mózgu wynosił około 45 stopni. Za pomocą mikromanipulatora, szybkim i pewnym ruchem, końcówka igły jest wprowadzana przez ścianę macicy do komory bocznej zarodka. Wstrzyknięcia kieruje się do komór bocznych, trzeciej komory lub przestrzeni podsiatkówkowej, aby celować odpowiednio w telencefalon, diencefalon i siatkówkę. Należy pamiętać, że pęcherzyki mózgu zarodkowego są otwarte we wczesnych stadiach rozwoju, tak że DNA wstrzyknięte do komór bocznych przepływa do 3rd komory.</li>
	<li>Należy nacisnąć pedał nożny, aby wstrzyknąć DNA wolne od endotoksyn (1-3 μL) za pomocą mikroinjektora Eppendorf Femtojet. Prawidłowe wstrzyknięcie jest łatwo widoczne dzięki rozprzestrzenianiu się zieleni metylowej w komorach mózgu zarodkowego. Następnie igłę powoli wycofuje się w górę, aby uniknąć jej złamania.</li>
</ol>
6. Elektroporacja
<ol>
	<li>Wstrzyknięty zarodek (nadal wewnątrz macicy) umieszcza się na sterylnej gazie położonej na brzuchu matki i dokładnie zwilża ogrzaną solą fizjologiczną. Uwaga** Dodanie soli fizjologicznej na powierzchnię błony jest niezbędne, aby umożliwić efektywny przepływ prądu elektrycznego.</li>
	<li>Do uchwycenia macicy po wstrzyknięciu DNA używa się elektrod GenePaddle. Pięć kwadratowych impulsów elektrycznych o napięciu 40-50V i czasie trwania 50 ms podaje się z częstotliwością jednego impulsu na sekundę, korzystając z systemu do elektroporacji ECM8300 BTX (Rys. 1C,C').</li> 
	<li>Wstrzyknięty/elektroporowany zarodek przykrywa się ochronną mokrą gazą, a następnie przechodzi do kolejnego zarodka.</li>
	<li>Po zakończeniu wstrzykiwania/elektroporacji wszystkich wybranych zarodków, rogi macicy ostrożnie wsuwa się z powrotem do jamy brzusznej (Rys. 1D).</li>
	<li>Ostrożnie wyjmuje się drugi róg macicy i rozpoczyna procedurę ponownie, zaczynając od zarodka położonego najbliżej jajnika.</li>
</ol>
7. Szycie i staplowanie
<ol>
	<li>Po powrocie wszystkich embrionów do macicy, wstrzyknąć do jamy brzusznej ˜2-3 ml ciepłej soli fizjologicznej.</li>
	<li>Aby zamknąć ranę, należy najpierw usunąć gazę z brzucha i zidentyfikować krawędzie otrzewnej. Rozpocząć szycie otrzewnej, używając czarnej plecionej nici jedwabnej. W tej procedurze nie zaleca się stosowania szwów wchłanialnych, ponieważ są one zazwyczaj słabsze, co może prowadzić do krwawień pooperacyjnych i infekcji. Zakotwiczyć nić na otrzewnej najbliżej mostka, a następnie szyć w kierunku przeciwnym do punktu zakotwiczenia. Należy upewnić się, że wszystkie szwy są ciasne i że do otrzewnej nie zostały przypadkowo wszyte żadne leżące poniżej organy ani skóra. Odciąć pozostałą część nici i usunąć ją.</li>
	<li>Za pomocą pęsety ściągnąć skórę nad linią szwów. Używając zszywek do zamykania skóry Reflex™ 9 mm, zszyć skórę nad raną, dbając o to, aby nie zszywać linii szwów znajdującej się poniżej oraz nie naciągać skóry zbyt mocno. Preferowaną metodą jest uniesienie skóry pęsetą z dala od ciała i wprowadzenie zszywki pod kątem 90 stopni. Kontynuować do całkowitego zamknięcia rany (około trzech zszywek). Po zakończeniu upewnić się, że zszywki są ciasne, delikatnie dociskając je narzędziem do zszywania (Rys. 1D').</li>
</ol>
8. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Aby monitorować wybudzanie z narkozy, ułożyć samicę na brzuchu i wyłączyć izofluran. Pozostawiając pysk zwierzęcia w aparacie oddechowym, zwiększyć dopływ tlenu do 3%, aby wspomóc powrót do świadomości. Zwierzę należy umieścić na czystym, suchym gaziku na podgrzewaczce, aby zapobiec hipotermii.</li>
	<li>Gdy zwierzę jest jeszcze w stanie otumanienia, wstrzyknąć podskórnie 2 mL roztworu Ringera w okolicy karku.</li> 
	<li>Kontynuować podawanie tlenu przez kilka minut oraz stosować ogrzewające gaziki, aby pobudzić zwierzę. Powinny pojawić się krótkie zrywy ruchowe w miarę powrotu do normalnego rytmu oddechowego. Obserwować zwierzę przez kilka minut, aż odzyska pełną świadomość.</li> 
	<li>Spryskać brzuch samicy sprayem z gentamycyną i owinąć zwierzę sterylnym gazikiem.</li>
	<li>Przenieść zwierzę do sterylnej klatki z autoklawowaną ściółką i kartonowym schronieniem.</li>
	<li>Butelki z wodą należy dokładnie oczyścić, wysterylizować i napełnić sterylną wodą. Do 500 mL wody dodać 2 mL antybiotyku sulfametazyny (roztwór zapasowy 25%).</li> 
	<li>Następnego dnia rano po operacji podać podskórnie buprenorfinę w dawce 0,05 mg/kg.</li>
	<li>Dokładnie monitorować samicę przez pierwsze 24 godziny po zabiegu. Jeśli zwierzęta są utrzymywane dłużej niż 24 h, drugiego dnia samice przenosi się do nowych sterylnych klatek.</li> 
</ol>
9. Reprezentatywne wyniki
Nowokora 
Neocortex to obszar OUN odpowiedzialny za przetwarzanie informacji wizualnych i sensoryczno-motorycznych oraz za wyższe funkcje poznawcze. Składa się on z glutaminergicznych neuronów projekcyjnych oraz GABAergicznych interneuronów, które pochodzą odpowiednio z grzbietowej i brzusznej części telencefalonu. Aby zbadać rolę poszczególnych genów w rozwoju neocortex, stosujemy elektroporację in utero w celu nadekspresji lub zablokowania ekspresji (np. poprzez zastosowanie konstruktów shRNA) wybranych genów w grzbietowym lub brzusznym telencefalonie1,3,4. Do nadekspresji genów w embrionalnym telencefalonie używamy bicistronowego wektora ekspresyjnego (pCIG2), który zawiera promotor-enhancer CMV-βactin oraz kasetę IRES (internal ribosome entry site)-EGFP (enhanced green fluorescent protein; w pCIG2), co pozwala na wykrycie przetransfekowanych komórek za pomocą epifluorescencji (Ryc. 2A-C). Technologię tę wykorzystaliśmy do wprowadzenia konstruktów ekspresyjnych do telencefalonu od E11.5 do E15.5 (dane przedstawiono dla E12.5; Ryc. 2). Pozwalając embrionom rozwijać się przez kilka dni po elektroporacji, jesteśmy w stanie śledzić różnicowanie i migrację progenitorów znakowanych GFP. W miarę postępującego różnicowania, 3 dni po elektroporacji komórki GFP+ różnicują się i migrują z strefy komórkowej (vz), strefy podkomórkowej (svz) i strefy pośredniej (iz) do płytki kory (cp; Ryc. 2C). Jeśli mózgi poddane elektroporacji w E12.5 zostaną przeanalizowane po 24 godzinach, możemy monitorować wcześniejsze etapy dojrzewania progenitorów i migrację neuronów poprzez współznakowanie markerami progenitorów apikalnych (np. Pax6; Ryc. 2A), progenitorów bazalnych (np. Tbr2; Ryc. 2B) oraz postmitotycznych neuronów neocortex (np. Tbr1; Ryc. 2C).
Wzgórze
Podwzgórze znajduje się w brzusznej części podstawy OUN i pełni funkcję bramy między układem hormonalnym a autonomicznym układem nerwowym. W trakcie rozwoju liczne jądra tworzące dojrzałe podwzgórze różnicują się ze wspólnej strefy progenitorowej wyścielającej najbardziej brzuszny region embrionalnego międzymózgowia. Obecnie szlaki molekularne regulujące proliferację komórek progenitorowych, różnicowanie neuronalne oraz formowanie się jąder podwzgórza są słabo poznane. Wykorzystaliśmy wewnątrzmacicznie elektroporacja w celu ukierunkowania ekspresji genu reporterowego w embrionalnym przedmózgowiu poprzez wstrzyknięcie DNA do 3rd komorę zarodków E12. Następnie śledziliśmy rozkład GFP w różnicujących się neuronach w stadium E14. Dzięki tej metodologii udało nam się skutecznie skierować ekspresję GFP do wzgórza, przedwzgórza i podwzgórza (Rys. 3A). Analiza przekrojów czołowych wykazuje, że pomyślnie skierowaliśmy ekspresję GFP do komórek progenitorowych wyścielających strefę komorową 3rd komora i neurony migrujące do strefy płaszcza w celu utworzenia jąder (Rys. 3B)
Siatkówka
Siatkówka jest warstwą neuronalną oka, odpowiedzialną za przekształcanie fotonów światła w impulsy elektryczne przesyłane do mózgu. Powstaje ona jako wypustka embrionalnego przedmózgowia, a zatem pochodzi z cewy nerwowej. Siatkówka neuronalna rozwija się z apikalnej strefy progenitorów, która znajduje się sąsiadująco z przestrzenią podsiatkówkową – jamą oddzielającą oko od mezenchymy głowy. Dostarczanie konstruktów DNA do progenitorów siatkówki wymaga zatem wykonywania iniekcji w niewielki obszar docelowy. Dzięki zastosowaniu mikromanipulatorów udało nam się skutecznie celować w ten mały obszar w embrionach od E13.5 do E15.5 (przedstawiono elektroporację pCIC z reporterem mCherry w stadium E15.5; Ryc. 4). Jeśli zelektroporowane siatkówki zostaną zbadane 24 h po transfekcji, obserwujemy, że większość komórek mCherry+ znajduje się w zewnętrznej warstwie neuroblastów (onbl), gdzie rozmieszczone są dzielące się progenitory, a nie w warstwie komórek zwojowych siatkówki (gcl; obraz wstawkowy), w której lokalizują się komórki postmitotyczne.
<img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig1.jpg" alt="Układ mikrochirurgiczny do edycji genów poprzez mikroiniekcję i elektroporację w eksperymencie na embrionach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wstęp do układu i metodologii elektroporacji in utero. (A) Kluczowe elementy układu chirurgicznego obejmują mikroiniektor Eppendorf Femtojet (1), mikromanipulator Narishige z uchwytem do igieł (2), stereomikroskop Leica (3), światłowodowy system oświetlenia (4), system elektroporacji prostokątnej ECM 830 z elektrodami (5) oraz matę grzewczą (6). (A') Zwierzę zostaje znieczulone przy użyciu waporyzatora do anestetyku izofluranu. (B,B') W skrócie, po znieczuleniu odsłania się rogi macicy, a DNA zmieszane z fast green wstrzykuje się do pęcherzyków mózgowych embrionu. Poprawność iniekcji jest wizualizowana poprzez śledzenie barwnika fast green (B'). (C,C') Po pomyślnym wstrzyknięciu DNA, elektrody płytkowe umieszcza się po obu stronach macicy, pozycjonując embrion tak, aby DNA zostało przyciągnięte w stronę bieguna dodatniego do wybranego obszaru mózgu. (D,D') Po iniekcji we wszystkich wybranych embrionach, macica jest wprowadzana z powrotem do jamy brzusznej (D), otrzewna zostaje zaszyta, a skóra zszyta zszywkami (D'). Następnie ciężarna samica przechodzi rekonwalescencję, a elektroporowane potomstwo jest pobierane w wybranych punktach czasowych.
<img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig2.jpg" alt="Schemat rozwoju neuronalnego z markerami Pax6/GFP, Tbr2/GFP, Tbr1/GFP w progenitorach apoptycznych, bazalnych i neuronach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywny przykład elektroporacji grzbietowej telencefalonu. (A-C) Mikrofotografia przekroju koronarnego przez grzbietowy telencefalon płodu w wieku E13,5, poddanego elektroporacji pCIG2 w wieku E12,5. Elektroporowane komórki GFP+ analizowano pod kątem ekspresji markerów progenitorów apoptycznych (Pax6+, czerwony, A), progenitorów bazalnych (Tbr2+, czerwony, B) oraz neuronów pomitotycznych (Tbr1+, czerwony, C). cp, blaszka korowa; svz, strefa podkomorowa, vz; strefa komorowa. 
<img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig3.jpg" alt="Schemat neurobiologiczny przedstawiający ekspresję pCIG2 w przekrojach embrionalnego mózgu E12-E14; analiza fluorescencyjna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywny przykład elektroporacji międzymózgowia. (A) Widok brzuszny mózgu E14, który został poddany elektroporacji pCIG2 w stadium E12. Epifluorescencja GFP jest widoczna w wzgórzu, przedwzgórzu i podwzgórzu, co demonstruje rozprzestrzenianie się mikroiniekcyjnego plazmidu pCIG2 w obrębie 3rd komory. (B) Fotomikrografia przekroju czołowego przez elektroporowany mózg, pokazująca migrację komórek GFP+ z strefy komorowej do strefy płaszcza, gdzie uformują się jądra podwzgórza. 3V, trzecia komora; T, wzgórze; Hy, podwzgórze; mz, strefa płaszcza; Tel, telencephalon; PreT, przedwzgórze; vz, strefa komorowa.
<img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig4.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna rozwoju siatkówki wykazująca ekspresję mCherry/Brn3b; od E15.5 do E16.5." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Reprezentatywny przykład elektroporacji siatkówki. Przekrój czołowy oka w stadium E16.5 po elektroporacji pCIC w stadium E15.5, wykazujący gromadzenie się komórek mCherry+ w zewnętrznej warstwie neuroblastów, a nie w komórkach zwojowych siatkówki Brn3b+ w warstwie komórek zwojowych. Wstawka przedstawia obraz zaznaczonego obszaru w większym powiększeniu. gcl, warstwa komórek zwojowych siatkówki; le, soczewka; onbl, zewnętrzna warstwa neuroblastów; re, siatkówka.

<ol><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li>
<li>Langevin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+in+utero+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+gene+regulatory+elements+in+the+murine+telencephalon.+Dev+Dyn+236%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236.</a> , 1273-1286 (2007).</li>
<li>Mattar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+helix-loop-helix+transcription+factors+cooperate+to+specify+a+cortical+projection+neuron+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity.</a> Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).</li>
<li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li>
<li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li>
<li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li>
<li>Vue, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li>
<li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice%3A+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).</li>
<li>Buffo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+transcription+factor+Olig2+in+response+to+brain+injuries%3A+implications+for+neuronal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

In utero elektroporacja może być wykorzystana do analizy szerokiej gamy procesów rozwojowych. Na przykład transfekcja genów reporterowych, takich jak GFP, mCherry lub fosfataza alkaliczna, może służyć do przeprowadzania eksperymentów z mapowaniem linii komórkowych oraz migracją neuronów. Alternatywnie, rekombinaza Cre może być wyrażana przejściowo, aby selektywnie eliminować allel floxowany w sposób kontrolowany przestrzennie i/lub czasowo. Ponadto, w celu wyciszenia funkcji genów docelowych, można zastosować el...

<table><tbody><tr><td>Precyzyjne nożyczki</td><td>&lt;em&gt;Narzędzia chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki irydologiczne, zakrzywione</td><td>&lt;em&gt;Narzędzia chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>igłotrzymacz Olsen-Hegar Ex-Delicate</td><td>&lt;em&gt;Narzędzia chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki pierścieniowe, 9 mm</td><td>&lt;em&gt;Narzędzia chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta okulistyczna do opatrunków</td><td>&lt;em&gt;Narzędzia chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Dumont #7 DMX</td><td>&lt;em&gt;Narzędzia chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #5 DMX</td><td>&lt;em&gt;Narzędzia chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta anatomiczna Adsona</td><td>&lt;em&gt;Narzędzia chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator klipsów Reflex</td><td>&lt;em&gt;Narzędzia chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500343</td><td></td></tr><tr><td>Łyżka perforowana, średnica 15 mm</td><td>&lt;em&gt;Narzędzia chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do usuwania autoklipów</td><td>&lt;em&gt;Narzędzia chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Mikron</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne jedwabne, czarne, plecione</td><td>&lt;em&gt;Narzędzia chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Ethicon Inc.</td><td>K871</td><td></td></tr><tr><td>Stalowe klipsy do zamykania ran Reflex Skin Closure</td><td>&lt;em&gt;Narzędzia chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500346</td><td></td></tr><tr><td>System do elektroporacji prostokątnej ECM 830</td><td>&lt;em&gt;Instrumenty&lt;/em&gt;</td><td>VWR international</td><td>58018-004</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta ze zmiennym odstępem i dwiema okrągłymi platynowymi elektrodami o średnicy 5 mm</td><td>&lt;em&gt;Instrumenty&lt;/em&gt;</td><td>Protech International, Inc.</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta ze zmienną szczeliną, 2 okrągłe elektrody z płytek platynowych 7 mm</td><td>&lt;em&gt;Instrumenty&lt;/em&gt;</td><td>Protech International, Inc.</td><td>CUY650P7</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor Eppendorf Femtojet</td><td>&lt;em&gt;Instrumenty&lt;/em&gt;</td><td>VWR international</td><td>CA62111-488</td><td></td></tr><tr><td>Sterowanie nożne mikroinjektora Eppendorf Femtojet</td><td>&lt;em&gt;Instrumenty&lt;/em&gt;</td><td>VWR international</td><td>CAACCESS (różne)</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa Bransonic Model 1510R-DTH</td><td>&lt;em&gt;Przyrządy&lt;/em&gt;</td><td>VWR International</td><td>CA33995-534CPN-952-118</td><td></td></tr><tr><td>Wytciągacz mikropipet Sutter P97 </td><td>&lt;em&gt;Instrumenty&lt;/em&gt;</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety -&amp;#8211; Szkło borokrzemowe z włóknem o średnicy zewnętrznej: 1 mm, średnicy wewnętrznej: 0,78 mm i długości 10 cm</td><td>&lt;em&gt;Instrumenty&lt;/em&gt;</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Trójosiowy manipulator gruboosiowy</td><td>&lt;em&gt;Instrumenty&lt;/em&gt;</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne urządzenie mocujące do mikromanipulatora</td><td>&lt;em&gt;Instrumenty&lt;/em&gt;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M1</td><td></td></tr><tr><td>Stalowa płyta bazowa do mikromanipulatora</td><td>&lt;em&gt;Instrumenty&lt;/em&gt;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>5052</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na mikropipety </td><td>&lt;em&gt;Instrumenty&lt;/em&gt;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH3</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt mikropipety</td><td>&lt;em&gt;Instrumenty&lt;/em&gt;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>5444</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>&lt;em&gt;Instrumenty&lt;/em&gt;</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Parowarz do izofluranu anestetycznego</td><td>Instrumenty</td><td>Porter Instruments Company</td><td>MODEL 100-F</td><td></td></tr><tr><td>Metriclean2 Niskopieniący roztwór do mycia narzędzi chirurgicznych w myjce ultradźwiękowej</td><td>&lt;em&gt;Odczynniki chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Metrex Research Corporation</td><td>10-8100</td><td></td></tr><tr><td>Spray antybiotykowy z gentamycyną 40 mg/ml w 0,2 g błękitu metylenowego stosowany po szyciu</td><td>&lt;em&gt;Odczynniki chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>Germex do sterylizacji narzędzi chirurgicznych</td><td>&lt;em&gt;Odczynniki chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>V&amp;eacute;toquinol</td><td>DIN# 00141569</td><td></td></tr><tr><td>maść okulistyczna BNP</td><td>&lt;em&gt;Odczynniki chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>V&amp;eacute;tokinol</td><td>DIN# 00516414</td><td></td></tr><tr><td>Nair&amp;#174;</td><td>&lt;em&gt;Odczynniki chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Kościół &amp;amp; Dwight Co.</td><td>dostępny w handlu</td><td></td></tr><tr><td>środek do oczyszczania skóry Stanhexidine 4% w/v</td><td>&lt;em&gt;Odczynniki chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Omega Laboratories Inc.</td><td>01938983</td><td></td></tr><tr><td>Analgetyk buprenorfina (Temgesic)</td><td>&lt;em&gt;Odczynniki chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Merck &amp;i Wsp.</td><td>531-535</td><td></td></tr><tr><td>Sulfonamidy &quot;25&quot; antybiotyk doustny sulfametazyna</td><td>&lt;em&gt;Odczynniki chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Profesjonalne Laboratoria Weterynaryjne</td><td>DIN# 00308218</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Ringera z mleczanem</td><td>&lt;em&gt;Odczynniki chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Baxter International Inc.</td><td>DIN# 0061085</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna -&amp;#8211; 0,9% chlorek sodu</td><td>&lt;em&gt;Odczynniki chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>B. Braun Medical</td><td>DIN# 01924303</td><td></td></tr><tr><td>Anestetyk inhalacyjny -&amp;#8211; izofluran USP</td><td>&lt;em&gt;Odczynniki chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada</td><td>DIN# 02237518</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>&lt;em&gt;Odczynniki chirurgiczne&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr></tbody></table>

efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów oun z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Zdolność do manipulowania ekspresją genów stanowi kamień węgielny współczesnej embriologii eksperymentalnej, prowadząc do wyjaśnienia wielu szlaków rozwojowych. Dostępnych jest kilka potężnych i dobrze ugruntowanych technologii transgenicznych pozwalających na manipulację poziomami ekspresji genów u myszy, co umożliwia generowanie modeli zarówno z utratą, jak i z nabyciem funkcji. Jednakże tworzenie myszy transgenicznych jest zarówno kosztowne, jak i czasochłonne. W związku z tym szeroko poszukiwano alternatywnych metod manipulacji genetycznej. Elektroporacja in utero jest metodą dostarczania genów do żywych embrionów myszy1,2, którą z powodzeniem zaadaptowaliśmy3,4. Opiera się ona w dużej mierze na sukcesie technologii elektroporacji in ovo, powszechnie stosowanych u kurcząt5. W skrócie, DNA jest wstrzykiwane do otwartych komór rozwijającego się mózgu, a przyłożenie prądu elektrycznego powoduje powstanie przejściowych porów w błonach komórkowych, co umożliwia wniknięcie DNA do wnętrza komórki. W naszych badaniach embriony można efektywnie elektroporować już w 11,5 dniu embrionalnym (E11.5), podczas gdy celowanie w młodsze embriony wymagałoby protokołu mikroiniekcji sterowanej ultradźwiękami, jak opisano wcześniej6. Z kolei E15.5 jest najpóźniejszym etapem, na którym możemy łatwo przeprowadzić elektroporację, ze względu na rozpoczęcie różnicowania kości ciemieniowych i czołowych, co utrudnia mikroiniekcję do mózgu. W przeciwieństwie do tego, siatkówka jest dostępna aż do końca embriogenezy. Embriony można pobierać w dowolnym momencie w okresie embrionalnym lub wczesnym okresie postnatalnym. Iniekcja konstruktu reporterowego ułatwia identyfikację transfekowanych komórek.
Do chwili obecnej elektroporacja in utero była najszerzej stosowana w analizie rozwoju nowokory).1,2,3,4Nowsze badania koncentrowały się na zarodkowej siatkówce7,8,9 oraz wzgórze10,11,12W niniejszym opracowaniu przedstawiamy zmodyfikowaną wewnątrzmacicznie protokół elektroporacji, który można łatwo dostosować do celowania w różne domeny embrionalnego OUN. Przedstawiamy dowody na to, że stosując tę technikę, możemy celować w embrionalny telencefalon, diencefalon oraz siatkówkę. Zaprezentowano reprezentatywne wyniki, wykazujące w pierwszej kolejności zastosowanie tej techniki do wprowadzania konstruktów ekspresyjnych DNA do komór bocznych, co pozwala na monitorowanie dojrzewania, różnicowania i migracji progenitorów w embrionalnym telencefalonie. Wykazujemy również, że technikę tę można wykorzystać do kierowania DNA do obszarów diencephalicznych otaczających 3rd komorę, co pozwala na monitorowanie dróg migracji różnicujących się neuronów do jąder wzdółmózgowia. Na koniec wykazujemy, że zastosowanie mikromanipulatorów umożliwia precyzyjne wprowadzanie konstruktów DNA do niewielkich obszarów docelowych, w tym do przestrzeni podsiatkówkowej, co pozwala na analizę wpływu manipulacji ekspresją genów na rozwój siatkówki.

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Zdolność do manipulowania ekspresją genów stanowi kamień węgielny współczesnej embriologii eksperymentalnej, co doprowadziło do wyjaśnienia wielu procesów rozwojowych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zmiana ekspresji genów w neuronach embrionalnego ośrodkowego układu nerwowego. Osiąga się to poprzez uprzednie pozyskanie samic w określonym czasie ciąży i przygotowanie ich do zabiegu chirurgicznego. Następnie, poprzez wykonanie nacięcia w obrębie jamy brzusznej, odsłania się rogi macicy.Po odsłonięciu embrionów DNA wstrzykuje się do komory bocznej, trzeciej komory lub przestrzeni podsiatkówkowej. Ostatnim krokiem procedury jest przyłożenie prądu elektrycznego do embrionu przez ścianę macicy, przy czym elektrody płaskie orientuje się tak, aby biegun dodatni znajdował się nad preferowanym miejscem transfekcji. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące proliferację, migrację i różnicowanie progenitorów neuronalnych w tline kelon dying kelon i siatkówce za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie myszy transgenicznych, jest jej szybkość, możliwość prowadzenia badań o wyższej przepustowości oraz niższy koszt. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju układu nerwowego, takie jak to, które geny regulują komórki progenitorowe neuronów, proliferację komórek, specyfikację losu komórek, różnicowanie neuronalne oraz migrację komórek. Zastosowanie tej techniki może prowadzić do lepszego zrozumienia szlaków genetycznych leżących u podstaw wad rozwoju OUN, z których wiele skutkuje upośledzeniem poznawczym i zaburzeniami behawioralnymi u ludzi, wykraczając poza jej użyteczność w badaniu rozwoju ośrodkowego układu nerwowego.Tę technikę można zastosować również do innych układów narządowych, takich jak rozwijający się obwodowy układ nerwowy, serce oraz łożysko. Można ją także wykorzystać do badania modeli chorób u myszy, a także u innych organizmów modelowych, takich jak kurczaki i xip. Zazwyczaj główną przeszkodą w osiągnięciu sukcesu przez osoby rozpoczynające pracę z tą techniką jest przeżywalność zarodków; należy zachować szczególną ostrożność podczas manipulowania, wstrzykiwania i przenoszenia zarodków.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy potrzebowaliśmy szybkiego sposobu na manipulację ekspresją genów w zarodku, telencefalonie i siatkówce. Opracowaliśmy tę technikę w naszym laboratorium, modyfikując metodę pierwotnie opisaną przez Sal i opublikowaną w czasopiśmie Developmental Biology w 2001 roku. Współpracowaliśmy również z zewnętrznym laboratorium, aby ustanowić ten protokół także w rozwijającym się dilonie.Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy wstrzykiwania i elektroporacji są trudne do opanowania, gdyż wymagają bardzo precyzyjnej manipulacji embrionami, a miejsca wstrzyknięcia mogą być niekiedy bardzo małe, na przykład przestrzeń podsiatkówkowa. Procedurę zaprezentuje dziś Rajiv, postdoc z laboratorium Shermana. Na początek należy oczyścić i wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne. Następnie należy napełnić strzykawki roztworem soli fizjologicznej oraz roztworem Ringer'a z mleczanami i umieścić je na podkładce grzewczej w strefie operacyjnej w celu ogrzania.Sterylizujemy podkładkę grzewczą 70% etanolem, a następnie przykrywamy ją sterylnym gazikiem. Ustawiamy podkładkę grzewczą na 37°C. Zwierzę umieszczamy w małej komorze anestezyjnej i znieczulamy, podając 5% izofluranu z tlenem z przepływem 1 l/min poprzez waporyzator.Należy upewnić się, że spaliny izofluranu są zbierane za pomocą systemu odprowadzającego. Gdy oddech zwierzęcia stanie się głęboki i regularny, należy wyjąć je z komory. Stopień znieczulenia należy sprawdzić za pomocą odruchu uciskania palca u stopy oraz odruchu mrugania.Aby zapewnić pełną anestezję, należy położyć znieczulone zwierzę na brzuchu i użyć rurki respiratora do podawania 2,25% izofluranu podczas zabiegu. Buprenorfinę w stężeniu 0,1 mg/kg masy ciała należy wstrzyknąć podskórnie w kark.Należy kontynuować monitorowanie oddechu zwierzęcia i w razie potrzeby dostosować przepływ izofluranu. Następnie należy przykleić taśmę na klatce piersiowej znieczulonego zwierzęcia i ponownie sprawdzić reakcję wycofania, uciskając tylną stopę tępą pęsetą. Za pomocą sterylnego patyczka z watą należy nałożyć grubą warstwę kremu na brzuch, upewniając się, że podszerstka jest całkowicie pokryta.Pozostaw krem na około trzy minuty, okresowo sprawdzając stopień usuwania włosów. Za pomocą jałowego tamponu zwilż jałową gazę jałową wodą i wytrzyj włosy z brzucha. Następnie wysterylizuj miejsce nacięcia chloreksydyną i dodatkową ilością wody.Osusz brzuch za pomocą czystej, sterylnej gazy. Powtórz ten krok, stosując 70% ethanol i świeżą, wysterylizowaną gazę bawełnianą. Przygotuj się do zabiegu, zakładając odzież chirurgiczną, aby odsłonić rogi macicy.Najpierw zlokalizuj linea alba jako bladą linię pod skórą w linii pośrodkowej. Używając pęsety, odciągnij skórę od ściany brzusznej i wykonaj nożyczkami do skóry niewielkie, proste nacięcie od środka brzucha w dół, posiłkując się zakrzywioną pęsetą i nożyczkami. Powtórz ten proces w odniesieniu do otrzewnej. Chwyć otrzewną pęsetą.Odsuń tkanki, a następnie wykonaj nacięcie o wielkości wystarczającej do wyciągnięcia macicy. Na nacięciu umieść sterylną gazę z małym pionowym rozcięciem i zwilż ją ciepłą sterylną solą fizjologiczną. Następnie wprowadź pęsetę do nacięcia, zlokalizuj macicę, utrzymując nacięcie otwartym za pomocą pęsety.Chwyć macicę pomiędzy pierwszym a drugim widocznymi zarodkami i wyciągnij oba rogi macicy na gazę. Policz liczbę zarodków, odnotowując wszelkie resorpcje lub zarodki o małych rozmiarach ciała. Aby przygotować odpowiednią liczbę iniekcji DNA, zwilż rogi macicy solą fizjologiczną i ostrożnie wprowadź jeden róg macicy z powrotem do jamy brzusznej.Aby napełnić igły chirurgiczne, należy użyć pipety z dołączonym ustnikiem, aby pobrać 10 µL roztworu DNA o stężeniu 3 mg/mL, wolnego od endotoksyn i zawierającego barwnik metylowy zielony, a następnie wprowadzić DNA do igły chirurgicznej. Pierwszą napełnioną igłę należy zamocować w mikromanipulatorze.Ustawić się przy injektorze, zaczynając od zarodka znajdującego się najbliżej jajnika. Za pomocą pęsety okrągłej delikatnie obrócić zarodek w obrębie decyduy tak, aby był zwrócony przodem, co umożliwi wykonywanie iniekcji w kierunku od ROS (przedsionka) do pępowiny. Użyć światłowodowego źródła światła, aby zidentyfikować linię środkową mózgu zarodka.Zwróć uwagę na obustronne powiększone komory boczne w obszarach rostralnych. Przytrzymaj embrion za pomocą zakrzywionej pęsety i ustaw wypełnioną igłę chirurgiczną nad macicą tak, aby kąt wprowadzenia do mózgu wynosił około 45 stopni. Szybkim i pewnym ruchem przekręć pokrętło mikromanipulatora, aby wprowadzić końcówkę igły przez ścianę macicy do komory bocznej mózgu embrionalnego.Następnie naciśnij pedał mikroinkjektora. Aby wstrzyknąć roztwór DNA, należy zaobserwować rozprzestrzenianie się barwnika zieleni metylowej w komorach mózgu zarodka, co potwierdza prawidłowe wykonanie iniekcji. Po wstrzyknięciu DNA powoli wycofaj igłę, aby usunąć ją bez spowodowania uszkodzeń.Umieść wstrzyknięty embrion na sterylnej gazie i dokładnie zwilż ciepłą solą fizjologiczną. Chwyć macicę za pomocą dodatniego bieguna elektrody płytkowej umieszczonej w wybranym miejscu transfekcji. Następnie podaj pięć kwadratowych impulsów elektrycznych o napięciu od 40 do 50 voltów i czasie trwania 50 milliseconds z częstotliwością jednego impulsu na sekundę.Przykryj wstrzyknięty i poddany elektroporacji embrion ochronną mokrą gazą, a następnie przejdź do iniekcji kolejnego embrionu. Po zakończeniu wstrzykiwania i elektroporacji wszystkich wybranych embrionów w rogu macicy, ostrożnie wprowadź go z powrotem do jamy ciała. Wyjmij drugi róg macicy, aby rozpocząć iniekcję i elektroporację pozostałych embrionów.Gdy wszystkie embriony znajdą się z powrotem w macicy, należy wprowadzić do jamy brzusznej od dwóch do trzech mililitrów ciepłej soli fizjologicznej, a następnie usunąć gazę z brzucha, aby odsłonić boki otrzewnej. Do zszycia otrzewnej należy użyć czarnej plecionej nici jedwabnej, zakotwicząc nić na otrzewnej najbliżej mostka i prowadząc szwy w kierunku przeciwnym do miejsca zakotwiczenia. Należy upewnić się, że wszystkie szwy są ciasne i że do otrzewnej nie zostały przyszyte leżące głębiej organy ani skóra.Odciąć pozostałą linię szwów i usunąć ją. Za pomocą pęsety przyciągnąć skórę nad linią szwów i zamknąć ją, używając zszywek skórnych. Zeszyć skórę, uważając, aby nie zszywać linii szwów znajdującej się pod spodem oraz nie naciągać skóry zbyt mocno.Po zakończeniu upewnij się, że zszywki są ciasne, delikatnie dociskając je za pomocą narzędzia do szycia w tym miejscu, A-P-C-I-G dwa wektory ekspresyjne sterujące ekspresją GFP zostały wprowadzone metodą elektroporacji do rozwijającej się nowokory w E 12. W miarę postępu rozwoju nowokory, progenitorzy apikalni różnicują się w wtórne progenitory bazalne lub neurony pomitotyczne i nadal wykazują ekspresję GFP. Komórki nerwowe te mogą być następnie analizowane pod kątem ekspresji typowych markerów dla podtypów neuronalnych, zaznaczonych na czerwono.Na tym widoku brzuszno-grzbietowym przedmózgowia zarodka poddanego elektroporacji w E 12 i wypreparowanego w E 14, miejsce elektroporacji jest zaznaczone zieloną epigenitelną fluorescencją w E 14. Ekspresja GFP jest widoczna w wzgórzu, przedwzgórzu i podwzgórzu, co wskazuje, że obszary progenitorowe zostały pomyślnie przetransfekowane. Przerywana ramka oznacza miejsce przekroju przez strefę komorową.Dokładniejsza analiza strefy komorowej wykazuje migrację komórek GFP ze strefy komorowej do strefy płaszcza. Obszar, w którym uformują się jądra podwzgórza, a także siatkówka zarodkowa, ulegają również łatwej elektroporacji, co pokazano na tym przekroju czołowym zarodka E 16.5, który został poddany elektroporacji PCIC w dniu E 15.5. Tutaj akumulacja komórek m cherry-dodatnich jest specyficzna dla zewnętrznej warstwy neuroblastów i nie występuje w komórkach zwojowych siatkówki Brn3b-dodatnich w warstwie komórek zwojowych. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w 30 minut, jeśli nie wystąpią nieprzewidziane komplikacje.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest stosowanie odpowiednich technik sterylnych, zachowanie stabilnej ręki podczas manipulowania zarodkami oraz przygotowanie wszystkich niezbędnych materiałów przed podaniem środka znieczulającego samicy. Po zakończeniu tej procedury zarodki poddane elektroplecioniu mogą rozwijać się do osiągnięcia wieku dorosłego, po czym można przeprowadzić inne badania, takie jak testy behawioralne i funkcjonalne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak manipulacja określonymi genami w zarodku wpływa na funkcje neuronalne u osobnika dorosłego. Od momentu opracowania technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się rozwojem OUN do badania funkcji genów in vivo u myszy.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wprowadzania obcego DNA do embrionalnej cewy nerwowej. W szczególności pokazujemy, jak przygotować ciężarną samicę do zabiegu, jak odsłonić macicę, wstrzyknąć DNA oraz przeprowadzić elektrolizę zarodka.Należy pamiętać, że praca z fluorem może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zachować środki ostrożności, takie jak zastosowanie systemu neutralizacji gazów.

efficient-gene-delivery-into-multiple-cns-territories-using-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Skuteczne wprowadzanie genów do wielu terytoriów OUN przy użyciu elektroporacji in utero

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Niniejsza praca opisuje opracowanie techniki elektroporacji in vitro, która umożliwia manipulację ekspresją genów w dolnej części wargi rombowej embrionów w połowie okresu gestacji.

In vitro elektroporacja dolnej wargi rombowej zarodków myszy w połowie okresu gestacji

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Ten film demonstruje dostarczanie plazmidowego DNA do komórek neuronalnych móżdżku mysich zarodków za pomocą elektroporacji in utero. Metoda ta jest przydatna do zrozumienia funkcji genów in vivo w prawidłowym rozwoju mózgu oraz zmian w ekspresji genów komórek neuronalnych podczas progresji guza.

Dostarczanie genów oparte na elektroporacji in utero: technika wstrzykiwania plazmidowego DNA do embrionalnych komórek móżdżku mysich zarodków

Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.

Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Powierzchnia pial to unikalna strefa progenitorowa w OUN, której poświęca się coraz więcej uwagi.  W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy metodę szybkiej manipulacji genetycznej tej strefy progenitorowej przy użyciu zmodyfikowanej metody elektroporacji.  Procedura ta może być stosowana do badań komórkowych i molekularnych linii komórkowych i szlaków sygnałowych zaangażowanych w różnicowanie komórek oraz do wyjaśnienia losów i właściwości komórek potomnych.

Elektroporacja powierzchni pialu noworodków

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak specyficznie transfekować różne regiony w ośrodkowym układzie nerwowym C57BL/6 za pomocą elektroporacji in utero. W tym protokole zawarte są szczegółowe instrukcje dotyczące transfekcji regionów, które rozwijają się w korę, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i prążkowie.

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Opisujemy nowatorską metodę dostarczania plazmidu DNA do komórek urotelialnych pęcherza myszy in vivo poprzez cewnikowanie cewki moczowej i elektroporację. Oferuje szybki i wygodny sposób generowania autochtonicznych mysich modeli chorób pęcherza moczowego.

Nowa metoda dostarczania plazmidowego DNA do nabłonka moczowego myszy za pomocą elektroporacji

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

W tym protokole opisujemy, jak wstrzyknąć lentiwirusowi do mysiej jamy owodniowej w E7.5, prowadząc do jednolitej transdukcji całej płytki nerwowej, przy minimalnym szkodliwym wpływie na przeżycie lub rozwój embrionalny.

Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym

Poznaj metodę elektroporacji in utero do precyzyjnego dostarczania genów do rozwijającego się układu nerwowego myszy. Technika umożliwia badanie funkcji genów podczas embriogenezy OUN.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Przeglądaj więcej filmów