Izolacja wewnątrzkomórkowych bakterii patogennych z zakażonych komórek gospodarza

Weź zawiesina bakterii patogennych.

Dodaj zawiesinę do przylegającej kultury makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego lub komórek BMDM i inkubuj.

Bakterie wykorzystują białka powierzchniowe do wiązania się z receptorami komórek gospodarza, ułatwiając ich przyleganie.

Przepłukaj buforem, aby usunąć nieobecne bakterie.

Dodaj świeże podłoże i inkubuj.

Przyczepione bakterie są następnie internalizowane przez komórkę gospodarza.

Dodaj antybiotyk, aby zabić bakterie nieinternalizowane.

Usuń medium i przemyj buforem.

Dodaj schłodzoną wodę, aby zlikwidować komórkę gospodarza, uwalniając zawartość komórkową, jądro i zinternalizowane bakterie.

Zbierz lizat komórkowy i poddaj wirówkę, aby wytrącić się z resztek komórkowych.

Zbierz supernatant zawierający bakterie. Przepuścić go przez urządzenie filtrujące, aby wychwycić nienaruszone bakterie.

Złóż papier filtracyjny i włóż go do tubki.

Szybkie zamrażanie w ciekłym azocie, aby zachować integralność komórek.

Przechowuj w chłodnych warunkach do dalszego użycia.

Używając 0,5 mililitra wymytej zawiesiny bakteryjnej, zainfekuj każdą płytkę makrofagową. Jeśli używasz wielu płytek, odstaw infekcje co 15 minut, aby umożliwić pobranie każdej płytki osobno na końcu infekcji. Po 30-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza użyj PBS do dwukrotnego przemycia zakażonych komórek, aby usunąć nieprzywiązane bakterie, a następnie dodaj 30 mililitrów wcześniej podgrzanego medium BMDM.

Inkubuj przez 30 minut, aby bakterie mogły się zinternalizować. Godzinę po zakażeniu dodaj gentamicynę do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr, aby zabić pozostałe bakterie zewnątrzkomórkowe. Zestaw aparatu filtracyjnego, umieszczając głowicę filtracyjną na kolbie zbierającej ciecz z portem wylotowym próżniowym.

Następnie zamontuj filtr o średnicy 0,45 mikrona na głowicy filtra, następnie lejek cylindrowy i użyj metalowego zacisku, aby zabezpieczyć różne części. Sześć godzin po infekcji obejrzyj monowarstwę komórki pod mikroskopem przed pobraniem. Pracując z jedną płytką naraz, aby zbierać bakterie, użyj PBS do mycia zakażonych komórek.

Następnie, aby zlizować komórki makrofagów, dodaj 20 mililitrów lodowato zimnej wody wolnej od RNA i szybko, ale ostrożnie, użyj skrobacza do komórek, aby zeskrobać komórki z płyty. Po zebraniu komórek do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, wiruj przez 30 sekund, a następnie wiruj w 800-krotnym g i 4 stopniach Celsjusza przez 3 minuty, aby usunąć jądra komórek makrofagów. Aby zebrać bakterie, przepuszcz supernatant przez filtr za pomocą systemu próżniowego.

Następnie pęsetą zwiń filtr i szybko przelej go do stożkowej rurki o pojemności 15 milimetrów. Natychmiast użyj ciekłego azotu, aby zatrzasnąć rurkę.