Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system patologiczny C. elegans

Metoda ta może odpowiedzieć na pytania dotyczące interakcji patogenów gospodarza i odkrywania leków, takich jak znaczenie różnych czynników wirulencji i zdolność małych cząsteczek do poprawy genezy. Główną zaletą tej techniki jest to, że odbywa się w postaci płynnej o małych objętościach. Na rozpoczęcie, podczas pracy w szafie bezpieczeństwa biologicznego BSL 2, nałóż P.aeruginosa z zamrożonego bulionu na płytkę agarową LB.

Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni C przez 16 do 24 godzin, a następnie przechowywać płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Dwa dni przed ustawieniem płytek testowych użyj pojedynczej kolonii z płytki, aby zaszczepić od trzech do pięciu mililitrów sterylnego bulionu LB. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin.

Po przygotowaniu pożywki slow kill lub SK zgodnie z protokołem tekstowym, z 350 mililitrami p. Aeruginosa ze świeżej nocnej kultury LB, wysiewaj każdą 10-centymetrową płytkę SK. Użyj sterylnego rozsiewacza bakterii, aby równomiernie rozprowadzić bakterie i pozwól płytkom wyschnąć w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby przetestować wiele szczepów bakterii RNAi równolegle w jednym dołku na 24-dołkowej płytce dołkowej, należy zaszczepić pojedynczą kolonię z każdego klonu wcześniej przygotowanych bakterii zawierających RNAi do czterech mililitrów LB uzupełnionego karbenicyliną. Umieść płytki w inkubatorze do wytrząsania zoptymalizowanym dla płytek wielodołkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 950 obr./min przez 16 godzin, a następnie zbierz bakterie przez odwirowanie przy 2 000 g przez 5 minut. Zdekantować supernatant poprzez odwrócenie płytki i energiczne potrząśnięcie nią.

Używając 100 mikrolitrów S Basal, ponownie zasymij bakterie RNAi. Odpipetować zawieszone bakterie do odpowiedniej liczby dołków wielodołkowej płytki NGM uzupełnionej IPTG i karbenicyliną i pozostawić płytkę do wyschnięcia. Po przygotowaniu robaków L1 zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj płytki do podstawowych eksperymentów, pipetując około 5 000 robaków na 10-centymetrową płytkę, wysianych RNAi lub superfood OP50.

Aby przygotować się do badania przesiewowego RNAi, należy pipetować około 300 robaków na dołek w 24-dołkowej płytce wysianej RNAi. Jeśli używany szczep jest sterylny temperaturowo, inkubuj robaki w temperaturze 15 stopni Celsjusza przez około 16 godzin, a następnie przenieś je do 25 stopni Celsjusza na 44 godziny, aby zakończyć rozwój i zapobiec embriogenezie. Aby przeprowadzić test zabijania cieczy, użyj skrobaka do komórek, aby usunąć P.aeruginosa z płytki SK i ponownie zawiesić bakterie w około 5 mililitrach S.Basal.

Za pomocą spektrofotometru zmierz OD 600 zawiesiny bakteryjnej. Przygotować 24 mililitry rozcieńczonego bulionu P.Aeruginosa w S.Basal przy OD 600 równym 09, następnie dodać 21 mililitrów płynnego podłoża SK i za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 45 mikrolitrów bakterii i pożywki do każdej studzienki płytki 384-dołkowej. Umyj robaki od ich źródła do 50-mililitrowej stożkowej rurki i pozwól im osiąść pod wpływem siły grawitacji.

Odessać supernatant do 5 mililitrów, a następnie użyć łącznie 50 mililitrów S.Basal do ponownego zawieszenia robaków i powtórzyć pranie jeszcze dwa razy. Za pomocą sortownika robaków posortuj około 22 robaki do każdej studzienki płytki 384-dołkowej, zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie użyj folii przepuszczającej gaz, aby uszczelnić płytkę i inkubować ją w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin. W żądanym czasie użyj myjki do mikropłytek i S.Basal, aby umyć płytkę 384-dołkową w sumie 5 razy.

Jednym z najłatwiejszych błędów do popełnienia jest zassanie płytki 384-dołkowej, zanim robaki całkowicie się usiądą. Potrzeba praktyki, aby dokładnie zobaczyć, czy robaki całkowicie się ustabilizowały. Po ostatnim praniu odessać supernatant do 20 mikrolitrów.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów 98-mikromolowego barwnika kwasu nukleinowego na studzienkę, aby uzyskać końcowe stężenie 0,7 mikromola. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 12 do 16 godzin. Po pożądanym okresie inkubacji należy użyć myjki do mikropłytek, aby umyć płytki co najmniej trzy razy.

Do akwizycji danych użyj spektrofotometru lub mikroskopu automatycznego, aby zobrazować zarówno światło przechodzące, jak i fluorescencję. Dodaj jeden mililitr S Basal na dołek 24-dołkowej płytki zawierającej 300 robaków na studzienkę. Delikatnie porusz robaki, potrząsając płytką, a następnie przenieś robaki na pustą, sterylną płytkę z 24 głębokimi dołkami.

Pozwól robakom osiąść grawitacyjnie, około pięciu minut. Odessać supernatant, pozostawiając około jednego mililitra na studzienkę, a następnie dodać 7 mililitrów S Basal do każdej studzienki. Powtórz pranie jeszcze dwa razy, a następnie po ostatnim praniu odessaj wszystko, oprócz około 400 mikrolitrów supernatantu.

Po pipetowaniu bakterii do płytek 384-dołkowych, aby uniknąć głodu, za pomocą funkcji ponownego pobierania próbek sortownika robaków należy posortować 22 robaki do każdego dołka na płytce 384-dołkowej. Na koniec, po sortowaniu, dodaj małe cząsteczki lub inne materiały specyficzne dla eksperymentu. Jak pokazano na tym wykresie, gdy postępuje się zgodnie z krokami opisanymi w tym filmie, zależne od czasu zabijanie C.elegans będzie obserwowane tylko w obecności P.aeruginosa.

W przeciwieństwie do tego, przy braku kluczowych bakteryjnych suplementów diety, zaobserwuje się niewiele lub wcale zabijanie. Jak pokazano tutaj, dwuetapowa inkubacja P.aeruginosa w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie 25 stopni Celsjusza, która ma kluczowe znaczenie dla konwencjonalnych testów powolnego uśmiercania i została pierwotnie wdrożona w zabijaniu płynnym, jest zbędna w tym teście. Protokół toleruje szeroki zakres początkowych stężeń bakterii, od tak niskiego jak OD 600 równego 0025, i nadal wykazuje zabijanie zależne od czasu i stężenia, chociaż czas się zmienia.

Ponadto często do uzyskania danych istotnych statystycznie wystarczą nawet cztery odwierty. Przykład użyteczności przetwarzania jest pokazany tutaj, gdy stosunek sygnału do szumu jest wysoki, tak jak w tym przykładzie, analiza jest prosta, a rozróżnienie między warunkami pozytywnymi i negatywnymi jest trywialne. W takich przypadkach nawet słabe trafienia można łatwo zidentyfikować.

Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu około 60 do 75 minut rąk na czas na płytce 384-dołkowej, nie wliczając sortowania. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby dodać wszystkie składniki do nośnika, w przeciwnym razie zjadliwość zostanie zagrożona. Test ten upraszcza zastosowanie badań przesiewowych opartych na fenotypie całego organizmu do odkrywania leków w badaniach nad patogenami gospodarza.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać testy patogenezy C. elegans na bazie cieczy. Procedura ta może być modyfikowana poprzez zastąpienie P.Aeruginosa innymi patogenami, takimi jak E.Faecalis, co ułatwia poszukiwanie metod leczenia innych infekcji bakteryjnych. Nie zapominaj, że praca z zakaźnymi bakteriami, takimi jak P.Aeruginosa lub E.Faecalis, może być niebezpieczna.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować odpowiednie środki ostrożności, takie jak odpowiednie szkolenie, dobre środki ochrony osobistej i właściwa technika.