Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy za pomocą genetycznie kodowanego czujnika wapnia
April 1st, 2011
Ten protokół opisuje metodę pomiaru strumieni wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda wykorzystuje kołowo permutowany ratiometryczny czujnik wapnia oparty na YFP (ratiometric pericam-mt) selektywnie wyrażany w mitochondriach.
Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie zmian stężenia wapnia w mitochondriach w żywych komórkach. Osiąga się to poprzez pierwszą transekcję komórek za pomocą wskaźnika białka wapnia metryki peram, która jest ukierunkowana na macierz mitochondrialną, jeden lub dwa dni po transfekcji. Mikroskop fluorescencyjny i oprogramowanie są przystosowane do obrazowania żywych komórek.
Obrazy komórek wyrażających peram w proporcji metrycznej są następnie uzyskiwane po dodaniu agonisty mobilizującego wapń. Ostatnim etapem zabiegu jest analiza ilościowa pozyskanych obrazów. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują dynamiczne zmiany w mitochondrialnym stężeniu wapnia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek wyrażających stosunek metrycznego białka wskaźnikowego wapnia.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pomiar poziomu wapnia za pomocą syntetycznych wskaźników wapnia, jest to, że metryka peram jest kodowana genetycznie, a zatem może być ukierunkowana na mitochondria lub inne interesujące narządy. Witam, nazywam się Dr. Ascar, jestem doktorem habilitowanym w laboratorium dr Benninga i będę dzisiaj demonstrować procedurę Aby rozpocząć komórki helo na płytce protokołowej poprzedniej nocy, transfekcja na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych na standardowej sześciodołkowej płytce hodowlanej o gęstości, która będzie około 70% płynna do transfekcji następnego dnia. Następnego dnia przygotuj kompleksy DNA Lipectomy 2000 zgodnie z instrukcjami producenta z czterema mikrogramami metrycznego wektora ekspresji mitochondrialnej peram i 10 mikrolitrami lipektomii 2000 rozcieńczonymi w 0,5 mililitra optimum dla każdej studzienki, która ma być transfekowana.
Następnie zastąp pożywkę hodowlaną D-M-E-M-F-B-S HELOC w każdym dołku 1,5 mililitra tej samej pożywki bez antybiotyków. Dodać roztwór leku LIPEKTOMIA do roztworu DNA i delikatnie wymieszać po utworzeniu się kompleksów. Dodaj kroplami roztwór lipektomii DNA do każdej studzienki, która ma być transfekowana, delikatnie kołysząc płytką i inkubuj przez cztery godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla po inkubacji.
Zastąp pożywkę na D-M-E-M-F-B-S zawierającą antybiotyki. Pozwól komórkom na ekspresję metryczną peram przez jeden do dwóch dni przed obrazowaniem za pomocą kleszczy. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe z komórkami HELOC w odpowiedniej komorze obrazowania z roztworem do obrazowania.
Zamontuj komorę obrazowania w odwróconym stoliku mikroskopowym. Następnie użyj obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 40 x lub więcej i długości fali 380 nanometrów. Aby znaleźć obszar zainteresowania zawierający jedną lub więcej komórek wyrażających metrykę stosunkową, należy tutaj użyć 380 nanometrów do identyfikacji komórek jako metryki stosunku.
Peram jest mniej odporny na fotowybielanie na tej długości fali. Po zidentyfikowaniu obszaru zainteresowania skonfiguruj oprogramowanie do podwójnego wzbudzenia przy 495 i 380 nanometrach. Następnie pozyskuj obrazy sekwencyjnie, naprzemiennie wzbudzając je przy 495 i 380 nanometrach.
Uzyskaj obrazy wyjściowego poziomu wapnia przez co najmniej 30 sekund przed zastosowaniem agonisty. Następnie nałóż agonistę mobilizującego wapń za pomocą aparatu do obfitości, zwracając uwagę na czas dodawania dla każdego agonisty, czasy ekspozycji i odstępy akwizycji powinny być zoptymalizowane, aby zapobiec wybielaniu zdjęć, jednocześnie zapewniając wystarczającą rozdzielczość czasową. Po zakończeniu eksperymentu obrazy można analizować w trybie offline.
Aby rozpocząć analizę, wybierz obszar zainteresowania w pustym obszarze pola, aby w razie potrzeby odjąć fluorescencję tła. Następnie wyeksportuj pomiary współczynnika 4 95 3 80 z obszaru zainteresowania do programu Excel lub podobnego oprogramowania do tworzenia wykresów. Ten panel obrazów pokazuje subkomórkową lokalizację wskaźnika metrycznego peram i mitochondriów.
Po lewej stronie znajduje się obraz żywej komórki helo wyrażające metrykę proporcji peram. W środku znajduje się fluorescencyjne barwienie mitochondriów i selektywny barwnik MIT tracker czerwony CMX Ross. I wreszcie po prawej, scalony obraz pokazany tutaj jest serią pseudokolorowych obrazów o proporcjach 4 95, 3 80 nanometrów czterech komórek helo wyrażających metrykę proporcji peram w mitochondriach traktowanych 10 mikromolami A TP, a kwantyfikacja zmian w mitochondrialnych poziomach wapnia tych poprzednich czterech komórek jest pokazana tutaj na tym obrazie metryki wskaźnika ekspresji komórki hela w mitochondriach.
Niejednorodność odpowiedzi wapniowej w poszczególnych mitochondriach, a także znaczna fragmentacja mitochondriów jest widoczna po 60 minutach leczenia 0,5 mikromolowym storem sporyny. Niektóre mitochondria mają oscylacyjny wzrost wapnia pokazany białą strzałką, podczas gdy inne nie wykazują znaczących zmian poziomu wapnia pokazanych żółtą strzałką. Ten wykres ujawnia zmianę globalnego poziomu wapnia w mitochondriach w pojedynczej komórce helo po indukcji apoptozy przez 120 minut z 0,5 mikromolową stor sporin.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć dynamiczne zmiany poziomu wapnia w mitochondriach w odpowiedzi na różne tli za pomocą białka leczniczego wapnia R geometric peram, które jest selektywnie ukierunkowane na macierz mitochondrialną.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę mierzenia w czasie rzeczywistym przepływów wapnia mitochondrialnego za pomocą genetycznie zakodowanych wskaźników wapnia, ratiometric pericam-mt. Ta technika umożliwia dynamiczne monitorowanie poziomów wapnia w żywych komórkach, dostarczając informacji na temat funkcji mitochondria.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Wizualizacja fluorescencyjna
Tło
- Poziomy wapnia mitochondrialnego są kluczowe dla metabolizmu i sygnalizacji komórkowej.
- Tradycyjne metody pomiaru poziomów wapnia często opierają się na syntetycznych wskaźnikach.
- Genetycznie zakodowane wskaźniki oferują zalety w zakresie specyficzności i ukierunkowania.
- To badanie wykorzystuje ratiometric pericam-mt do ulepszonych obrazów dynamiki wapnia mitochondrialnego.
Cel badania
- Monitorowanie zmian w stężeniu wapnia mitochondrialnego w żywych komórkach.
- Demonstracja użycia genetycznie zakodowanego wskaźnika wapnia ukierunkowanego na mitochondria.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu do obrazowania i analizy przepływów wapnia mitochondrialnego.
Stosowane metody
- Transfekcja komórek ratiometric pericam-mt.
- Wizualizacja żywych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
- Sekwencyjne wzbudzenie przy dwóch długościach fal dla pomiaru wapnia.
- Ilościowa analiza obrazów fluorescencyjnych w celu oceny dynamiki wapnia.
Główne wyniki
- Udane zmierzenie dynamicznych zmian w poziomach wapnia mitochondrialnego.
- Obserwacja heterogeniczności reakcji wapniowych wśród pojedynczych mitochondria.
- Znacząca fragmentacja mitochondria zauważona w pewnych warunkach leczenia.
- Wyniki wykazały skuteczność ratiometric pericam-mt w obrazowaniu w czasie rzeczywistym.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę badania dynamiki wapnia mitochondrialnego.
- Genetycznie zakodowane wskaźniki, takie jak ratiometric pericam-mt, poprawiają możliwości obrazowania.
- Ta technika może być stosowana w różnych warunkach eksperymentalnych do badania funkcji mitochondria.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Monitoring mitochondrial calcium dynamics provides critical mechanistic insights into apoptosis pathways, enabling target validation in cell death mechanisms. This genetically encoded sensor approach supports predictive confidence in preclinical models by quantifying organelle-specific calcium fluxes with temporal resolution. The method facilitates early de-risking of therapeutic hypotheses involving mitochondrial dysfunction in disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial calcium as a regulator of apoptotic pathways for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides organelle-specific readouts that reduce ambiguity in mechanistic studies of cell death.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets involved in calcium-mediated apoptosis through real-time flux measurements.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative ratiometric data enabling dose-response analysis of compounds affecting mitochondrial calcium.
- Operational Value: Compatible with standard wide-field microscopy, allowing integration into existing imaging platforms without specialized equipment.
- Scalability Value: Enables longitudinal tracking of calcium dynamics and mitochondrial morphology in live cells over hours.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links mitochondrial calcium changes to apoptotic outcomes, supporting biomarker relevance in disease models.
- Operational Value: Demonstrates utility with both ATP (physiological agonist) and staurosporine (apoptosis inducer), broadening applicability across experimental conditions.
- Translational Continuity: Facilitates progression from mechanism discovery to preclinical validation by providing dynamic, physiologically relevant readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through mechanistic de-risking to preclinical assessment by providing dynamic, quantifiable data on mitochondrial function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of calcium-dependent apoptotic pathways through real-time mitochondrial flux measurements.
- Screening: Enables assay-ready systems with standardized, reproducible calcium readouts for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers quantitative ratiometric outputs (495nm/380nm excitation ratio) that allow statistical comparison of calcium dynamics across conditions.
- Translational Research: Connects mitochondrial calcium changes to apoptotic phenotypes, supporting continuity from mechanism to phenotypic outcome.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for studying mitochondrial dysfunction across multiple disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in apoptosis pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility through genetically encoded, organelle-targeted indicators that avoid dye leakage and artifacts.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insights into mitochondrial mechanisms of compound action.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on mitochondrial calcium modulation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology for transfection and live-cell imaging.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-excitation capability (380nm and 495nm) and standard filter sets.
- Necessitates standardization of image acquisition protocols and region-of-interest analysis across teams.
- Adaptation considerations include mitochondrial targeting efficiency and potential overexpression artifacts in different cell models.
- Practical limitations include photobleaching risks during long-term imaging and need for optimization of agonist exposure intervals.
