Metoda osadzania kolonii drożdży

Ogólnym celem tej procedury jest osadzenie kolonii drożdży. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie kolonii i leżącego pod nią agaru z płytki agarowej, umieszczenie go na kilku kroplach stopionego agaru i szybkie pokrycie go większą ilością stopionego aer. Następnie nadmiar AER jest wycinany z kolonii, aby był wystarczająco mały, aby zmieścił się w formie.

Kolonia osadzona w AER jest następnie utrwalana, barwiona, odwadniana, a na koniec infiltrowana żywicą ostróg. Blok jest następnie umieszczany w formie z dodatkowymi ostrogami, żywicą inkubowaną do stwardnienia, a następnie dzielony na sekcje. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują rozmieszczenie typów komórek w kolonii drożdży za pomocą mikroskopii świetlnej lub elektronowej.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak skaningowa mikroskopia elektronowa, jest to, że pozwala ona na określenie wewnętrznej struktury kolonii. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju drobnoustrojów, takie jak rozmieszczenie typów komórek w koloniach. Metoda ta dostarczyła informacji na temat struktury kolonii croce CAC, ale jest prawdopodobne, że można ją również zastosować do innych mikroorganizmów.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ obchodzenie się z koloniami i osadzanie ich może być trudne do nauczenia się na podstawie pisemnego protokołu. Pomysł na tę metodę został zainspirowany danymi genetycznymi, które opublikowaliśmy w 2002 roku, a które sugerowały, że zarodniki nie są równomiernie rozmieszczone w koloniach. Dostosowaliśmy metodę sekcji kolonii, która została opracowana przez engelberga w laboratorium płetw.

Więc zacznijmy. Rozpocznij od inkubacji drożdży Wild S visi na płytkach ślimakowych w temperaturze 30 stopni, aż pojawi się około 300 kolonii. Za pomocą wąskiej szpatułki usuń kolonie o średnicy od jednego do dwóch milimetrów, pojedynczo z płytki.

Następnie za pomocą jednomililitrowej pipety umieść kilka kropli 2% agaru w temperaturze 42 stopni Celsjusza na szkiełku mikroskopowym i natychmiast umieść kolonię na agarze stroną do góry, zanim AER zastygnie. Umieść kilka dodatkowych kropli agaru na kolonii i pozwól agarowi zastygnąć, upewnij się, że cała kolonia, w tym górna część kolonii, jest otoczona aganem. We wszystkich kolejnych krokach protokołu za pomocą żyletki.

Przytnij AER wokół kolonii i umieść blok AER zawierający kolonię. W 3,5 mililitrowej fiolce z zakrętką z krzemianu bo zawierającej 2% aldehydu paraform i 2% aldehydu glutarowego należy przetwarzać kolonie utrwalające, pojedynczo, aby zapobiec wysuszeniu, ale w tej samej fiolce można umieścić do 10 kolonii. Opuść kolonie na siedem dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po tygodniu usuń utrwalacz i dwukrotnie umyj rodziny rolnicze, używając około 1,5 mililitra 0,15 mola sodu. Cate przy pH 7,2 i inkubować na lodzie po każdym myciu przez 15 minut bez mieszania. Po tym praniu jeszcze dwa razy.

Używając 1,5 mililitra jednego buforu X OS, składającego się ze 100 milimolowego monofosforanu potasu, 10 milimolowego chlorku magnezu o pH 6,0, inkubując na lodzie przez pięć minut po każdym płukaniu. Następnie, używając tej samej fiolki, wykonaj zabieg osmu i płukanie wymienione tutaj oraz w pisemnej części niniejszego protokołu. Następnie, używając tej samej fiolki, wykonaj stopniowe odwadnianie wymienione tutaj i w dołączonym pisemnym protokole wcześnie następnego ranka.

Przygotować odczynnik do ostróg, jak pokazano tutaj i w dołączonym pisemnym protokole. Natychmiast umyj bloki rolne pięć razy przez 10 minut każdy 1,5 mililitra 100% etanolu o temperaturze pokojowej. Po ostatnim myciu etanolem usuń tylko tyle etanolu, aby blok rolniczy pozostał przykryty.

Za pomocą pipety pastwiskowej umieścić około 0,5 mililitra odczynnika do ostróg w fiolce i obracać na kole z małą prędkością przez 15 minut. W temperaturze pokojowej po obróceniu należy odstawić fiolkę na 30 minut. Następnie całkowicie usuń roztwór.

Następnie dodaj 1,5 mililitra odczynnika do ostróg, aby pokryć blok rolniczy. Ponownie obracać fiolkę na kole przez 15 minut w temperaturze pokojowej i odstawić na 30 minut. Powtórz to pranie.

Zrób krok jeszcze trzy razy. Po ostatnich 30 minutach usuń odczynnik do ostróg i dodaj świeży odczynnik do ostróg, aby przykryć bloki. Pozostaw bloki agro w temperaturze pokojowej na cztery godziny.

Wymień odczynnik do ostróg i obracaj przez noc. Następnego ranka wymienić odczynnik z ostrogami i pozostawić fiolki obracające się do następnego dnia. Następnego ranka umieść odczynnik do ostróg w ponumerowanych silikonowych foremkach, aby przykryć tylko spód foremek.

Następnie umieść bloki agri w foremkach i inkubuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Po czterech godzinach uzupełnij formy większą ilością ostróg, odczynnikiem i inkubuj przez noc w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Wyjmij bloki z formy w celu przekrojenia.

Przykład lekkiego mikrozdjęcia przekroju przez środek kolonii drożdży Wild S Visia pokazano tutaj. Drożdże te są szczepem typu dzikiego wyizolowanym z wysięków drzewnych. Kolonia była inkubowana przez sześć dni na pożywce YNA przed sekcją.

Na tym obrazie drożdże asai, pseudo hyphy i jajowate są łatwe do odróżnienia, a region kolonii atakujący leżący pod spodem agar jest również widoczny. Otwarte strzałki wskazują reprezentatywne wypełnione asai strzałki, oznaczają reprezentatywne jajowate komórki wegetatywne, wypełnione grot strzałki, wskazują łańcuchy wydłużonych komórek i si. Zdjęcie to jest przykładem mikrofotografii elektronowej z cienkiego przekroju laboratoryjnego szczepu drożdży SH 1 0 2 0 i W 3 0 3.

Kolonia była inkubowana przez sześć dni na pożywce YNA przed sekcją. Obraz przedstawia obszar kolonii zawierający dużą częstotliwość komórek zarodnikowych. Strzałka wskazuje dwuwarstwową strukturę ściany zarodników.

W części A pokazujemy wycinek czterodniowej kolonii z siatką złożoną z 15 prostokątów nałożonych na obraz w części B. Częstotliwość komórek związanych z zarodnikami w każdym prostokącie jest przeszczepiona z 15 paskami odpowiadającymi 15 prostokątom pokazanym w części A. Dane są średnią i błędem standardowym czterech niezależnych czterodniowych kolonii W części C, Pokazano średnie i błędy standardowe dla czterech niezależnych ośmiodniowych kolonii. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch tygodni z jednym pełnym dniem i kilkoma godzinnymi lub trzygodzinnymi dniami. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o natychmiastowym dodaniu roztworów, aby bloki nie wyschły Zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak immunomikroskopia elektronowa, mogą być wykorzystane do określenia rozmieszczenia komórek, które wyrażają określone białka po ich rozwoju. Ta technika pozwoliła nam przyjrzeć się nie tylko wzorowaniu komórek zarodnikowych, ale także wzorowaniu się komórek pseudostrzępkowych w koloniach croce CCI. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak osadzać kolonie drożdży do sekcji.

Nie zapominaj, że wiele odczynników mikroskopowych używanych w tym protokole może być niezwykle niebezpiecznych. Należy pamiętać o używaniu dygestoriów, noszeniu odzieży ochronnej i odpowiedniej utylizacji odczynników. Dobra, to wszystko.

Dzięki za oglądanie. Powodzenia w eksperymentach.