Znormalizowane metody pomiaru indukcji reakcji na szok cieplny u Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiono standardowe protokoły do oceny indukcji reakcji na szok cieplny (HSR) u Caenorhabditis elegans za pomocą RT-qPCR na poziomie molekularnym, fluorescencyjnych reporterów na poziomie komórkowym i termoregeneracji na poziomie organizmu.

Reakcja na szok cieplny jest niezbędnym szlakiem odpowiedzi na stres komórkowy, który utrzymuje proteostazę cytoplazmatyczną i można go scharakteryzować na poziomie molekularnym, komórkowym i organizmowym u eleganów morskich. Przedstawiamy szereg znormalizowanych protokołów i najlepszych praktyk, które generują solidną indukcję reakcji na szok cieplny u eleganów morskich, aby pomóc zwiększyć odtwarzalność w polu reakcji na szok cieplny. Pokazujemy, że tolerancja termiczna, powszechnie stosowany test organizmu, nie jest zależna od reakcji na szok cieplny.

Zamiast tego zalecamy użycie odzysku termicznego, testu organizmu, który jest zależny od reakcji na szok cieplny. Reakcja na szok cieplny ulega osłabieniu wraz z nadejściem składania jaj. Dlatego czas rozwoju jest krytyczną zmienną, którą należy uwzględnić w eksperymentach z reakcją na szok cieplny.

Zacznij od utworzenia zsynchronizowanej populacji robaków. Użyj platynowego drucianego szpikulca, aby przenieść około 10 grawitacyjnych dorosłych robaków na świeży talerz. Upewnij się, że usunąłeś wszelkie jaja lub larwy, które mogły zostać przeniesione wraz z dorosłymi osobnikami.

Pozwól robakom złożyć jaja przez godzinę, a następnie usuń dorosłe osobniki z talerza. Utrzymuj zsynchronizowane robaki w temperaturze 20 stopni Celsjusza do pożądanego etapu rozwoju, biorąc pod uwagę, że czas rozwoju różni się w zależności od szczepu i temperatury, w której robaki są hodowane. Gdy robaki są gotowe na szok cieplny, owiń płytki folią parafinową i użyj stojaka na probówki z ołowianym ciężarkiem, aby zanurzyć je w krążącej łaźni wodnej o temperaturze 33 stopni Celsjusza na godzinę.

Odzyskaj płytki z kąpieli wodnej i osusz je ręcznikiem papierowym. Usuń folię parafinową i pozwól robakom zregenerować się w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez sześć do 24 godzin, co będzie wystarczającym czasem do syntezy GFP. Aby przygotować szkiełka do obrazowania, umieść szkiełko mikroskopowe między dwoma innymi szkiełkami, na których znajduje się pasek taśmy laboratoryjnej.

Przygotuj 3% roztwór agarozy w wodzie i podgrzej go w kuchence mikrofalowej, aż agarozy się rozpuszczą. Następnie za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra umieść około 150 mikrolitrów agarozy na środku szkiełka. Natychmiast przykryj szkiełko pustym szkiełkiem, umieszczając je prostopadle tak, aby spoczywało na taśmie laboratoryjnej, a następnie ostrożnie je wyjmij.

Aby unieruchomić robaki, dodaj małą kroplę jednego milimolowego lewamizolu, buforu M9, do środka podkładki agarozowej i przenieś 10 robaków do kropli za pomocą platynowego drucianego szpikulca. Opcjonalnie rozprowadź lewamizol na zewnątrz podkładki agarozowej i wyrównaj robaki z kilofem, gdy zostaną sparaliżowane. Przykryj robaki szkiełkiem nakrywkowym i zobrazuj je tak szybko, jak to możliwe, za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Aby wykonać test termoregeneracji, zsynchronizuj robaki i utrzymuj je w temperaturze 20 stopni Celsjusza do pożądanego etapu rozwoju. Następnie szokuj ich termicznie przez sześć godzin. Wyjmij płytki z łaźni wodnej i pozwól im dojść do siebie w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Po wyzdrowieniu policz liczbę robaków, które mogą natychmiast uciec po mechanicznej stymulacji bez gwałtownych ruchów lub paraliżu. Aby zobrazować indukcję reakcji na szok cieplny na poziomie komórkowym, przeanalizowano dwa fluorescencyjne szczepy reporterowe Sea Elegans. W ujemnych próbkach kontrolnych bez szoku cieplnego reporter hsp-16,2 wykazywał normalną autofluorescencję, ale reporter hsp-70 miał konstytutywną fluorescencję w mięśniu depresyjnym odbytu.

Po jednej godzinie szoku cieplnego zaobserwowano silną fluorescencję w obu reporterach, gdy RNAi użyto do strącenia hsf-1 przed pomiarem indukcji reportera. Fluorescencja obu szczepów była znacznie zmniejszona, co wskazuje, że te reportery są zależne od hsf-1. Aby określić ilościowo indukcję reakcji na szok cieplny na poziomie molekularnym, dwa rodzime białka szoku cieplnego zmierzono za pomocą rt key PCR.

Stwierdzono, że jednogodzinny szok cieplny o temperaturze 33 stopni Celsjusza powoduje ponad 2000-krotny wzrost względnej ekspresji dwóch genów szoku cieplnego. Test termoregeneracji wykazał, że narażenie na sześciogodzinny szok cieplny doprowadziło do 20% spadku liczby robaków przy normalnym ruchu po 48-godzinnej rekonwalescencji. Knockdown hsf-1 spowodował dramatyczny spadek normalnego ruchu, przy czym ponad 95% robaków wykazywało gwałtowne ruchy lub paraliż po szturchnięciu.

W przeciwieństwie do tego, knockdown hsf-1 nie miał znaczącego wpływu na wyniki testu tolerancji termicznej, w którym robaki są wystawione na ciągłą temperaturę 35 stopni Celsjusza, a procent żywych robaków jest mierzony w różnych punktach czasowych. Wykonując tę technikę po raz pierwszy, pamiętaj, aby dwukrotnie owinąć płytki folią parafinową, aby zapobiec przedostawaniu się wody do płytek i zrujnowaniu eksperymentu. Testy molekularne można rozszerzyć o analizy genomowe przy użyciu sekwencji RNA.

Można uwzględnić inne testy organizmów, na które ma wpływ reakcja na szok cieplny, takie jak długość życia. Unikalna zdolność do korelowania molekularnych, komórkowych i organizmowych testów odpowiedzi na szok cieplny u eleganów morskich okazała się nieoceniona dla zrozumienia roli tego szlaku w rozwoju i chorobie.