Wizualizacja stresu oksydacyjnego wywołanego przez patogeny u C. elegans za pomocą SKN-1 oznaczonego GFP

Zacznij od dwóch płytek zawierających robaki C. elegans , które wyrażają zielone fluorescencyjne białko oznaczone SKN-1, czynnikiem transkrypcyjnym zlokalizowanym w cytoplazmie jelitowej. Te robaki zawierają także granulki lipofucyny jelitowej, które wykazują autofluorescencję.

Jedna płytka jest zasiewana bakteriami niepatogennymi jako grupą kontrolną, druga z bakteriami patogennymi jako grupą testową.

W grupie testowej nadtlenek wodoru produkowany przez patogen wywołuje stres oksydacyjny, wywołując translokację SKN-1 do jąder jelit.

W grupie kontrolnej większość SKN-1 pozostaje rozproszona w cytoplazmie.

Każdą płytkę przemyj buforem i przełóż robaki do rurek.

Wirówkuj, aby oddzielić robaki i usunąć bufor.

Dodaj podłoże zawierające azyd sodu, aby je znieczulić.

Zamontuj robaki na agarozowych podkładkach, załóż pokrywki i obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym. Użyj autofluorescencji, aby zwizualizować granice jądrowe.

Silny sygnał jądrowy SKN-1 w teście, w porównaniu do rozproszonego sygnału cytoplazmatycznego w kontroli, wskazuje na relokalizację jądra i potwierdza stres oksydacyjny wywołany przez patogen.

Za pomocą pipety dodaj około 100 larw L4 do każdej płytki THY z nasieniem streptococcus oraz NGM E. coli . Używaj trzech płytek na szczep bakterii.

Inkubuj płytki przez 2 do 3 godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie wyjmij płytki z inkubatora. Przemyj je M9W i zbierz robaki do stożkowych rurek o masie 15 mililitrów.

Przemyj robaki trzy razy, tak jak wcześniej w fazie odśrodkowej. Usuń większość M9W przez aspirację. Do pelletu robaka dodaj 500 mikrolitrów M9W zawierającego 2 milimolarne azydy sodu lub chlorowodorek tetramilu do pelletu robaków do znieczulenia.

Inkubuj rurkę z pelletami dżdżownicami w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie wrzuć 15 mikrolitrów zawiesiny z robaków na przygotowaną agarozową podkładkę. Pod mikroskopem fluorescencyjnym wizualizuj lokalizację SKN-1 za pomocą filtrów FITC i DAPI.

Robaki obrazują się przy 10 razach i 20 powiększeniach. Oceniaj robaki na podstawie trzech poziomów lokalizacji; niskie lokalizacje, gdzie nie obserwuje się lokalizacji jądrowej, średnia lokalizacja, z SKN-1 BCGFP w przedniej lub tylnej części robaka, oraz wysoka lokalizacja, gdzie lokalizacja jądrowa SKN-1 BCGFP jest obserwowana we wszystkich komórkach jelitowych.