Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora wapnia

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie zmian w stężeniu wapnia w mitochondriach żywych komórek. Jest to osiągane poprzez najpierw przeprowadzenie transfekcji komórek ratiometrycznym białkowym wskaźnikiem wapnia peram, który jest kierowany do macierzy mitochondrialnej, a następnie, jeden lub dwa dni po transfekcji, przygotowanie mikroskopu fluorescencyjnego i oprogramowania do obrazowania żywych komórek.

Następnie, po dodaniu agonisty mobilizującego wapń, pobierane są obrazy komórek wykazujących ekspresję ratiometrycznego sensora PERAM. Ostatnim krokiem procedury jest analiza ilościowa uzyskanych obrazów. W końcowym etapie możliwe jest uzyskanie wyników ukazujących dynamiczne zmiany stężenia wapnia w mitochondriach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek wykazujących ekspresję ratiometrycznego białka wskaźnikowego wapnia.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pomiar poziomu wapnia przy użyciu syntetycznych wskaźników wapnia, jest fakt, że ratio metric peram jest kodowane genetycznie, a zatem może być kierowane do mitochondriów lub dowolnego innego interesującego nas organellum. Dzień dobry, jestem dr Ascar, postdoc w laboratorium dr. Benninga i dzisiaj zaprezentuję tę procedurę. Aby rozpocząć protokół, poprzedniego wieczora należy wysiać komórki helo na sterylne szkiełka przedmiotowe umieszczone w standardowej płytce hodowlanej z sześcioma dołkami, z gęstością, która zapewni około 70% konfluencji w dniu transfekcji. Następnego dnia przygotować kompleksy DNA Lipofectamine 2000 zgodnie z instrukcjami producenta, używając 4 µg wektora ekspresyjnego mitochondrialnego metric peram oraz 10 µL Lipofectamine 2000 rozpuszczonych w 0,5 mL Opti-MEM dla każdego dołka przeznaczonego do transfekcji.

Następnie zastąp pożywkę DMEM-FBS HELOC w każdej studni 1,5 mililitrami tej samej pożywki bez antybiotyków. Dodaj roztwór LIPECTOMY do roztworu DNA i wymieszaj delikatnie po sformowaniu się kompleksów. Dodawaj kroplami roztwór DNA Lipectomy do każdej studni przeznaczonej do transfekcji, mieszając poprzez delikatne kołysanie płytki, a następnie inkubuj przez cztery godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide po zakończeniu inkubacji.

Wymień pożywkę na D-M-E-M-F-B-S z dodatkiem antybiotyków. Pozostaw komórki na jeden do dwóch dni w celu ekspresji metric peram przed przeprowadzeniem obrazowania przy użyciu pęsety. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe z komórkami HELOC w odpowiedniej komorze obrazowania z roztworem do obrazowania.

Zamocuj komorę obrazującą na stoliku mikroskopu odwróconego. Następnie użyj obiektywu imersyjnego olejowego o powiększeniu 40 x lub większym oraz długości fali 380 nanometrów. Aby zlokalizować obszar zainteresowania zawierający jedną lub więcej komórek wykazujących właściwości ratiometryczne, zastosowano tutaj długość fali 380 nanometrów w celu identyfikacji tych komórek jako ratiometryczne.

Peram jest mniej odporny na fotoblaknięcie przy tej długości fali. Po zidentyfikowaniu obszaru zainteresowania, należy skonfigurować oprogramowanie do podwójnej ekscytacji przy 495 i 380 nanometrach. Następnie należy sekwencyjnie pozyskiwać obrazy, naprzemiennie wzbudzając próbkę przy 495 i 380 nanometrach.

Należy zarejestrować obrazy bazowego poziomu wapnia przez co najmniej 30 sekund przed podaniem agonisty. Następnie należy podać mobilizujący wapń agonista za pomocą aparatu do perfuzji, odnotowując czas dodania; czas ekspozycji na każdy agonista oraz interwały akwizycji powinny być zoptymalizowane w celu zapobiegania fotowybielaniu, przy jednoczesnym zachowaniu wystarczającej rozdzielczości czasowej. Po zakończeniu eksperymentu obrazy można analizować w trybie offline.

Aby rozpocząć analizę, należy wybrać obszar zainteresowania w pustej części pola widzenia w celu odjęcia fluorescencji tła, jeśli jest to konieczne. Następnie należy wyeksportować pomiary stosunku 4 95 3 80 z obszaru zainteresowania do programu Excel lub podobnego oprogramowania graficznego. Ten panel obrazów przedstawia subkomórkową lokalizację ratiometryczną peramu i mitochondriów.

Po lewej stronie znajduje się obraz żywych komórek HeLa wykazujących ekspresję ratiometrycznego PERCAM. W środku widoczne jest fluorescencyjne barwienie mitochondriów przy użyciu selektywnego barwnika MitoTracker Red CMXRos. Wreszcie po prawej stronie, przedstawiony tu obraz zsynchronizowany, stanowi serię obrazów stosunku dla długości fal 495 i 380 nm w pseudokolorach czterech komórek HeLa wykazujących ekspresję ratiometrycznego PERCAM w mitochondriach, poddanych działaniu 10 µM ATP, a ilościowe określenie zmian poziomów wapnia w mitochondriach tych czterech poprzednich komórek jest pokazane tutaj na obrazie komórki HeLa wykazującej ekspresję ratiometrycznego PERCAM w mitochondriach.

Heterogeniczność odpowiedzi wapniowej w poszczególnych mitochondriach, a także znaczna fragmentacja mitochondriów, są widoczne po 60 minutach traktowania 0,5 µM storsporyny. Niektóre mitochondria wykazują oscylacyjne wzrosty poziomu wapnia, zaznaczone białą strzałką, podczas gdy inne nie wykazują istotnych zmian poziomu wapnia, zaznaczone żółtą strzałką. Wykres ten przedstawia zmianę globalnych poziomów wapnia mitochondrialnego w pojedynczej komórce HeLa po indukcji apoptozy przez 120 minut przy użyciu 0,5 µM storsporyny.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak mierzyć dynamiczne zmiany poziomu wapnia w mitochondriach w odpowiedzi na różne bodźce, wykorzystując białko fluorescencyjne wrażliwe na wapń R geometric peram, które jest selektywnie kierowane do macierzy mitochondrialnej.