Skuteczne dostarczanie genów do wielu terytoriów OUN za pomocą elektroporacji in utero

Ogólnym celem tej procedury jest zmiana ekspresji genów w neuronalnym ośrodkowym układzie nerwowym. Osiąga się to poprzez najpierw uzyskanie samic w ciąży w czasie i przygotowanie ich do operacji. Rogi macicy są następnie odsłaniane poprzez wygenerowanie nacięcia w jamie brzusznej.

Po odsłonięciu zarodków DNA jest wstrzykiwane do komory bocznej, trzeciej komory lub przestrzeni podsiatkówkowej. Ostatnim etapem zabiegu jest przyłożenie prądu elektrycznego do zarodka przez ścianę macicy, ustawiając elektrody łopatkowe w taki sposób, aby biegun dodatni został umieszczony nad preferowanym miejscem transfekcji. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują proliferację, migrację i różnicowanie neuro progenitorów w kelonie liniowym umierającym kelonem i siatkówce za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Główną zaletą tej techniki lub istniejących metod, takich jak degeneracja myszy transgenicznych, jest to, że jest szybka, pozwala na badania o większej przepustowości i ma niższy koszt. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju neuronów, takie jak to, które geny regulują prekursorów nerwowych, proliferację komórek, specyfikację losu komórek, różnicowanie neuronów i migrację komórek. Implikacje tej techniki mogą obejmować lepsze zrozumienie szlaków genetycznych, które podkreśliły defekty w rozwoju OUN, z których wiele skutkuje upośledzeniem funkcji poznawczych i są zaburzeniami zachowania u ludzi.

Technika ta może być również stosowana do innych układów narządów, takich jak rozwijający się obwodowy układ nerwowy, serce i łożysko. Może być również stosowany do badania modeli chorób u myszy, a także innych organizmów modelowych, takich jak pisklę i xip. Ogólnie rzecz biorąc, główną przeszkodą na drodze do sukcesu dla osób, które dopiero zaczynają tę technikę, jest zarodek Należy zachować ostrożność podczas manipulowania, wstrzykiwania i pozowania na zarodki.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy potrzebowaliśmy szybkiego sposobu na manipulowanie ekspresją genów w embrionie, kresomózgowiu i siatkówce. Opracowaliśmy tę technikę w naszym laboratorium, modyfikując technikę pierwotnie opisaną przez Sala, opublikowaną w czasopiśmie Developmental Biology w 2001 roku. Współpracowaliśmy również z laboratorium zderzeniowym, aby ustalić ten protokół również w rozwijającym się dilonie.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy iniekcji i elektroporacji są trudne do nauczenia, ponieważ wymagają bardzo ostrożnej manipulacji zarodkami, a miejsca wstrzyknięcia czasami mogą być bardzo małe. Przykładem przestrzeni podsiatkówkowej Demonstrując dziś procedurę, będzie Rajiv, doktor habilitowany z Laboratorium Shermana Aby rozpocząć czyszczenie i sterylizację wszystkich narzędzi chirurgicznych. Następnie napełnij strzykawki roztworem soli fizjologicznej i roztworem Ringera z mleczanami i umieść je na poduszce grzewczej, aby ogrzały się w obszarze operacyjnym.

Wysterylizuj poduszkę grzewczą 70% etanolem, a następnie przykryj ją wysterylizowaną, wiotką gaziką. Ustaw poduszkę grzewczą na 37 stopni Celsjusza. Umieść zwierzę w małej komorze anestezjologicznej i znieczulij, dostarczając 5% izofluoru z tlenem w ilości jednego litra na minutę przez parownik.

Upewnij się, że zbierasz spaliny z fluoru za pomocą systemu oczyszczania. Gdy oddech zwierzęcia będzie głęboki i regularny, wyjmij go z komory. Używaj szczypania palców u nóg i odruchów mrugania oczami.

Aby zapewnić pełne znieczulenie. Umieść znieczulone zwierzę na brzuchu i użyj rurki respiratora, aby dostarczyć 2,25% lodu fluoru podczas operacji. Buprenorfinę należy wstrzyknąć w stężeniu 0,1 miligrama na kilogram masy ciała podskórnie w kark.

Kontynuuj monitorowanie oddechu zwierzęcia i w razie potrzeby dostosuj przepływ izofluoru. Następnie przyklej taśmę do klatki piersiowej znieczulonego zwierzęcia i ponownie sprawdź, czy nie ma reakcji retrakcji, ściskając tylną stopę kleszczami. Za pomocą sterylnego wacika z bawełnianą końcówką rozprowadź grubą warstwę kremu na brzuchu, upewniając się, że spód sierści jest całkowicie pokryty.

Pozostaw krem na około trzy minuty i sprawdzaj co jakiś czas, czy nie ma depilacji. Za pomocą sterylnego wacika zwilż sterylny gazik sterylną wodą i zetrzyj włosy z brzucha. Następnie wysterylizuj miejsce nacięcia chlorheksydyną i większą ilością wody.

Osusz brzuch czystą, sterylną gazą. Powtórz ten krok z 70% etanolem przy użyciu świeżej sterylizowanej gazy bawełnianej. Przygotuj się do operacji, zakładając strój chirurgiczny, aby odsłonić rogi macicy.

Najpierw zlokalizuj liniową alba jako słabą linię pod skórą na linii środkowej Za pomocą kleszczy odciągnij skórę od ściany brzucha i wytnij małe proste nacięcie od środkowej części brzucha w dół nożyczkami do skóry za pomocą zakrzywionych kleszczy i nożyczek. Powtórz proces z otrzewną. Chwyć otrzewną kleszczami.

Odsuń, a następnie wytnij nacięcie wystarczająco duże, aby przeciągnąć macicę. Umieść sterylną gazę z małą pionową szczeliną nad nacięciem i zwilż ją ciepłą sterylną solą fizjologiczną. Następnie wsuń kleszcze w nacięcie i zlokalizuj macicę, przytrzymując nacięcie otwarte kleszczami.

Chwyć macicę między pierwszym a drugim widocznym zarodkiem i pociągnij obie strony rogów macicy na gazę. Policz liczbę zarodków, w których odnotowano resorpcję lub zarodki o małych rozmiarach ciała. W celu przygotowania prawidłowej liczby wstrzyknięć DNA należy zwilżyć rogi macicy solą fizjologiczną i ostrożnie wprowadzić jeden róg macicy do jamy brzusznej.

Aby brzydzić się igłami chirurgicznymi, użyj ciągniętej pipety z dołączonym ustnikiem, aby pobrać 10 mikrolitrów po trzy miligramy na mililitr. Roztwór DNA wolny od endotoksyn zawierający barwnik zieleni metylowej i wydalić DNA do igły chirurgicznej. Zamontuj pierwszą napełnioną igłę na mikromanipulatorze.

Stań przymocowany do wstrzykiwacza, zaczynając od zarodka znajdującego się najbliżej jajnika. Użyj okrągłych kleszczy, aby delikatnie obrócić zarodek w obrębie decidua, tak aby był ustawiony twarzą do przodu, umożliwiając wstrzyknięcie w kierunku rolki ROS do serca. Wykorzystanie światłowodowego źródła światła do identyfikacji linii środkowej embrionalnego mózgu.

Zwróć uwagę na flankowane duże komory boczne w obszarach rostralnych. Przytrzymaj zarodek na miejscu za pomocą zakrzywionych kleszczy i umieść wypełnioną igłę chirurgiczną nad macicą tak, aby kąt wejścia do mózgu wynosił około 45 stopni. Szybkim i jednostajnym ruchem przekręć pokrętło na mikromanipulatorze, aby wprowadzić końcówkę igły przez ścianę macicy i do bocznej komory mózgu embrionalnego.

Następnie naciśnij podnóżek mikrowtryskiwacza. Aby wstrzyknąć roztwór DNA, udane wstrzyknięcie można łatwo zwizualizować poprzez rozprowadzenie zielonego barwnika metylowego w embrionalnych komorach mózgu. Teraz, gdy DNA zostało wstrzyknięte, powoli pociągnij igłę z powrotem do góry, aby ją usunąć, nie powodując pęknięcia.

Umieścić wstrzyknięty zarodek na sterylnej gazie i dokładnie zwilżyć ciepłym roztworem soli fizjologicznej. Chwyć macicę dodatnim biegunem elektrody łopatkowej umieszczonej nad żądanym miejscem transfekcji. Następnie dostarcz pięć kwadratowych impulsów elektrycznych o napięciu od 40 do 50 woltów i 50 milisekundach z szybkością jednego impulsu na sekundę.

Przykryj wstrzyknięty i poddany elektryczności zarodek ochronną mokrą gazą, a następnie kontynuuj wstrzykiwanie następnego zarodka. Po zakończeniu wstrzykiwania i elektro peryzacji wszystkich pożądanych zarodków w rogu macicy, ostrożnie wepchnij je z powrotem do jamy ciała. Usuń drugi róg macicy, aby rozpocząć wstrzykiwanie i elektroporację pozostałych zarodków.

Gdy wszystkie zarodki znajdą się z powrotem w macicy, dodaj dwa do trzech mililitrów ciepłej soli fizjologicznej do jamy brzusznej, a następnie usuń gazę z brzucha, aby odsłonić boki otrzewnej. Użyj czarnej plecionej jedwabnej żyłki do zszycia otrzewnej, zakotwiczając linkę na otrzewnej najbliżej mostka i przystępując do zszywania od kotwicy. Upewnij się, że wszystkie szwy są szczelne i że żadne leżące pod spodem narządy ani skóra nie są wszyte w otrzewną.

Przytnij pozostałą linię szwu i wyrzuć. Przeciągnij skórę zamkniętą nad linią szwów za pomocą kleszczy za pomocą zszywek do zamykania skóry. Przypnij skórę, uważając, aby nie zszyć linii szwu pod spodem ani nie pociągnąć skóry zbyt mocno.

Po zakończeniu upewnij się, że zszywki są napięte, delikatnie dociskając do siebie narzędziem do szycia, tutaj dwa wektory ekspresji A-P-C-I-G napędzające ekspresję GFP zostały elektroporowane do rozwijającej się kory nowej w E 12. W miarę postępu rozwoju kory nowej wierzchołkowe komórki progenitorowe różnicują się w wtórne podstawne neurony progenitorowe lub postmitotyczne i nadal wyrażają GFP. Te komórki nerwowe mogą być następnie analizowane pod kątem ekspresji typowych markerów podtypu neuronalnego pokazanego na czerwono.

W tym sprzedajnym widoku przodomózgowia zarodka poddanego elektroporacji w punkcie E 12 i wypreparowanej w punkcie E 14, miejsce naelektryzowane jest oznaczone zieloną fluorescencją epi przez E 14. Ekspresję GFP obserwuje się we wzgórzu, przedwzgórzu i podwzgórzu, co wskazuje, że umierające terytoria lic zostały pomyślnie przetransfekowane. Pole na deskę rozdzielczą oznacza położenie przekroju przez jedną strefę komorową.

Bliższe przyjrzenie się strefie komorowej pokazuje migrację komórek GFP ze strefy komorowej do strefy płaszcza. Tam, gdzie utworzą się jądra podwzgórza, embrionalna siatkówka jest również łatwo elektroporowana, jak pokazano w tym przekroju koronalnym, przez E 16.5 I elektroporowany za pomocą PCIC przy E 15.5. W tym przypadku akumulacja komórek m wiśniowo-dodatnich jest specyficzna dla zewnętrznej warstwy neuroblastów i nie jest obserwowana w B rrn trzech B dodatnich komórkach zwojowych siatkówki w warstwie komórek zwojowych Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu 30 minut, jeśli nie pojawią się żadne nieoczekiwane komplikacje.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby stosować odpowiednie sterylne techniki, pewną rękę podczas manipulowania zarodkami oraz mieć przygotowane wszystkie niezbędne materiały przed podaniem ciężarnej kobiety pod narkozą. Po tej procedurze zarodki zaplecione elektrycznie mogą żyć do dorosłości, kiedy to można wykonać inne metody, takie jak testy behawioralne i funkcjonalne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak manipulacja niektórymi genami w zarodku wpływa na funkcję neuronów u osoby dorosłej. Od czasu jej opracowania, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rozwojem OUN do badania funkcji genów in vivo u myszy.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wprowadzić obce DNA do embrionalnej cewy nerwowej. W szczególności pokazujemy, jak przygotować ciężarną kobietę do zabiegu. Odsłoń macicę, wstrzyknij DNA i elektrolit do zarodka.

Nie zapominaj, że praca z izofluorem może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy podjąć środki ostrożności, takie jak system oczyszczania.