Name: Metoda osadzania kolonii drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Naucz się metody osadzania kolonii drożdży w celu analizy mikroskopowej komórek sporulujących i pseudohyfalnych. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie organizacji typów komórkowych w koloniach grzybów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania zostały sfinansowane przez NIH 1R15GM094770.

1. Izolacja i fiksacja kolonii
<ol>
<li>Inkubować 300 kolonii na podłożu agarowym przez wskazany czas (izolowana kolonia powinna mieć średnicę 1-2 mm).</li>
<li>Przenieść kolonię (stroną górną do góry) wraz z podkładem z podłoża, używając wąskiej szpatułki.</li>
<li>Nanieść kilka kropel 2% agaru o temperaturze 42°C na szkiełko przedmiotowe za pomocą końcówki do pipety 1 mL i natychmiast umieścić kolonię na agarze stroną górną do góry, zanim on zestaleje.</li>
<li>Nanieść kilka kropel 2% agaru o temperaturze 42°C na kolonię i pozostawić do zastygnięcia.</li>
<li>Przez wszystkie kolejne etapy niniejszego protokołu należy używać rękawiczek.</li>
<li>Przyciąć blok żyletką i umieścić go w borokrzemianowej fiolce z nakrętką o pojemności 3,5 mL zawierającej fiksatyw 2% paraformaldehydu/2% glutaraldehydu na 7 dni w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
2. Płukanie i traktowanie osmem
<ol>
<li>Po około 1 tygodniu, w dygestorium chemicznym, przemyć bloki agaru w temperaturze 0°C, inkubując dwukrotnie przez 15 minut w ilości 0,15M kacodylanu sodu (pH 7,2) wystarczającej do całkowitego przykrycia kolonii (około 1,5 mL), a następnie dwukrotnie przez 5 minut w takiej samej objętości 1X buforu OS (10 mM KH2PO4 10 mM MgCl2, pH 6,0).</li>
<li>W dygestorium chemicznym dodać do probówek (w temperaturze 0°C) taką samą objętość 1% OsO4 [2 mL OsO4 (2%) + 2 mL 2x buforu OS], aby przykryć bloki agaru, inkubować przez 1 godzinę, a następnie przemyć dwukrotnie taką samą ilością 1X buforu OS przez 10 minut każdego razem.</li>
<li>Pozostawić probówki na noc w temperaturze 4°C w 1X buforze OS.</li>
<li>Utrawialnik oraz wszystkie płukanki z tego etapu należy zutylizować jako odpady niebezpieczne. Wszystkie pipety zawierające OsO4 zostały trzykrotnie wypłukane olejem roślinnym.</li>
</ol> 3. Płukanie i odwodnienie
<ol>
<li>Następnego ranka kostki agaru należy dwukrotnie przemyć na lodzie zimną wodą (w tej samej objętości co powyżej), po 10 minut każdego płukania, używając pipety Pasteura.</li>
<li>Następnie należy przemywać sekwencyjnie taką samą objętością etanolu o stężeniach 25%, 50%, 75% i 95% przez 10 minut dla każdego stężenia, a następnie dwukrotnie przemyć 10% etanolem przez 10 minut. Przechowywać przez noc w temperaturze 4°C w 10% etanolu.</li>
<li>Wszystkie odpady z płukania na tym etapie należy zutylizować jako odpady niebezpieczne.</li>
</ol>
4. Preparacja Spurra
<ol>
<li>Następnego ranka (tak wcześnie, jak to możliwe) odważ następujące roztwory (EM Sciences) do jednorazowego plastikowego zlewka pod wyciągiem w celu przygotowania odczynnika Spurra. Podczas wszystkich kolejnych prac z użyciem tego odczynnika należy nadal korzystać z wyciągu. 
(roztwór ERL 421 5 g) 
(roztwór DER 736 4 g) 
(roztwór NSA 13 g)
</li>
<li>Mieszaj te roztwory (powoli) przez 20 minut pod wyciągiem, używając mieszadełka magnetycznego</li>
<li>Dodaj 0,15 g roztworu DMAE i mieszaj przez 20 minut w opisany wyżej sposób.</li>
<li>Odgazuj powyższą mieszaninę przez 1-2 h pod wyciągiem.</li>
</ol>
5. Infiltracja metodą Spurra
<ol>
<li>Niezwłocznie po przygotowaniu odczynnika Spurra przemyć bloki agarowe 5 razy w 10% etanolu o temperaturze pokojowej (objętość taka sama jak powyżej), po 10 minut na każdy cykl. Po ostatnim płukaniu etanolem usunąć go za pomocą pipety Pasteura w taki sposób, aby pozostały etanol ledwie zakrywał bloki agarowe.</li>
<li>Dodać w przybliżeniu taką samą ilość odczynnika Spurra (około 0,5 mL) i obracać fiolki na rotatorze przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie pozostawić na 30 minut. Po 30 minutach całkowicie usunąć roztwór za pomocą pipety Pasteura, dodać odczynnik Spurra tak, aby zakrył blok agarowy (około 1,5 mL), obracać fiolki na rotatorze przez 15 minut w temperaturze pokojowej i pozostawić na 30 minut. Powtórzyć wymianę odczynnika Spurra, rotację i inkubację jeszcze 3 razy.</li>
<li>Po ostatnich 30 minutach usunąć odczynnik Spurra i dodać świeży odczynnik Spurra, aby zakryć bloki. Pozostawić bloki agarowe w temperaturze pokojowej na 4 h.</li>
<li>Wymienić odczynnik Spurra i obracać próbki przez noc.</li>
<li>Rano wymienić odczynnik Spurra i pozostawić w rotacji do następnego dnia.</li>
<li>Następnego ranka nalać odczynnik Spurra do ponumerowanych form silikonowych (Fisher Scientific) tak, aby zakrył jedynie dno form, a następnie umieścić w nich bloki agarowe. Inkubować w 60°C przez 4 godziny.</li>
<li>Po 4 h dopełnić formy odczynnikiem Spurra i inkubować w 60°C przez noc.</li>
<li>Jeśli po wyjęciu bloków z form są one nadal lekko elastyczne, należy je zwrócić do form i inkubować przez dodatkowe 2 dni.</li>
</ol>
6. Przygotowanie skrawków
<ol>
<li>Do wycinania skrawków o grubości 0,5 μ do mikroskopii świetlnej oraz cienkich skrawków o grubości 0,1 μ do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (EM) wykorzystano mikrotom Leica Ultracut S.</li>
<li>W przypadku mikroskopii świetlnej wycinane skrawki umieszczano w kropli dH2O, a następnie suszono na bloku grzewczym o temperaturze 52°C. Wysuszone skrawki barwiono kroplą 1,0 % błękitu toluidyny w 1% boranie sodu przez 5–15 sekund. Po barwieniu skrawki bezzwłocznie płukano pod strumieniem wody, suszono, zamykano w medium montażowym (KPL) i zabezpieczano próbkę szkiełkiem nakrywkowym.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
Szeroki zakres zastosowań pomiaru formowania wzorów u drożdży i innych mikroorganizmów został omówiony w poprzednich publikacjach 1. Szczególną uwagę zwraca zwiększona funkcjonalność zorganizowanych kolonii drobnoustrojów w porównaniu do społeczności niezorganizowanych.
Opisana metoda jest modyfikacją metody osadzania większych wyspecjalizowanych kolonii 2, a krótki opis wprowadzonych przez nas modyfikacji został opublikowany 3.
Przykład mikrofotografii świetlnej przekroju przez środek kolonii dzikich drożdży S. cerevisiae przedstawiono na Rysunku 1. Łatwo rozróżnić woreczki, pseudohyfy oraz jajowate komórki drożdży, a widoczny jest również obszar kolonii wrastającej w znajdujący się poniżej agar.
Przykład mikrografii elektronowej szczepu laboratoryjnego drożdży (tło W303) przedstawiono na Rysunku 2. Obraz pochodzi z obszaru kolonii zawierającego wysoką częstotliwość komórek sporulujących.
<img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig1.jpg" alt="Przekrój histologiczny przedstawiający rozkład komórek tkankowych; badanie z procesem barwienia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Mikroskopia świetlna kolonii dzikiego drożdża. Drożdże te (YPS13) zostały niedawno wyizolowane z eksudatów drzewnych. 4Kolonię inkubowano przez 6 dni na podłożu YNA. 5 przed wykonaniem przekrojów. Otwarte strzałki wskazują reprezentatywne worki, wypełnione strzałki wskazują reprezentatywne jajowate komórki wegetatywne, a wypełnione groty strzałek wskazują łańcuchy wydłużonych komórek (pseudohify) oraz worki. 
<img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig2.jpg" alt="Morfologia komórek bakteryjnych, obraz z mikroskopu elektronowego, przedstawiający warstwy peptydoglikanu i etapy podziału." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Mikroskopia elektronowa laboratoryjnego szczepu drożdży. Kolonię SH1020 (tło W303) inkubowano przez 6 dni na podłożu YNA przed wykonaniem przekrojów. 3Zdjęcie przedstawia obszar przekroju z dużą częstotliwością występowania workowców. Strzałka wskazuje dwuwarstwową strukturę ściany zarodnika.
<img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig3.jpg" alt="Schematy analizy sporulacji; regiony kolonii, % sporulacji, 4 i 8 dni, mikroskopia, wykresy słupkowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Ilościowe oznaczenie rozkładu komórek sporulujących w koloniach: A) na centralny obszar obrazu przekroju kolonii nakłada się siatkę zawierającą 15 sąsiadujących ze sobą prostokątów ułożonych w stos wzdłuż ich dłuższego boku. Siatka jest skalowana przy zachowaniu stałych proporcji tak, aby pokrywała dokładnie górną i dolną krawędź kolonii. (B &amp; C) Odsetek komórek zsporulowanych w każdym prostokącie w stosunku do całkowitej liczby komórek w tym prostokącie określono na podstawie wizualnej oceny obrazów kolonii 4-dniowych (B) i 8-dniowych (C). Na przykład prostokąt znajdujący się w górnej części kolonii (oznaczony jako „1”) odpowiada lewej stronie wykresu. Przedstawiono średnią z 4 kolonii; słupki błędu wskazują błąd standardowy.

<ol><li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+symmetries%3A+regulation+of+Dictyostelium+development+through+chemoattractant+and+morphogen+signal-response%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response.</a> Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).</li>
<li>Palkova, Z., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+within+a+community%3A+benefit+to+yeast+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Life within a community: benefit to yeast long-term survival.</a> FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significances+of+bacterial+colony+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The significances of bacterial colony patterns.</a> Bioessays. 17, 597-597 (1995).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).</li>
<li>Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+stalk-like+structures+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).</li>
<li>Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+analysis+of+Saccharomyces+cerevisiae+stalk-like+structures+reveals+spatial+organization+and+cell+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization.</a> J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).</li>
<li>Piccirillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+pathway+and+alkaline+pH+regulate+pattern+formation+in+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies.</a> Genetics. 184, 707-707 (2010).</li>
<li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).</li>
<li>Piccirillo, S., Honigberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+patterning+and+invasive+growth+in+wild+and+domesticated+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies.</a> Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).</li>
<li>Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environ Microbiol. , (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Przedstawiona metoda ujawnia struktury wewnętrzne kolonii. Ponieważ metoda ta jest skuteczna w określaniu wzorców typów komórek w szerokim zakresie szczepów S. cerevisiae o różnej morfologii kolonii, a także u pokrewnego gatunku S. paradoxus 5, prawdopodobnie znajdzie ona zastosowanie również w przypadku wielu grzybów i innych mikroorganizmów.
Kluczowym krokiem dla powodzenia tej metody jest zapewnienie, aby cała kolonia, w tym jej górna część, była przez cały czas trwania...

<table><tbody><tr><td>Tetroksyd osmu</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 19152</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowe formy do zatapiania</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC 9975029</td><td></td></tr><tr><td>Cykloalifatyczna żywica epoksydowa</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15004</td><td>ERL 4221</td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 13000</td><td>DER 736</td></tr><tr><td>Beznonylowy bezwodnik bursztynowy</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 19050</td><td>NSA</td></tr><tr><td>2-Dimetyloamino&amp;#8211;etanol</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 13300</td><td>DMAE</td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>KPL Inc</td><td>71-00-16</td><td></td></tr><tr><td>Koło obrotowe</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>Pelco 1055</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Microsystems</td><td>Ultracut S</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda zatapiania kolonii drożdży

Yeast Colony Embedding Method

Tworzenie wzorów rozmieszczenia różnych typów komórek w embrionach jest kluczowym mechanizmem rozwoju organizmów wielokomórkowych. Społeczności mikroorganizmów, takie jak kolonie i biofilmy, również wykazują wzorce rozmieszczenia typów komórek. Na przykład w drożdżach S. cerevisiae komórki sporulacyjne oraz komórki pseudohifalne nie są rozmieszczone w koloniach w sposób jednorodny. Funkcjonalne znaczenie tych wzorców oraz molekularne mechanizmy leżące u ich podstaw nie są jeszcze dobrze poznane.
Jednym z wyzwań w badaniu wzorców typów komórek w koloniach grzybów jest fakt, że w przeciwieństwie do tkanek metazoicznych, komórki w koloniach są ze sobą stosunkowo słabo związane. W szczególności kolonie grzybów nie zawierają tak rozbudowanej macierzy zewnątrzkomórkowej, jaka występuje w większości tkanek. Przedstawiamy tutaj metodę zatapiania i krojenia kolonii drożdży, która pozwala ujawnić wewnętrzne wzorce typów komórek w tych koloniach. Metodę tę można wykorzystać do przygotowania grubych przekrojów (0.5 μ) użytecznych w mikroskopii świetlnej oraz cienkich przekrojów (0.1 μ) odpowiednich do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Za pomocą mikroskopii świetlnej można łatwo odróżnić worki i komórki pseudoryzowe od owalnych komórek drożdżowych, natomiast strukturę wewnętrzną tych komórek można zwizualizować za pomocą EM.
Metoda ta opiera się na otaczaniu kolonii agarem, infiltracji ich pożywką Spurra, a następnie wykonywaniu skrawków. Do tego protokołu odpowiednie są kolonie o średnicy w zakresie 1-2 mm. Oprócz wizualizacji wnętrza kolonii metoda ta pozwala na obrazowanie obszaru kolonii naciekającego do leżącego poniżej agaru.

Metoda zatapiania kolonii drożdży umożliwiająca wykonywanie przekrojów do mikroskopii świetlnej i elektronowej. Protokół ten pozwala na określenie rozmieszczenia komórek zsporulowanych i komórek pseudohifowych w obrębie kolonii, stanowiąc nowe narzędzie do zrozumienia organizacji typów komórek w obrębie społeczności grzybowej.

Metoda zatapiania kolonii drożdży

Wzorowanie różnych typów komórek w embrionach jest kluczowym mechanizmem rozwoju metazoa. Społeczności mikroorganizmów, takie jak kolonie i biofilmy...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zatopienie kolonii drożdży. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie kolonii wraz z podstawną warstwą agaru z płytki agarowej, umieszczenie jej na kilku kroplach roztopionego agaru i szybkie przykrycie go kolejną porcją roztopionego agaru. Następnie nadmiar agaru jest odcinany od kolonii, aby była ona wystarczająco mała, by zmieścić się w formie.Osadzoną kolonię AER następnie utrwalono, zabarwiono, odwodniono, a na koniec zainfiltrowano żywicą Spurr. Blok umieszczono następnie w formie z dodatkową ilością żywicy Spurr, inkubowano do czasu utwardzenia, a następnie wykonano skrawki. W końcowym etapie można uzyskać wyniki obrazujące rozkład typów komórek w kolonii drożdży przy użyciu mikroskopii świetlnej lub elektronowej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak skaningowa mikroskopia elektronowa, jest możliwość określenia wewnętrznej struktury kolonii. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju drobnoustrojów, takie jak rozmieszczenie typów komórek w obrębie kolonii. Metoda ta dostarczyła wglądu w strukturę kolonii croce CAC, jednak prawdopodobnie można ją zastosować również do innych mikroorganizmów.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ manipulowanie koloniami i ich zatapianie w medium mogą być trudne do opanowania na podstawie samego protokołu pisanego. Pomysł na tę metodę był zainspirowany opublikowanymi przez nas w 2002 roku danymi genetycznymi, z których wynikało, że przetrwalniki nie są równomiernie rozmieszczone w koloniach. Dostosowaliśmy metodę przekrojów kolonii opracowaną przez Engelberga w laboratorium Fin.Zacznijmy. W pierwszej kolejności należy inkubować drożdże Wild S visi na płytkach z agarem w temperaturze 30 °C do momentu pojawienia się około 300 kolonii. Za pomocą wąskiej szpatułki należy pojedynczo pobierać z płytki kolonie o średnicy od jednego do dwóch milimetrów.Następnie, używając końcówki do pipety o pojemności 1 ml, nanieś kilka kropli 2% agaru o temperaturze 42 °C na szkiełko przedmiotowe i niezwłocznie umieść kolonię stroną agaru do góry, zanim AER zastygnie. Nanieś kolejne kilka kropli agaru na kolonię i pozwól mu zastygnąć, upewniając się, że cała kolonia, w tym jej górna część, jest całkowicie zatopiona w agarze. We wszystkich kolejnych krokach protokołu używaj żyletki.Wytnij blok AER wokół kolonii i umieść blok AER zawierający kolonię w fiolce z nakrętką z borokrzemianu o pojemności 3,5 ml, zawierającej utrwalacz składający się z 2% paraformaldehydu i 2% glutaraldehydu. Kolonie należy przetwarzać pojedynczo, aby zapobiec ich wysychaniu, jednak w jednej fiolce można umieścić do 10 kolonii. Pozostaw kolonie na siedem dni w temperaturze 4°C.Po jednym tygodniu usunąć utrwalacz i dwukrotnie przemyć kolonie agri, używając około 1,5 milliliters 0,15 molar sodium Cate o pH 7,2, a po każdym przemywaniu inkubować na lodzie przez 15 minut bez mieszania. Następnie powtórzyć to przemywanie dwukrotnie.Należy użyć 1,5 ml buforu OS 1X, składającego się z 100 mM fosforanu monopotasowego i 10 mM chlorku magnezu przy pH 6,0, inkubując na lodzie przez pięć minut po każdym przemyciu. Następnie, korzystając z tej samej probówki, należy przeprowadzić traktowanie osmem oraz etapy przemywania opisane tutaj i w pisemnej części niniejszego protokołu. Potem ponownie, w tej samej probówce, należy przeprowadzić stopniowe odwadnianie opisane tutaj oraz w towarzyszącym protokole pisemnym wczesnym rankiem następnego dnia.Przygotować odczynnik spurs zgodnie z instrukcją przedstawioną tutaj oraz w towarzyszącym protokole pisemnym. Bezzwłocznie przemyć bloki agri pięciokrotnie, przez 10 minut każdego mycia, używając 1,5 milliliters 100% etanolu w temperaturze pokojowej. Po ostatnim płukaniu etanolem usunąć tylko tyle cieczy, aby bloki agri pozostały przykryte.Za pomocą pipety pasteura przenieś około 0,5 milliliters odczynnika spurs do fiolki i wiruj w wirówce z niską prędkością przez 15 minut. Po wirowaniu pozostaw fiolkę w temperaturze pokojowej na 30 minut. Następnie całkowicie usuń roztwór.Następnie należy dodać 1,5 milliliters odczynnika spurs, aby pokryć blok agri. Ponownie rotuj fiolkę na kole przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odstaw na 30 minut. Powtórz to przemywanie.Powtórz ten krok jeszcze trzy razy. Po ostatnim 30-minutowym okresie usuń odczynnik SPURS i dodaj świeży odczynnik SPURS, aby przykryć bloki. Pozostaw bloki agri w temperaturze pokojowej na cztery godziny.Wymień odczynnik spurs i inkubuj w rotacji przez noc. Następnego ranka ponownie wymień odczynnik spurs i pozostaw fiolki w rotacji do następnego dnia. Kolejnego ranka wlej odczynnik spurs do ponumerowanych form silikonowych tak, aby zakryć jedynie dno form.Następnie umieść bloki agri w formach i inkubuj w temperaturze 60 °C przez cztery godziny. Po upływie czterech godzin dopełnij formy kolejnymi porcjami medium, odczynnikiem i inkubuj w temperaturze 60 °C przez noc. Wyjmij bloki z form w celu wykonania skrawków.Tutaj przedstawiono przykład mikrofotografii świetlnej przekroju przez środek kolonii drożdży Wild S Visia. Te drożdże stanowią szczep typu dzikiego wyizolowany z eksudatów drzewnych. Kolonia była inkubowana przez sześć dni na podłożu YNA przed wykonaniem przekroju.Na tym obrazie łatwo można rozróżnić asai, pseudostrzyjki oraz owalne komórki drożdżowe, a także widoczny jest obszar kolonii wnikającej w podłoże agarowe. Otwarte strzałki wskazują reprezentatywne asai, wypełnione strzałki wskazują reprezentatywne owalne komórki wegetatywne, a wypełnione groty strzałek wskazują łańcuchy wydłużonych komórek i si. Ten obraz jest przykładem mikrografii elektronowej wykonanej z cienkiego przekroju szczepów laboratoryjnych drożdży SH 1 0 2 0 oraz W 3 0 3.Tło.Kolonię inkubowano przez sześć dni na podłożu YNA przed wykonaniem przekrojów. Obraz przedstawia fragment kolonii zawierający wysoką częstotliwość komórek zasporulowanych. Strzałka wskazuje dwuwarstwową strukturę ścianki przetrwalnika.W części A przedstawiono przekrój czterodniowej kolonii z nałożoną siatką składającą się z 15 prostokątów, widoczną na obrazie w części B. Częstość występowania komórek związanych z przetrwalnikami w każdym prostokącie wykreślono za pomocą 15 słupków odpowiadających 15 prostokątom pokazanym w części A. Dane stanowią średnią i błąd standardowy dla czterech niezależnych czterodniowych kolonii. W części C przedstawiono średnie i błędy standardowe dla czterech niezależnych ośmiodniowych kolonii. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu dwóch tygodni, obejmując jeden pełny dzień oraz kilka dni po jednej do trzech godzin. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o niezwłocznym dodawaniu roztworów, aby bloki nie wyschły podczas postępowania zgodnie z tą procedurą.Inne metody, takie jak immuno-mikroskopia elektronowa, mogłyby zostać zastosowane do określenia rozmieszczenia komórek wykazujących ekspresję konkretnych białek po ich rozwoju. Technika ta pozwoliła nam przyjrzeć się nie tylko wzorowi rozmieszczenia komórek sporulujących, ale również komórek pseudohifowych w koloniach croce CCI. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić inkluzję kolonii drożdży w celu ich sekcjonowania.Należy pamiętać, że wiele odczynników do mikroskopii użytych w tym protokole może być niezwykle niebezpiecznych. Prosimy pamiętać o korzystaniu z dygestorium, noszeniu odzieży ochronnej i właściwej utylizacji odczynników. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie. Powodzenia w eksperymentach.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda Osadzania Kolonie Drożdży

Szybkie techniki wizualizacji coraz unieruchomionych komórek drożdży, tutaj stosowane do świetlówek dziennikarzom w cichej krycia loci HML i...

Szybkie Technika Wizualizacja żywo unieruchomionych komórek drożdży

Ten film opisuje metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii. Biofilmy bakteryjne często tworzą się na powierzchniach grzybów i obejmują liczne procesy interakcji bakteryjno-grzybiczych, takie jak współpraca metaboliczna, konkurencja lub drapieżnictwo.

Metoda przygotowania próbki w celu wizualizacji bakterii tworzących biofilm na strzępkach grzybów

Przedstawiamy protokół zamrażania i kriosekcji społeczności drożdży w celu obserwacji wewnętrznych wzorców komórek fluorescencyjnych.  Metoda opiera się na wiązaniu metanolu i osadzaniu OCT w celu zachowania przestrzennego rozmieszczenia komórek bez inaktywacji białek fluorescencyjnych w społeczności.

Kriosekcja zbiorowisk drożdży w celu zbadania wzorców fluorescencji

Przedstawiono metodę rozprzestrzeniania się chromosomów powierzchniowych z pączkujących drożdży. Metoda ta wywodzi się z metody opisanej wcześniej przez Loidla i Kleina. Ponadto demonstrujemy procedurę barwienia immunologicznego chromosomów rozsianych.

Rozprzestrzenianie się powierzchniowe i barwienie immunologiczne chromosomów drożdży

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Opisujemy techniki utrwalania, zatapiania parafiny i cienkiego cięcia biofilmów kolonii mikroorganizmów. W przygotowanych próbkach za pomocą mikroskopii można uwidocznić podstrukturę biofilmu i wzorce ekspresji reporterowej.

Osadzanie parafiny i cienkie cięcie biofilmów kolonii drobnoustrojów do analizy mikroskopowej

Tutaj prezentujemy implementację MATLAB automatycznego wykrywania i ilościowego opisu kropelek lipidów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej rozszczepienia i pączkowania komórek drożdży.

Analiza zawartości kropelek lipidów w drożdżach rozszczepialnych i pączkujących przy użyciu zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Wąskim gardłem w cyklu "zaprojektuj-zbuduj-testuj" inżynierii mikrobiologicznej jest szybkość, z jaką możemy przeprowadzać funkcjonalne badania przesiewowe szczepów. Opisujemy wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych szczepów stosowaną do setek do tysięcy komórek drożdży na eksperyment, która wykorzystuje sekwencjonowanie RNA oparte na kropelkach.

Wysokowydajne fenotypowanie szczepów drożdży z sekwencjonowaniem RNA na bazie kropelek

Fenotypy wzrostu drożdży są precyzyjnie mierzone za pomocą wysoce równoległego obrazowania poklatkowego unieruchomionych komórek rosnących w mikrokolonie. Jednocześnie można monitorować tolerancję na stres, ekspresję białek i lokalizację białek, generując zintegrowane zestawy danych w celu zbadania, w jaki sposób różnice środowiskowe i genetyczne, a także niejednorodność ekspresji genów wśród komórek izogenicznych, modulują wzrost.

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

Ten protokół jest skuteczną, szybką metodą hodowli drożdży i pleśni Aspergillus fumigatus z dużych zestawów próbek gleby w ciągu zaledwie 7 dni. Metody te można łatwo modyfikować w celu dostosowania do różnych pożywek inkubacyjnych i temperatur w zależności od potrzeb eksperymentów.

Izolacja drożdży i pleśni nadających się do hodowli z gleb w celu zbadania struktury populacji grzybów

Naucz się metody osadzania kolonii drożdży w celu analizy mikroskopowej komórek sporulujących i pseudohyfalnych. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie organizacji typów komórkowych w koloniach grzybów.

Metoda zatapiania kolonii drożdży

Przeglądaj więcej filmów