Name: Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system patologiczny C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę badania interakcji patogen-gospodarz i odkrywania leków przy użyciu C. elegans w formacie ciekłym z małymi objętościami. Protokół umożliwia testowanie czynników wirulencji i małych cząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930 oraz przez National Institutes of Health K22 AI110552 przyznany NVK. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

<ol><li>Falagas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Klebsiella+pneumoniae%2C+Pseudomonas+aeruginosa+and+Acinetobacter+baumannii+infections%3A+Characteristics+and+outcome+in+a+series+of+28+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).</li>
<li>Hsueh, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+causing+nosocomial+infections+in+a+university+hospital%2C+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+among+hospitalised+patients%3A+clinical+features%2C+risk-factors+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes.</a> Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Draft+genome+sequences+of+pandrug-resistant+Serratia+marcescens+clinical+isolates+harboring+blaNDM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announcements%22%5BJournal%5D)">Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1.</a> Genome Announcements. 5 (3), (2017).</li>
<li>Utari, P. D., Quax, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+reveals+novel+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism.</a> Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).</li>
<li>Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+novel+anti-infectives+using+a+C.+elegans+pathogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).</li>
<li>Kirienko, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+disrupts+Caenorhabditis+elegans+iron+homeostasis%2C+causing+a+hypoxic+response+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death.</a> Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).</li>
<li>Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content%2C+phenotypic+screen+identifies+fluorouridine+as+an+inhibitor+of+pyoverdine+biosynthesis+and+pseudomonas+aeruginosa+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence.</a> mSphere. 1 (4), (2016).</li>
<li>Manning, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+content+microscopy+assay+to+determine+drug+activity+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis.</a> Methods. 127, 3-11 (2017).</li>
<li>Marwaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acylated+derivatives+of+sulfamethoxazole+and+sulfafurazole+inhibit+intracellular+growth+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).</li>
<li>Kota, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+high-content+imaging+and+chemical+genetics+to+probe+host+cellular+pathways+critical+for+Yersinia+pestis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection.</a> PLoS One. 8 (1), e55167(2013).</li>
<li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+infection+caused+by+Listeria+monocytogenes+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion.</a> Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).</li>
<li>Jayamani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Francisella+tularensis-Caenorhabditis+elegans+pathosystem+for+the+evaluation+of+therapeutic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).</li>
<li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).</li>
<li>Rajamuthiah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+automated+platform+for+drug+discovery+against+multi-drug+resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus.</a> PLoS One. 9 (2), e89189(2014).</li>
<li>Breger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+chemical+compounds+identified+using+a+C.+elegans+pathogenicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), e18(2007).</li>
<li>Garvis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+semi-automated+liquid+screen+reveals+a+specialized+role+for+the+chemotaxis+gene+cheB2+in+Pseudomonas+aeruginosa+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540(2009).</li>
<li>Zhou, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+novel+screening+model+for+assessing+the+bioactivity+of+extracts+against+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).</li>
<li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visual Experiments. (51), (2011).</li>
<li>Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+confers+resistance+to+siderophore-mediated+killing+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).</li>
<li>Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+PA14+pathogenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).</li>
<li>Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine%2C+a+siderophore+from+Pseudomonas+aeruginosa%2C+translocates+into+C.+elegans%2C+removes+iron%2C+and+activates+a+distinct+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response.</a> Virulence. , 1-41 (2018).</li>
<li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921(2003).</li>
<li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li>
<li>Tjahjono, E., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+mitochondrial+surveillance+pathway+is+required+for+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genetics. 13 (6), e1006876(2017).</li>
<li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).</li>
<li>Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-16+protects+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+during+food+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology.+Series+A%2C+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation.</a> The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).</li>
<li>Beanan, M. J., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+germ-line+proliferation+mutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans.</a> Development. 116 (3), 755-766 (1992).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Ten test (lub podobne testy, w których inne patogeny są zastępowane P. aeruginosa lub E. faecalis) jest przydatny do różnych celów, w tym do odkrywania leków. Jest również przydatny do rozwiązywania podstawowych problemów biologicznych, takich jak identyfikacja czynników wirulencji, wyjaśnienie szlaków obronnych gospodarza i określenie mechanizmerii regulacyjnej zaangażowanej w interakcję gospodarz-patogen.
Chociaż test zabijania płynem P. aeruginosa jest solidny, is...

Identyfikacja i rozwój skutecznych antybiotyków o szerokim spektrum działania, teraz prawie sto lat temu, doprowadziły do przełomowego momentu w zdrowiu publicznym, gdzie szeroko rozpowszechniło się przekonanie, że choroby zakaźne będą plagą przeszłości. W ciągu kilku krótkich dekad ten optymizm zaczął słabnąć, ponieważ patogen po patogenie rozwijał mechanizmy oporności, które ograniczały te niegdyś cudowne terapie. Przez pewien czas wyścig zbrojeń między wysiłkami na rzecz odkrywania leków a patogenami wydawał się zrównoważony. Jednak niewłaściwe stosowanie środków przeciwdrobnoustrojowych doprowadziło ostatnio do pojawienia się lekoopornych szczepów Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescens i P. aeruginosa1,2,3,4.
P. aeruginosa to oportunistyczny, Gram-ujemny, wielogospodarzowy patogen, który stanowi poważne zagrożenie dla pacjentów z ciężkimi oparzeniami, z obniżoną odpornością lub z mukowiscydozą. Jest również coraz częściej identyfikowany jako czynnik wywołujący ciężkie zakażenia szpitalne, szczególnie ze względu na ciągłe nabywanie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Aby zacząć radzić sobie z tym zagrożeniem, użyliśmy dobrze udokumentowanego systemu infekcji C. elegans-P. aeruginosa 5. Nasze laboratorium wykorzystało ten system do opracowania opartej na płynach, wysokowydajnej i wysokiej zawartości platformy przesiewowej w celu identyfikacji nowych związków, które ograniczają zdolność patogenu do zabijania hosta6. Co ciekawe, związki te wydają się należeć do co najmniej trzech ogólnych kategorii, w tym środków przeciwdrobnoustrojowych7 i inhibitorów wirulencji8. Inne testy odkrywania leków o wysokiej zawartości u C. elegans zostały zgłoszone między innymi dla Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans i Enterococcus faecalis9,10,11,12,13, 14,15,16. Tego typu testy mają kilka dobrze znanych zalet, takich jak ograniczenie wyników fałszywie dodatnich, które mogą być toksyczne zarówno dla gospodarza, jak i patogenu, zwiększone prawdopodobieństwo biodostępności w porównaniu z chemicznym badaniem przesiewowym oraz możliwość identyfikacji trafień wykraczających poza zwykłe ograniczenie wzrostu drobnoustrojów, takich jak leki przeciwwirusowe, cząsteczki stymulujące układ odpornościowy lub związki, które w przeciwnym razie przechylają równowagę interakcji gospodarz-patogen na korzyść tych pierwszych. Ponadto związki odkryte w tych badaniach przesiewowych są często skuteczne u gospodarzy ssaków.
Warto zauważyć, że co najmniej dwa inne testy17,18 są dostępne do przeprowadzania wysokoprzepustowych badań przesiewowych w C. elegans w cieczy. Jednak każdy z tych testów jest modyfikacją, która pozwala na wykonanie prototypowego testu kolonizacji jelit, znanego jako powolne zabijanie, w cieczy, zwiększając przepustowość i umożliwiając łatwiejsze badanie przesiewowe związków. Staranna charakterystyka wykazała jednoznacznie, że mechanizmy zjadliwości bakterii różnią się między tymi testami a naszym płynnym screen7. Ponieważ oba typy wirulencji obserwuje się w systemach ssaków, ważne jest, aby rozważyć, który determinant wirulencji jest najbardziej istotny dla zainteresowań eksperymentatora przed selekcją testu.
Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną wersję płynnego testu C. elegans-P. aeruginosa. Informujemy również o dostosowaniu naszej metody testu płynnego do uwzględnienia Gram-dodatniego patogenu bakteryjnego Enterococcus faecalis. Podobnie jak P. aeruginosa, E. faecalis jest coraz częściej identyfikowany jako poważne zagrożenie szpitalne z rosnącym uzbrojeniem szlaków oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe1. Chociaż istnieje poprzednia metoda wysokoprzepustowych badań przesiewowych E. faecalis14, wymaga ona wstępnego zakażenia patogenem, co komplikuje procedurę i zwiększa prawdopodobieństwo skażenia sprzętu, takiego jak COPAS FlowSort. Nasz protokół eliminuje konieczność wstępnej infekcji, poprawiając profil bezpieczeństwa. Na koniec przedstawiamy sposób, za pomocą którego każdy z tych testów można połączyć z podawaniem RNAi, umożliwiając użytkownikowi poszukiwanie czynników gospodarza, które odgrywają rolę w ustaleniu infekcji lub odporności na nią.

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>Cytometr przepływowy/sortownik ślimakowy do dużych obiektów</td></tr><tr><td>Cytacja 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 Dozownik do spryskiwaczy</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Głęboka studnia RB Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka</td><td>Greiner Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli nicieni (NGM)</td><td></td><td></td><td>Ilość na litr: 18 gramów agaru, 3 gramy NaCl, 2,5 grama peptonu, 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml buforu fosforanowego i 973 ml płytek</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>powolnego zabijania wody mili-Q (SK)Ilość na litr: 18 gramów agaru, 3 gramy NaCl, 3,5 grama peptonu, 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml buforu fosforanowego i 973 ml pożywki</td></tr><tr><td></td><td></td><td>powolnej do zabijania</td> wody mili-Q (SK) <td>Ilość na litr: &nbsp; 3 gramy NaCl, 3,5 grama peptonu, 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml buforu fosforanowego i 973 ml bulionu lizogennego wody mili-Q</td></tr><tr><td>(LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Bulion do naparu serca Briana (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> <td>wybielacza robakówIlość na 100 ml: 10 ml 5 M roztworu NaOH, 20 ml 5% roztworu podchlorynu sodu i 70 ml sterylnej wody</td></tr><tr><td>S Podstawowa</td><td></td><td></td><td>ilość na litr: 5,85 grama NaCl, 6 gramów KH2PO4, 1 gram K2HPO4, i 1 litr wody mili-Q</td></tr><tr><td>Agar</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Ilość buforu</td><td></td><td></td> fosforanowego <td>na litr: 132 ml K2HPO4 (1M) i 868 ml KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>5% roztwór podchlorynu sodu</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Oddychający łatwy w oddychaniu</td><td>Zróżnicowany biotech</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Pomarańczowe barwienie kwasami nukleinowymi</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td><silne>szczepy bakteryjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. aeruginosa (PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. faecalis(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli superfood (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli RNAi eksprymujące bakterie (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczepy robaków </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glp-4(bn2) (Beanan i Strome, 1992, PMID: 1289064)PINK-1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system patologiczny c. elegans

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Liczba nowych leków zidentyfikowanych przez tradycyjne badania in vitro zmalała, zmniejszając sukces tego podejścia w poszukiwaniu nowych broni do walki z wieloraką opornością na leki. Doprowadziło to do wniosku, że naukowcy muszą nie tylko znaleźć nowe leki, ale także opracować nowe sposoby ich poszukiwania. Do najbardziej obiecujących metod kandydujących należą testy in vivo na całym organizmie, które wykorzystują wysokoprzepustowe, fenotypowe odczyty i gospodarzy, od Caenorhabditis elegans do Danio rerio. Gospodarze ci mają kilka potężnych zalet, w tym radykalne zmniejszenie liczby wyników fałszywie dodatnich, ponieważ związki, które są toksyczne dla gospodarza i/lub bioniedostępne, są zwykle umieszczane na początkowym ekranie, przed kosztowną obserwacją.
Tutaj pokazujemy, jak nasz test został wykorzystany do zbadania zmienności gospodarza w dobrze udokumentowanym patosystemie zabijania płynów C. elegans - Pseudomonas aeruginosa. Pokazujemy również kilka rozszerzeń tej dobrze opracowanej techniki. Na przykład jesteśmy w stanie przeprowadzić wysokoprzepustowe genetyczne badania przesiewowe przy użyciu RNAi w formatach płytek 24- lub 96-dołkowych, aby zbadać czynniki gospodarza w tej interakcji gospodarz-patogen. Korzystając z tego testu, badania przesiewowe całego genomu można wykonać w ciągu zaledwie kilku miesięcy, co może znacznie uprościć zadanie identyfikacji celów leków, potencjalnie bez konieczności pracochłonnego oczyszczania biochemicznego.
Przedstawiamy tutaj również odmianę naszej metody, która zastępuje Gram-dodatnią bakterię Enterococcus faecalis patogenem Gram-ujemnym P. aeruginosa. Podobnie jak w przypadku P. aeruginosa, zabijanie przez E. faecalis jest zależne od czasu. W przeciwieństwie do poprzednich testów C. elegans—E. faecalis, nasz test na E. faecalis nie wymaga wstępnej infekcji, co poprawia jego profil bezpieczeństwa i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia sprzętu do obsługi cieczy. Test jest bardzo solidny, wykazując ~95% śmiertelności 96 godzin po zakażeniu.

Ważne parametry dla wydajności analizy
Właściwe zrozumienie biologii leżącej u podstaw tego testu jest niezbędne do rozwiązywania problemów i optymalizacji metody. W tym celu odwołujemy się najpierw do kilku kluczowych publikacji wyjaśniających mechanizmy patogenezy zabijania wywoływanego przez P. aeruginosa w środowisku ciekłym7,20. Przy założeniu, że ...

Tutaj opisujemy protokół, który jest elastycznym, wszechstronnym narzędziem przesiewowym o wysokiej zawartości, które może być wykorzystane do badania interakcji gospodarz-patogen i może być wykorzystane do odkrywania leków.

Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system patologiczny C. elegans

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Metoda ta może odpowiedzieć na pytania dotyczące interakcji patogenów gospodarza i odkrywania leków, takich jak znaczenie różnych czynników wirulencji i zdolność małych cząsteczek do poprawy genezy. Główną zaletą tej techniki jest to, że odbywa się w postaci płynnej o małych objętościach. Na rozpoczęcie, podczas pracy w szafie bezpieczeństwa biologicznego BSL 2, nałóż P.aeruginosa z zamrożonego bulionu na płytkę agarową LB.Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni C przez 16 do 24 godzin, a następnie przechowywać płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Dwa dni przed ustawieniem płytek testowych użyj pojedynczej kolonii z płytki, aby zaszczepić od trzech do pięciu mililitrów sterylnego bulionu LB. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin.Po przygotowaniu pożywki slow kill lub SK zgodnie z protokołem tekstowym, z 350 mililitrami p. Aeruginosa ze świeżej nocnej kultury LB, wysiewaj każdą 10-centymetrową płytkę SK. Użyj sterylnego rozsiewacza bakterii, aby równomiernie rozprowadzić bakterie i pozwól płytkom wyschnąć w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby przetestować wiele szczepów bakterii RNAi równolegle w jednym dołku na 24-dołkowej płytce dołkowej, należy zaszczepić pojedynczą kolonię z każdego klonu wcześniej przygotowanych bakterii zawierających RNAi do czterech mililitrów LB uzupełnionego karbenicyliną. Umieść płytki w inkubatorze do wytrząsania zoptymalizowanym dla płytek wielodołkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 950 obr./min przez 16 godzin, a następnie zbierz bakterie przez odwirowanie przy 2 000 g przez 5 minut. Zdekantować supernatant poprzez odwrócenie płytki i energiczne potrząśnięcie nią.Używając 100 mikrolitrów S Basal, ponownie zasymij bakterie RNAi. Odpipetować zawieszone bakterie do odpowiedniej liczby dołków wielodołkowej płytki NGM uzupełnionej IPTG i karbenicyliną i pozostawić płytkę do wyschnięcia. Po przygotowaniu robaków L1 zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj płytki do podstawowych eksperymentów, pipetując około 5 000 robaków na 10-centymetrową płytkę, wysianych RNAi lub superfood OP50.Aby przygotować się do badania przesiewowego RNAi, należy pipetować około 300 robaków na dołek w 24-dołkowej płytce wysianej RNAi. Jeśli używany szczep jest sterylny temperaturowo, inkubuj robaki w temperaturze 15 stopni Celsjusza przez około 16 godzin, a następnie przenieś je do 25 stopni Celsjusza na 44 godziny, aby zakończyć rozwój i zapobiec embriogenezie. Aby przeprowadzić test zabijania cieczy, użyj skrobaka do komórek, aby usunąć P.aeruginosa z płytki SK i ponownie zawiesić bakterie w około 5 mililitrach S.Basal.Za pomocą spektrofotometru zmierz OD 600 zawiesiny bakteryjnej. Przygotować 24 mililitry rozcieńczonego bulionu P.Aeruginosa w S.Basal przy OD 600 równym 09, następnie dodać 21 mililitrów płynnego podłoża SK i za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 45 mikrolitrów bakterii i pożywki do każdej studzienki płytki 384-dołkowej. Umyj robaki od ich źródła do 50-mililitrowej stożkowej rurki i pozwól im osiąść pod wpływem siły grawitacji.Odessać supernatant do 5 mililitrów, a następnie użyć łącznie 50 mililitrów S.Basal do ponownego zawieszenia robaków i powtórzyć pranie jeszcze dwa razy. Za pomocą sortownika robaków posortuj około 22 robaki do każdej studzienki płytki 384-dołkowej, zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie użyj folii przepuszczającej gaz, aby uszczelnić płytkę i inkubować ją w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin. W żądanym czasie użyj myjki do mikropłytek i S.Basal, aby umyć płytkę 384-dołkową w sumie 5 razy.Jednym z najłatwiejszych błędów do popełnienia jest zassanie płytki 384-dołkowej, zanim robaki całkowicie się usiądą. Potrzeba praktyki, aby dokładnie zobaczyć, czy robaki całkowicie się ustabilizowały. Po ostatnim praniu odessać supernatant do 20 mikrolitrów.Następnie dodaj 50 mikrolitrów 98-mikromolowego barwnika kwasu nukleinowego na studzienkę, aby uzyskać końcowe stężenie 0,7 mikromola. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 12 do 16 godzin. Po pożądanym okresie inkubacji należy użyć myjki do mikropłytek, aby umyć płytki co najmniej trzy razy.Do akwizycji danych użyj spektrofotometru lub mikroskopu automatycznego, aby zobrazować zarówno światło przechodzące, jak i fluorescencję. Dodaj jeden mililitr S Basal na dołek 24-dołkowej płytki zawierającej 300 robaków na studzienkę. Delikatnie porusz robaki, potrząsając płytką, a następnie przenieś robaki na pustą, sterylną płytkę z 24 głębokimi dołkami.Pozwól robakom osiąść grawitacyjnie, około pięciu minut. Odessać supernatant, pozostawiając około jednego mililitra na studzienkę, a następnie dodać 7 mililitrów S Basal do każdej studzienki. Powtórz pranie jeszcze dwa razy, a następnie po ostatnim praniu odessaj wszystko, oprócz około 400 mikrolitrów supernatantu.Po pipetowaniu bakterii do płytek 384-dołkowych, aby uniknąć głodu, za pomocą funkcji ponownego pobierania próbek sortownika robaków należy posortować 22 robaki do każdego dołka na płytce 384-dołkowej. Na koniec, po sortowaniu, dodaj małe cząsteczki lub inne materiały specyficzne dla eksperymentu. Jak pokazano na tym wykresie, gdy postępuje się zgodnie z krokami opisanymi w tym filmie, zależne od czasu zabijanie C.elegans będzie obserwowane tylko w obecności P.aeruginosa.W przeciwieństwie do tego, przy braku kluczowych bakteryjnych suplementów diety, zaobserwuje się niewiele lub wcale zabijanie. Jak pokazano tutaj, dwuetapowa inkubacja P.aeruginosa w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie 25 stopni Celsjusza, która ma kluczowe znaczenie dla konwencjonalnych testów powolnego uśmiercania i została pierwotnie wdrożona w zabijaniu płynnym, jest zbędna w tym teście. Protokół toleruje szeroki zakres początkowych stężeń bakterii, od tak niskiego jak OD 600 równego 0025, i nadal wykazuje zabijanie zależne od czasu i stężenia, chociaż czas się zmienia.Ponadto często do uzyskania danych istotnych statystycznie wystarczą nawet cztery odwierty. Przykład użyteczności przetwarzania jest pokazany tutaj, gdy stosunek sygnału do szumu jest wysoki, tak jak w tym przykładzie, analiza jest prosta, a rozróżnienie między warunkami pozytywnymi i negatywnymi jest trywialne. W takich przypadkach nawet słabe trafienia można łatwo zidentyfikować.Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu około 60 do 75 minut rąk na czas na płytce 384-dołkowej, nie wliczając sortowania. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby dodać wszystkie składniki do nośnika, w przeciwnym razie zjadliwość zostanie zagrożona. Test ten upraszcza zastosowanie badań przesiewowych opartych na fenotypie całego organizmu do odkrywania leków w badaniach nad patogenami gospodarza.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać testy patogenezy C. elegans na bazie cieczy. Procedura ta może być modyfikowana poprzez zastąpienie P.Aeruginosa innymi patogenami, takimi jak E.Faecalis, co ułatwia poszukiwanie metod leczenia innych infekcji bakteryjnych. Nie zapominaj, że praca z zakaźnymi bakteriami, takimi jak P.Aeruginosa lub E.Faecalis, może być niebezpieczna.Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować odpowiednie środki ostrożności, takie jak odpowiednie szkolenie, dobre środki ochrony osobistej i właściwa technika.

a-high-throughput-high-content-liquid-based-c-elegans-pathosystem

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Opisujemy protokół z wykorzystaniem C. elegans oraz bibliotek RNAi dostarczanych drogą pokarmową, który umożliwia zautomatyzowany pomiar wielu parametrów, takich jak fluorescencja, rozmiar i nieprzezroczystość poszczególnych nicieni w populacji. Przedstawiamy przykład screeningu służącego do identyfikacji genów zaangażowanych w wrodzoną odporność przeciwgrzybiczą u C. elegans.

Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy RNAi w całym genomie u C. elegans

Badacze mogą uruchomić ruch na żądanie u C. elegans, stosując pole elektryczne, które robaki wyczuwają i na które reagują. Ten film przedstawia zachowanie elektrotaktyczne i pokazuje przykładowy protokół, który jest wykonywany w urządzeniu mikroprzepływowym.

Test elektrotaksji: metoda obserwacji lokomocji u C. elegans

Źródło: Anderson, Q. L. i wsp. Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych z wykorzystaniem Caenorhabditis elegans do badania knockdownów genów podczas interakcji gospodarz-patogen. Przedstawiono w nim procedurę przygotowania powalanych robaków i przenoszenia ich na płytki testowe w celu oceny skutków zabijania robaków przez patogeny.

Wielodołkowy test na bazie płynu do badań przesiewowych nokautów C. elegans

Źródło: Anderson, Q. L., et al. Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)Film przedstawia test na bazie cieczy, w którym genetycznie zmodyfikowane larwy C. elegans są narażone na działanie bakterii chorobotwórczych na mikropłytce. Toksyny bakteryjne wydzielane do pożywki wywołują stres i śmierć gospodarza. Barwnik fluorescencyjny barwi martwe robaki, umożliwiając ilościowe określenie śmiertelności na podstawie obrazowania w celu oceny...

Ocena śmiertelności larw C. elegans wywołanej przez bakterie chorobotwórcze

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Opisujemy szczegółowe etapy wysokoprzepustowego testu chemicznego u nicieni Caenorhabditis elegans używanych do oceny toksyczności linii zarodkowej. W tym teście zaburzenie funkcji linii zarodkowej po narażeniu na działanie substancji chemicznych jest monitorowane za pomocą fluorescencyjnego reportera specyficznego dla zarodków aneuploidalnych.

Kompleksowa ocena toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia Caenorhabditis elegans

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół oceny neuroprotekcyjnych aktywności testowych związków u Caenorhabditis elegans, w tym agregacji poliglutaminy, śmierci neuronów i zachowania chemounikania, a także przykładowej integracji wielu fenotypów.

Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Poznaj wysokoprzepustową metodę badania interakcji patogen-gospodarz i odkrywania leków przy użyciu C. elegans w formacie ciekłym z małymi objętościami. Protokół umożliwia testowanie czynników wirulencji i małych cząsteczek.

Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system patologiczny C. elegans

Przeglądaj więcej filmów