Name: Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy za pomocą genetycznie kodowanego czujnika wapnia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Poznaj metodę pomiaru dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach żywych komórek za pomocą genetycznie kodowanego wskaźnika ratiometric pericam-mt. Technika ta umożliwia badanie funkcji mitochondrialnych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Atsushiemu Miyawakie za dostarczenie konstruktu ekspresyjnego ratiometric-pericam-mt. Praca ta była finansowana z grantu GM081685 przyznanego przez National Institutes of Health (DB).

1. Transfekcja Pericam-mt i przygotowanie komórek.
<ol>
	<li>Wieczorem przed transfekcją wysiej komórki HeLa na sterylne szkiełka nakrywki umieszczone w standardowej 6-dołkowej płytce hodowlanej.</li>
	<li>Przygotuj kompleksy DNA/Lipofectamine 2000 zgodnie z zaleceniami producenta (Invitrogen). Do każdej dołki stosujemy 4 μg wektora ekspresyjnego ratiometric-pericam-mt oraz 10 μL Lipofectamine 2000 rozcieńczonego w 0,5 mL Opti-MEM. Przed transfekcją komórki powinny osiągnąć konfluencję na poziomie ok. 70%.</li>
	<li>W każdej dołce zastąp pożywkę hodowlany komórek HeLa (pożywka Dulbecco's modified eagles medium, 10% FBS, penicylina/streptomycyna) 1,5 mL tej samej pożywki, ale bez antybiotyków.</li>
	<li>Dodaj kompleksy DNA/Lipofectamine do każdej dołki przeznaczonej do transfekcji. Delikatnie wymieszaj poprzez kołysanie i inkubuj przez 4 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37oC i 5 % CO2.</li>
	<li>Zastąp pożywkę bez antybiotyków pożywką hodowlaną z dodatkiem antybiotyków. Pozostaw komórki na 1-2 dni w celu ekspresji ratiometric pericam przed wykonaniem obrazowania.</li>
</ol>
2. Konfiguracja mikroskopu i akwizycja obrazów
<ol>
	<li>Umieść szkiełko podstawowe z komórkami HeLa w odpowiedniej komorze obrazującej z roztworem obrazującym: 107mM NaCl, 7.2mM KCl, 1.2mM MgCl2, 1mM CaCl2, 11.5mM glukozy, 0.1% albuminy surowicy bydlęcej oraz 20mM HEPES 7.2. W naszym laboratorium stosujemy komorę do komórek Attofluor firmy Invitrogen. Zamontuj komorę obrazującą na stoliku mikroskopu odwróconego.</li>
	<li>Znajdź obszar zainteresowania zawierający jedną lub więcej komórek ekspresyjących ratiometryczny pericam, używając obiektywu imersyjnego olejowego 40x (lub większego). Stwierdziliśmy, że ratiometryczny pericam jest mniej odporny na fotoblaknięcie przy 380 nm, dlatego używamy tej długości fali do identyfikacji odpowiednich komórek. Do obrazów przedstawionych na Rysunku 1 użyto obiektywu Nikon Superfluor 40X z aperturą numeryczną 1.3. Odpowiednie byłyby również obiektywy o większym powiększeniu (60-100x). Wykorzystane filtry wzbudzenia to filtry Chroma Technology D380/30x (380 +/- 30 nm) oraz D495/10 (495 +/- 5 nm), dzielnik wiązki to 505DCXR (filtr długoprzepustowy 505nm), a filtr emisyjny to HQ535/50m (535 +/- 25nm). 
	Mikroskop użyty do pozyskania obrazów na Rysunku 1 składa się z mikroskopu odwróconego Nikon TE2000 wyposażonego w chłodzoną kamerę CCD Roper Scientific Coolsnap HQ, szybkie koło i zmieniacz filtrów Ludl MAC6000 oraz oprogramowanie do akwizycji i analizy danych MetaFluor. Protokół ten można dostosować do każdego standardowego mikroskopu szerokopolowego z odpowiednimi filtrami i oprogramowaniem umożliwiającym przechwytywanie i przetwarzanie obrazów ratiometrycznych.</li>
	<li>Skonfiguruj oprogramowanie do podwójnego wzbudzenia przy użyciu filtrów 495 i 380 nm. Wiązanie wapnia przez ratiometryczny pericam zwiększa absorbancję przy 495 nm, zatem stosunek powinien zostać ustawiony jako 495 nm/380 nm. 
	Ratiometryczny pericam posiada szczyt wzbudzenia w warunkach bezwapniowych przy 415 nm4. W tym protokole sugerujemy użycie filtra 380 nm wyłącznie dlatego, że jest on powszechny w większości laboratoriów obrazowania wapnia. Jeśli dostępny jest filtr 410 nm, jest on preferowany nad filtrem 380 nm.</li>
	<li>Pozyskuj obrazy sekwencyjnie, stosując naprzemienne wzbudzanie przy 495 i 380 nm. Rejestruj obrazy bazowego poziomu wapnia przez co najmniej 30 s przed podaniem agonisty via aparat perfuzyjny. Oznacz czas dodania każdego agonisty. Czasy ekspozycji i odstępy między akwizycjami powinny zostać zoptymalizowane, aby zapobiec fotoblaknięciu, zapewniając jednocześnie wystarczającą rozdzielczość czasową. Na przykład w przypadku półszybkiej dynamiki wapnia monitorowanej w odpowiedzi na stymulację agonistą, obrazy na Rysunkach 1B i C były pozyskiwane co dwie sekundy. Możliwe są również znacznie szybsze tempo akwizycji6. Długoterminowe obrazowanie po podaniu staurosporyny było rejestrowane z dłuższym odstępem (30s) między akwizycjami (Rysunki 1 D i E). </li>
</ol>
3. Przetwarzanie i analiza obrazów
<ol>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu uzyskane obrazy można analizować w trybie offline. Należy zdefiniować obszary zainteresowania (ROI), w których chcemy monitorować zmiany poziomu wapnia. W razie potrzeby można użyć ROI wybranego w pustym obszarze pola widzenia w celu odjęcia tła. Należy zauważyć, że mitochondria są dość ruchliwe i dynamiczne, a ekstrapolacja zdarzeń w pojedynczej mitochondriom przez dłuższe okresy nie zawsze jest możliwa. Dlatego, biorąc pod uwagę wysoką ruchliwość tego organellum w niektórych typach komórek, wybór ROI powinien być starannie monitorowany. Co więcej, jak pokazano na Rysunku 1, mitochondria reagują niejednorodnie na różne bodźce. Dlatego ważne jest, aby analizować dane w trybie offline i monitorować rozmieszczenie ROI klatka po klatce. Szczegółowy opis pomiaru wapnia mitochondrialnego w silnie ruchliwych mitochondriach został przedstawiony w innym opracowaniu7.</li>
	<li>Uzyskane pomiary stosunku z obszarów ROI można zaimportować do programu Excel lub podobnego oprogramowania do tworzenia wykresów. Dane można przedstawić jako przebieg obrazujący zmiany poziomu wapnia mitochondrialnego w pojedynczej komórce lub pojedynczej mitochondriom, lub jako uśrednione sygnały fluorescencji z kilku ROI. Technikę tę zastosowaliśmy również do pomiaru średnich poziomów wapnia mitochondrialnego w populacji limfocytów poddawanych apoptozie indukowanej ligandem Fas8.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2579/2579fig1.jpg" alt="Obrazowanie mitochondriów; markery fluorescencyjne; analiza time-lapse; wykres poziomu ATP; badanie komórkowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. (A) Lokalizacja subkomórkowa ratiometric-pericam-mt. Pierwszy obraz przedstawia żywą komórkę HeLa wykazującą ekspresję ratiometric-pericam-mt. Drugi obraz przedstawia barwienie fluorescencyjne z użyciem barwnika selektywnego wobec mitochondriów MitoTracker Red CMXRos. Żółta fluorescencja na obrazie scalonym wykazuje kolokalizację fluorescencji ratiometric-pericam-mt oraz MitoTracker. (B) Seria obrazów w pseudokolorach przedstawiająca stosunek (495:380 nm) w 4 komórkach HeLa wykazujących ekspresję mt-ratiometric pericam po potraktowaniu 10 mM ATP. (C) Ilościowe określenie zmian poziomu wapnia w mitochondriach w obszarze zainteresowania (ROI) wskazanym w (B) po potraktowaniu 10 mM ATP. (D) Seria obrazów w pseudokolorach przedstawiająca stosunek (495:380 nm) w komórce HeLa wykazującej ekspresję mt-ratiometric pericam po potraktowaniu 0,5 μM staurosporyny. Widoczna jest heterogeniczność odpowiedzi wapniowej w poszczególnych mitochondriach, a także znaczna fragmentacja mitochondriów w ciągu 60 minut. Niektóre mitochondria wykazują oscylacyjne wzrosty poziomu wapnia (biała grot strzałki), podczas gdy inne nie wykazują istotnych zmian poziomu wapnia (żółta grot strzałki).(E) Ilościowe określenie wzrostów globalnego poziomu wapnia w mitochondriach w pojedynczej komórce HeLa po indukcji apoptozy 0,5 μM staurosporyną.

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+signalling+and+cell+death%3A+approaches+for+assessing+the+role+of+mitochondrial+Ca2%2B+uptake+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis.</a> Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).</li>
<li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).</li>
<li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2%2B+revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li>
<li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li>
<li>Shimozono, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+of+subcellular+Ca2%2B+concentrations+using+a+dual-excitation+ratiometric+indicator+based+on+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein.</a> Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).</li>
<li>Wozniak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+biphasic+calcium+release+from+the+endoplasmic+reticulum+for+Fas-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis.</a> J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).</li>
<li>Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+binds+to+inositol+%281%2C4%2C5%29+trisphosphate+receptors%2C+amplifying+calcium-dependent+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).</li>
<li>Csordas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li>
<li>Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+intramitochondrial+and+cytosolic+pH%3A+early+events+that+modulate+caspase+activation+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).</li>
<li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiamy bardzo prostą metodę pomiaru wapnia mitochondrialnego przy użyciu ratiometrycznego wskaźnika pericam ukierunkowanego na mitochondria. Jak pokazano na rysunku 1A, przy użyciu standardowej optyki szerokopolowej bez dekonwolucji możliwe jest łatwe zobrazowanie poszczególnych mitochondriów w komórkach HeLa z akceptowalnym stosunkiem sygnału do szumu. Wynika to z faktu, że komórki HeLa, podobnie jak większość komórek w hodowli, znacznie spłaszczają się po przytwierdzeniu, co eliminuje potrzebę stosowania mikroskopii konfokalnej lub innego specjalistycznego sprzętu. Podobne wyniki zaobserwowaliśmy w komórkach Jurkat przytwierdzonych do szkiełek podstawkowych pokrytych poli-lizyną8. W przeciwieństwie do metodologii wykorzystujących barwniki, możliwe jest również nieinwazyjne monitorowanie poziomów wapnia mitochondrialnego przez wiele godzin przy użyciu genetycznie zakodowanych wskaźników wapnia, takich jak ratiometryczny pericam (rysunek 1E). Jest to szczególnie istotne podczas analizy wapnia mitochondrialnego w trakcie śmierci komórki. Co więcej, możliwe jest również wizualizowanie podziału/fragmentacji mitochondriów podczas procesu apoptozy. Jak pokazano na rysunkach 1D i E, traktowanie staurosporyną powoduje powolny wzrost poziomu wapnia w wybranych subpopulacjach mitochondriów, który osiąga szczyt po 20 minutach. Poziomy wapnia ponownie spadają równolegle z fragmentacją mitochondriów, po czym ponownie rosną 2 godziny po traktowaniu. Jest to zgodne z powolnymi falami wapnia cytozolowego indukowanymi przez staurosporynę, zmierzonymi przy użyciu Fura-29. Dzięki temu można uzyskać istotne informacje kinetyczne, co nie jest możliwe przy zastosowaniu metod opartych na pomiarach statycznych. Chociaż na rysunku 1 przedstawiliśmy stosunki, a nie stężenia wapnia, możliwe jest skalibrowanie sensora in situ w celu obliczenia bezwzględnych poziomów wapnia4, 10. Ważnym zastrzeżeniem jest to, że ratiometryczny pericam jest wrażliwy na pH4, 10. Ponieważ zarówno poziom pH w cytozolu, jak i w mitochondriach może gwałtownie zmienić się podczas apoptozy11, jest to istotna kwestia. Miareczkowanie pH w izolowanych mitochondriach wykazujących ekspresję pericamu wykazuje, że zwiększenie [H+] zwiększa emisję pericamu przy wzbudzeniu przy 495 nm, wywierając niewielki wpływ na emisję stymulowaną wzbudzeniem przy 410 nm; właściwość ta została wykorzystana do jednoczesnego pomiaru wapnia mitochondrialnego i pH12. Zatem selektywne monitorowanie emisji przy wzbudzeniu 410 nm umożliwia nieratiometryczne monitorowanie wapnia mitochondrialnego przy zmniejszeniu wpływu pH. Wreszcie, przedstawiony tutaj protokół wymaga jedynie dostępu do standardowego mikroskopu epifluorescencyjnego z powszechnie dostępnymi filtrami, co czyni tę technikę dostępną dla większości laboratoriów.

<table><tbody><tr><td>Odwrócony szerokopolowy fluorescencyjny mikroskop do obrazowania wapnia</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53310</td><td>Do zastosowania w tym protokole można łatwo zaadaptować każdy odwrócony mikroskop szerokopolowy wyposażony w filtry wzbudzenia 380 nm/495 nm oraz odpowiednie filtry długoprzepustowe i emisyjne.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Molecular Devices</td><td>Metafluor</td><td></td></tr><tr><td>Komora komórkowa Attofluor</td><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td>Wystarczy każda komora do obrazowania w mikroskopie odwróconym, która umożliwia perfuzję.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>W tych badaniach odpowiednie byłyby większość odczynników/protokołów do transfekcji.</td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora wapnia

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamiczne zmiany wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w odpowiedzi na różne bodźce regulują wiele procesów komórkowych, takich jak proliferacja, różnicowanie i apoptoza1. Podczas apoptozy akumulacja wapnia w mitochondriach promuje uwalnianie czynników proapoptotycznych z mitochondriów do cytosolu2. W związku z tym interesujące jest bezpośrednie pomiar stężenia wapnia mitochondrialnego w żywych komórkach in situ podczas apoptozy. Wysokorozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne komórek obciążonych podwójnie wzbudzanymi ratiometrycznymi i nieratiometrycznymi syntetycznymi barwnikami wskaźnikowymi wapnia okazało się niezawodnym i wszechstronnym narzędziem do badania różnych aspektów wewnątrzkomórkowego sygnalizowania wapniowego. Pomiar strumieni wapnia cytozolowego za pomocą tych technik jest stosunkowo prosty. Jednak pomiar poziomu wapnia wewnątrz mitochondriów w nienaruszonych komórkach przy użyciu syntetycznych wskaźników wapnia, takich jak rhod-2 i rhod-FF, jest bardziej wymagający. Syntetyczne wskaźniki ukierunkowane na mitochondria wykazują osłabioną odpowiedź na powtarzające się wzrosty stężenia wapnia mitochondrialnego i zaburzają morfologię mitochondriów3. Ponadto syntetyczne wskaźniki mają tendencję do wyciekania z mitochondriów w ciągu kilku godzin, co czyni je nieprzydatnymi do długoterminowych eksperymentów. W związku z tym genetycznie kodowane wskaźniki wapnia oparte na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP)4 lub ekworynie5, ukierunkowane na mitochondria, znacznie ułatwiły pomiar dynamiki wapnia mitochondrialnego. W niniejszej pracy opisujemy prostą metodę pomiaru w czasie rzeczywistym strumieni wapnia mitochondrialnego w odpowiedzi na różne bodźce. Metoda ta opiera się na mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem „ratiometrycznego pericamu”, który jest selektywnie ukierunkowany na mitochondria. Ratiometryczny pericam to wskaźnik wapnia oparty na fuzji cyklicznie permutowanego żółtego białka fluorescencyjnego i kalmoduliny4. Wiązanie wapnia przez ratiometryczny pericam powoduje przesunięcie jego piku wzbudzenia z 415 nm na 494 nm, podczas gdy widmo emisji, z pikiem około 515 nm, pozostaje niezmienione. Ratiometryczny pericam wiąże pojedynczy jon wapnia ze stałą dysocjacji in vitro wynoszącą ~1,7 μM4. Właściwości ratiometrycznego pericamu umożliwiają ilościowe określenie szybkich i długoterminowych zmian w stężeniu wapnia mitochondrialnego. Ponadto opisujemy adaptację tej metodologii do standardowego mikroskopu do obrazowania wapnia w szerokim polu z powszechnie dostępnymi zestawami filtrów. Używając dwóch różnych agonistów, agonisty purynergicznego ATP oraz leku indukującego apoptozę, staurosporyny, wykazujemy, że metoda ta jest odpowiednia do monitorowania zmian stężenia wapnia mitochondrialnego z rozdzielczością czasową od sekund do godzin. Co więcej, wykazujemy również, że ratiometryczny pericam jest użyteczny w pomiarze podziału/fragmentacji mitochondriów podczas apoptozy. Zatem ratiometryczny pericam jest szczególnie odpowiedni do ciągłego, długoterminowego pomiaru dynamiki wapnia mitochondrialnego podczas apoptozy.

Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru przepływów wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta wykorzystuje ratiometryczny sensor wapnia oparty na cyklicznie permutowanej białku YFP z podwójnym wzbudzeniem (ratiometryczny pericam-mt), który jest selektywnie ekspresowany w mitochondriach.

Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora wapnia

Dynamiczne zmiany wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w odpowiedzi na różne bodźce regulują wiele procesów komórkowych, takich jak proliferacja, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie zmian w stężeniu wapnia w mitochondriach żywych komórek. Jest to osiągane poprzez najpierw przeprowadzenie transfekcji komórek ratiometrycznym białkowym wskaźnikiem wapnia peram, który jest kierowany do macierzy mitochondrialnej, a następnie, jeden lub dwa dni po transfekcji, przygotowanie mikroskopu fluorescencyjnego i oprogramowania do obrazowania żywych komórek.Następnie, po dodaniu agonisty mobilizującego wapń, pobierane są obrazy komórek wykazujących ekspresję ratiometrycznego sensora PERAM. Ostatnim krokiem procedury jest analiza ilościowa uzyskanych obrazów. W końcowym etapie możliwe jest uzyskanie wyników ukazujących dynamiczne zmiany stężenia wapnia w mitochondriach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek wykazujących ekspresję ratiometrycznego białka wskaźnikowego wapnia.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pomiar poziomu wapnia przy użyciu syntetycznych wskaźników wapnia, jest fakt, że ratio metric peram jest kodowane genetycznie, a zatem może być kierowane do mitochondriów lub dowolnego innego interesującego nas organellum. Dzień dobry, jestem dr Ascar, postdoc w laboratorium dr. Benninga i dzisiaj zaprezentuję tę procedurę. Aby rozpocząć protokół, poprzedniego wieczora należy wysiać komórki helo na sterylne szkiełka przedmiotowe umieszczone w standardowej płytce hodowlanej z sześcioma dołkami, z gęstością, która zapewni około 70% konfluencji w dniu transfekcji. Następnego dnia przygotować kompleksy DNA Lipofectamine 2000 zgodnie z instrukcjami producenta, używając 4 µg wektora ekspresyjnego mitochondrialnego metric peram oraz 10 µL Lipofectamine 2000 rozpuszczonych w 0,5 mL Opti-MEM dla każdego dołka przeznaczonego do transfekcji.Następnie zastąp pożywkę DMEM-FBS HELOC w każdej studni 1,5 mililitrami tej samej pożywki bez antybiotyków. Dodaj roztwór LIPECTOMY do roztworu DNA i wymieszaj delikatnie po sformowaniu się kompleksów. Dodawaj kroplami roztwór DNA Lipectomy do każdej studni przeznaczonej do transfekcji, mieszając poprzez delikatne kołysanie płytki, a następnie inkubuj przez cztery godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide po zakończeniu inkubacji.Wymień pożywkę na D-M-E-M-F-B-S z dodatkiem antybiotyków. Pozostaw komórki na jeden do dwóch dni w celu ekspresji metric peram przed przeprowadzeniem obrazowania przy użyciu pęsety. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe z komórkami HELOC w odpowiedniej komorze obrazowania z roztworem do obrazowania.Zamocuj komorę obrazującą na stoliku mikroskopu odwróconego. Następnie użyj obiektywu imersyjnego olejowego o powiększeniu 40 x lub większym oraz długości fali 380 nanometrów. Aby zlokalizować obszar zainteresowania zawierający jedną lub więcej komórek wykazujących właściwości ratiometryczne, zastosowano tutaj długość fali 380 nanometrów w celu identyfikacji tych komórek jako ratiometryczne.Peram jest mniej odporny na fotoblaknięcie przy tej długości fali. Po zidentyfikowaniu obszaru zainteresowania, należy skonfigurować oprogramowanie do podwójnej ekscytacji przy 495 i 380 nanometrach. Następnie należy sekwencyjnie pozyskiwać obrazy, naprzemiennie wzbudzając próbkę przy 495 i 380 nanometrach.Należy zarejestrować obrazy bazowego poziomu wapnia przez co najmniej 30 sekund przed podaniem agonisty. Następnie należy podać mobilizujący wapń agonista za pomocą aparatu do perfuzji, odnotowując czas dodania; czas ekspozycji na każdy agonista oraz interwały akwizycji powinny być zoptymalizowane w celu zapobiegania fotowybielaniu, przy jednoczesnym zachowaniu wystarczającej rozdzielczości czasowej. Po zakończeniu eksperymentu obrazy można analizować w trybie offline.Aby rozpocząć analizę, należy wybrać obszar zainteresowania w pustej części pola widzenia w celu odjęcia fluorescencji tła, jeśli jest to konieczne. Następnie należy wyeksportować pomiary stosunku 4 95 3 80 z obszaru zainteresowania do programu Excel lub podobnego oprogramowania graficznego. Ten panel obrazów przedstawia subkomórkową lokalizację ratiometryczną peramu i mitochondriów.Po lewej stronie znajduje się obraz żywych komórek HeLa wykazujących ekspresję ratiometrycznego PERCAM. W środku widoczne jest fluorescencyjne barwienie mitochondriów przy użyciu selektywnego barwnika MitoTracker Red CMXRos. Wreszcie po prawej stronie, przedstawiony tu obraz zsynchronizowany, stanowi serię obrazów stosunku dla długości fal 495 i 380 nm w pseudokolorach czterech komórek HeLa wykazujących ekspresję ratiometrycznego PERCAM w mitochondriach, poddanych działaniu 10 µM ATP, a ilościowe określenie zmian poziomów wapnia w mitochondriach tych czterech poprzednich komórek jest pokazane tutaj na obrazie komórki HeLa wykazującej ekspresję ratiometrycznego PERCAM w mitochondriach.Heterogeniczność odpowiedzi wapniowej w poszczególnych mitochondriach, a także znaczna fragmentacja mitochondriów, są widoczne po 60 minutach traktowania 0,5 µM storsporyny. Niektóre mitochondria wykazują oscylacyjne wzrosty poziomu wapnia, zaznaczone białą strzałką, podczas gdy inne nie wykazują istotnych zmian poziomu wapnia, zaznaczone żółtą strzałką. Wykres ten przedstawia zmianę globalnych poziomów wapnia mitochondrialnego w pojedynczej komórce HeLa po indukcji apoptozy przez 120 minut przy użyciu 0,5 µM storsporyny.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak mierzyć dynamiczne zmiany poziomu wapnia w mitochondriach w odpowiedzi na różne bodźce, wykorzystując białko fluorescencyjne wrażliwe na wapń R geometric peram, które jest selektywnie kierowane do macierzy mitochondrialnej.

monitoring-dynamic-changes-mitochondrial-calcium-levels-during

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Monitorowanie dynamicznych zmian poziomów wapnia w mitochondriach podczas apoptozy za pomocą genetycznie zakodowanych czujników wapnia

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy apoptozy pośredniczonej przez kaspazę-3 w unieśmiertelnionych kulturach komórek oligodendrocytów N19 z wykorzystaniem substratu kaspazy-3 NucView 488. Technika ta znajduje zastosowanie w testach programowanej śmierci komórki w czasie rzeczywistym w różnych typach komórek i tkanek.

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz rozszczepialnych fluorescencyjnych substratów barwiących po indukowanej potasem depolaryzacji błony

Ten film opisuje test oparty na obrazowaniu opartym na mikroskopii konfokalnej, mierzący pobieranie wapnia przez mitochondria w hodowanych komórkach. Test wykorzystuje wrażliwy na wapń barwnik fluorescencyjny Rhod-2/AM do pomiaru mitochondrialnego wapnia w permeabilizowanych komórkach hodowlanych.

Test napływu wapnia w celu pomiaru mitochondrialnego wychwytu wapnia w hodowanych komórkach

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Homeostaza wapniowa retikulum endoplazmatycznego jest zaburzona w różnych patologiach.  Reporter wydzielanego białka monitorującego wapń ER (SERCaMP) może być używany do wykrywania zakłóceń w magazynie wapnia ER.   Protokół ten opisuje zastosowanie Gaussia lucyferazy SERCaMP do badania homeostazy wapnia ER in vitro i in vivo.

Monitorowanie homeostazy wapniowej retikulum endoplazmatycznego za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP

Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (ΔΨm) do sekwestracji wapnia (Ca2+), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca2+ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół ma na celu opisanie metody badania krok po kroku zdolności zatrzymywania Ca2+ i wywołanego przez Ca2+ obrzęku mitochondriów izolowanych mitochondriów komórek SH-SY5Y.

Test zdolności retencyjnej mitochondriów Ca2+ i test obrzęku mitochondriów wywołany Ca2+

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół zastosowania rodaminy 123 do identyfikacji potencjału błony mitochondrialnej (MMP) i badania indukowanej przez CLIC4 apoptozy komórek HN4 in vitro. Pod zwykłym mikroskopem fluorescencyjnym i konfokalnym laserowym skaningowym mikroskopem fluorescencyjnym zarejestrowano zmianę MMP w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie potencjału błony mitochondriów w celu badania apoptozy komórek HN4 indukowanej knockdownem CLIC4 in vitro

Tutaj prezentujemy dwa protokoły pomiaru napływu mitochondrialnego Ca2+ w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. W przypadku izolowanych mitochondriów szczegółowo opisujemy test importu Ca2 + oparty na czytniku płytek przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + zieleni wapniowej-5N. W przypadku hodowanych komórek opisujemy metodę mikroskopii konfokalnej z użyciem barwnika Ca2+ Rhod-2/AM.

Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

Ten proctocol ma na celu dostarczenie metody obrazowania in vitro i in vivo mitochondrialnego Ca2+ w astrocytach i neuronach.

Obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca2+ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI)

Ten protokół opisuje podejście do wykonywania obrazowania wapnia w zakażonych wirusem ludzkich organoidach jelitowych i oferuje podejście do analizy.

Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Poznaj metodę pomiaru dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach żywych komórek za pomocą genetycznie kodowanego wskaźnika ratiometric pericam-mt. Technika ta umożliwia badanie funkcji mitochondrialnych w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy za pomocą genetycznie kodowanego czujnika wapnia (Wideo) | JoVE Journal

Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora wapnia

Przeglądaj więcej filmów