Oczyszczanie wakuoli patogenów z fagocytów zakażonych bakterią Legionella

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyizolowanie nienaruszonej bakterii Legionella zawierającej VAE lub LCD z zakażonych fagocytów. Osiąga się to poprzez uprzednią homogenizację zakażonych fagocytów za pomocą homogenizatora kulkowego ze stali nierdzewnej. W drugim etapie homogenat jest inkubowany z pierwotnym przeciwciałem, które jest specyficznie ukierunkowane na bakteryjne białko efektorowe zlokalizowane na błonie LCV, a następnie inkubacja z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z kulkami magnetycznymi.

Następnie przeciwciała ozdobione lc vs. Są zatrzymywane przez pole magnetyczne, a następnie myte i cytowane. Ostatecznie, magnetycznie wzbogacone wyświetlacze LCD mogą być dalej oczyszczane przez wirowanie w gradiacji gęstości.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że specyficzne dla kompartmentów cechy molekularne zakażonych pasożytów można wykorzystać do oczyszczenia nienaruszonych bakterii chorobotwórczych. Cztery dni przed izolacją LCV wyrzuć DS red express produkujący legionella pneumophila z zapasów glicerolu na płytkach ślimakowych z ekstraktem drożdżowym z węgla drzewnego z pięcioma mikrogramami na mililitr. Chloramfenikol inkubować bakterie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dzień przed zakażeniem CDA jeden razy 10 do siódmego Calnexin GFP wytwarzający Dium Disco Dium w kolbach do hodowli tkankowych o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych inkubować amebę w 10 mililitrach HL pięć pożywki z G cztery 18 w temperaturze 23 stopni Celsjusza w dniu poprzedzającym eksperyment zaszczepić 15-mililitrową probówkę zawierającą trzy mililitry pożywki YE i pięć mikrogramów na mililitr chloramfenikolu z około 100 mililitrami zawiesiny L pneumophila.

Aby uzyskać gęstość optyczną 0,1 w 600 nanometrach, należy inkubować nocną kulturę na kole obrotowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 21 do 22 godzin przed rozpoczęciem izolacji. Najpierw zmień pożywkę komórek dedis qadium, aby usunąć antybiotyk. Teraz zmierz gęstość optyczną rozcieńczonej przez noc hodowli L pneumophila od jednego do 10 razy, która powinna wynosić około 0,3.

Następnie przenieś około 500 mikrolitrów zawiesiny L pneumophila do każdej kolby w celu zakażenia komórek DSCO Dium zsynchronizuj infekcję, odwirowując bakterie na komórkach przez 10 minut w temperaturze 500 razy G i 25 stopni Celsjusza, a następnie przez godzinę. Inkubacja komórek dqu dium w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po infekcji.

Usuń pożywkę i umyj amebę raz lodowatym buforem C źródłowym. Aby usunąć wszelkie bakterie zewnątrzkomórkowe, dodaj trzy mililitry buforu HS uzupełnionego inhibitorami proteazy do każdej kolby, a następnie użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki. Homogenizacja zakażonych komórek jest najtrudniejszą częścią procedury.

Sukces zależy od skrupulatnie czystego homogenizatora kulkowego ze stali nierdzewnej, prawidłowego rozmiaru homogenizatora kulkowego, nieparzystej liczby uderzeń i wielkości zastosowanego nacisku. Po zebraniu odpowiednich próbek w 15-mililitrowej probówce, umyj homogenizator kulowy ze stali nierdzewnej z kulką o prześwitach ośmiu mikronów wodą destylowaną, a następnie przepłucz homogenizator lodowatym buforem hs. Teraz napełnij trzymililitrową plastikową strzykawkę z blokadą LOR pierwszą trzymililitrową porcją roztworu komórkowego i zamontuj strzykawkę na homogenizatorze.

Przeciśnij próbkę dziewięć razy w przód iw tył przez homogenizator, a następnie zbierz homogenizowaną próbkę do nowej 15-mililitrowej probówki. Wyrzuć zużytą strzykawkę i zamontuj nową. Po zebraniu całej homogenizowanej próbki, przenieś 150 mikrolitrów Eloqua do probówki einor w celu późniejszej analizy.

Następnie zablokuj homogenat 2% surowicą cielęcą na 30 minut na lodzie na shakerze. Po zablokowaniu wiru, pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko dowolnemu markerowi bakteryjnemu, który wiąże się wyłącznie z błoną LCV, a następnie inkubuj próbkę z przeciwciałem na lodzie na wytrząsarce przez jedną godzinę. W międzyczasie dodaj 5,75 mililitra 35% roztworu histo den do świeżej 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Ostrożnie nałóż 5,75 mililitra 10% roztworu histo den, a następnie ułóż probówki poziomo na godzinę w temperaturze pokojowej. Teraz osadzaj zablokowany i potraktowany przeciwciałami homogenat przez 15 minut w temperaturze 600 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 1,5 mililitra buforu HS, a następnie przenieść próbkę do świeżej 15-mililitrowej probówki.

Następnie należy wymieszać przeciwciało drugorzędowe, a następnie inkubować homogenat z przeciwciałem drugorzędowym, a następnie umieścić próbkę na lodzie na wytrząsarce na 30 minut. W międzyczasie umieść odpowiednią kolumnę na maksymalnym uchwycie magnetycznym i zrównoważ kolumnę z pół mililitra buforu HS. Po 30 minutach nanieść próbkę na kolumnę, obserwując kolumnę trzy razy z buforem hs.

Następnie zdejmij kolumnę z magnesu i nawiąż do lc vs. Z 0,5 mililitra hs. Bufor przez natychmiastowe zanurzenie.

Teraz powoli przekręć rurki gradientowe histo dens z powrotem do pozycji pionowej i ostrożnie załaduj elu na górę. Wirować probówki przez godzinę w temperaturze 3 350 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Na koniec użyj długiej szklanej pipety pastewnej, aby zebrać osiem 1,5 mililitrowych frakcji z dna każdej 15-mililitrowej probówki i umieść podwielokrotności w probówkach eph.

Przenieś 150 mikrolitrów każdej frakcji o ciągłym gradiencie gęstości do probówek EPI DPH w celu późniejszej analizy. Zacznij od umieszczenia szkiełek pokrywowych pokrytych poli L lizyną w każdym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z płaskim dnem. Odpipetować próbki odłożone na bok podczas izolacji LCV do studzienek i dodać 0,5 mililitra buforu HS w celu rozcieńczenia wirówki o wysokim stężeniu końców histo.

Płytka 24-dołkowa przez 10 minut w temperaturze 600 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Ostrożnie usunąć supernatant, a następnie utrwalić próbki 4% parą formaldehydu przez 20 minut w temperaturze pokojowej po utrwaleniu, przemyć próbki dwukrotnie źródłem C, a następnie umieścić próbki na szkiełkach podstawowych z odpowiednim medium montażowym. Na koniec przeanalizuj próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w odpowiednie filtry.

Ten pierwszy rysunek przedstawia reprezentatywny przegląd próbek pobranych podczas izolacji LCV od wieku dsco, dium lub makrofagów. Homogenat fagocytów zakażonych L. Pneumophila zawiera nienaruszone lc vs. Ale także dużo resztek komórkowych i bakterii zewnątrzkomórkowych po granulowaniu.

Roztwór komórkowy. Zawartość próbki rezerwowej jest podobna do zawartości homogenatu, chociaż czasami jest nieco gęstsza, jak widać tutaj. Przepływ przez kolumnę magnetyczną zawiera głównie bakterie zewnątrzkomórkowe i szczątki komórkowe, ponieważ nienaruszone lc vs.

Powinny przykleić się do kolumny po wydostaniu się próbki z kolumny. Eluat zawiera duże ilości nienaruszonego lc w porównaniu z odwirowaniem gęstości po jego denach.

Oczyszczanie LCV wydaje się być bardziej skuteczne w przypadku DSCO dium niż w przypadku makrofagów z DSCO dium. Patogen VAE wydaje się bardziej okrągły, a wydajność izolowanych l cvs jest ponad 10 razy wyższa w porównaniu z makrofagami w nienaruszonych makrofagach lc vs. Barwione różnymi przeciwciałami wydają się również bardziej nieregularne Po procedurze ryzyka.

Inne metody, takie jak proteomika lub mikroskopia immunofluorescencyjna, mogą być wykonane w celu szczegółowego scharakteryzowania komórek gospodarza i bakteryjnych składników chorób przenoszonych drogą płciową.