Ilościowa ilościowa ilość obciążenia bakteryjnego tkanki w modelu myszy przewlekłej infekcji jelit

Zacznij od uśpionej myszy zakażonej szczepem bakterii opornym na antybiotyki, który modeluje przewlekłe zakażenie jelit.

Odsłonić jamę brzuszną, aby uzyskać dostęp do krwicy i śledziony.

Pobieranie tkanek świetowych i śledzionowych, które reprezentują miejsca kolonizacji bakteryjnej jelitowej i układowej.

Każdą tkankę umieść w osobnej probówce zawierającej bufor i stalową kulkę.

Ujednolicaj tkankę, gwałtowne poruszanie rurek, powodując zderzenia stalowych kulek z tkanką, jej rozbijanie i uwalnianie bakterii do zawiesiny.

Wykonaj seriowe rozcieńczenia homogenatów w buforze, aby zmniejszyć stężenie bakterii.

Z każdego rozcieńczenia przenoszę alikwoty płytek na agar odżywczy uzupełniony antybiotykiem, aby selektywnie odzyskiwać bakterie oporne na antybiotyki.

Inkubuj płytki, aby umożliwić rozwojowi żywotnych bakterii w kolonie.

Policz kolonie, aby oszacować liczbę żywotnych bakterii na gram tkanki i porównaj obciążenia bakteryjne w siewicie i śledzionie.

Najpierw rozłóż mikrorurki o bezpiecznym zamknięciu o okrągłym dnie o pojemności 2 mililitrów, dodaj 1 mililitr sterylnego PBS oraz do każdej rurki kulkę ze stali nierdzewnej z autoklawem. Przed pobraniem tkanek zważ rurki.

Po uśpieniu myszy usuń ich tkanki świetkowe i śledzionowe, upewniając się, że zbierasz tkanki pojedynczych zwierząt do osobnych rurek. Waż każdą probówkę, aby określić wagę tkanek.

Użyj urządzenia mieszalnika, aby ujednolicić tkanki pod kątem 30 Hz przez 15 minut. Następnie przelej 900 mikrolitrów PBS do każdego otworu bloku mega o pojemności 96 dołków o pojemności 2 mililitrów. Pipetą wstaw 100 mikrolitrów tkanki do pierwszego dołka i dobrze wymieszaj.

Wykonuj rozcieńczenia seryjne, dodając 100 mikrolitrów do kolejnych studni, aż uzyska się rozcieńczenie 10 do ujemnej szóstej szóstej. Nakładamy 10 mikrolitrów każdej rozcieńczeniny w potrójnych rozcieńczeniach na agar LB zawierający Streptomycynę. Następnie policz średnie jednostki tworzące kolonię i określ jednostki tworzące kolonię na gram tkanki, zgodnie z protokołem tekstowym.