Wykrywanie modyfikacji potranslacyjnych na natywnych nienaruszonych nukleosomach za pomocą testu ELISA

Ogólnym celem tej procedury jest dokładne określenie względnych poziomów modyfikacji potranslacyjnych w preparatach całkowitych nukleosomów komórkowych uzyskanych z miliona komórek. Osiąga się to poprzez przygotowanie wysokiej jakości jednorodnych kultur komórek ssaków. Następnie jądra są izolowane z komórek poprzez mechaniczne rozrywanie za pomocą, homogenizatora i wirowania.

Kolejnym krokiem jest uzyskanie nienaruszonych nukleosomów poprzez trawienie chromatyny obecnej w jądrach i wykonanie serii ekstrakcji hipotonicznych. Na koniec nukleosomy są badane za pomocą testu ELIZA z odpowiednimi kontrolami w celu zidentyfikowania określonych modyfikacji potranslacyjnych. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują względne poziomy określonych modyfikacji obecnych w próbkach nukleosomów.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak western blotting i immunoprecypitacja chromatyny, jest to, że można łatwo określić globalny obraz wielu stanów modyfikacji nukleosomów. Metoda ta jest znacznie bardziej czuła i dokładna niż western blotting i może być wykonywana w większości laboratoriów wyposażonych do ogólnych eksperymentów z zakresu biologii molekularnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komórek macierzystych i epigenetyki, takie jak to, co się dzieje, gdy dochodzi do poważnych zdarzeń różnicowania i przeprogramowywania.

Aby rozpocząć procedurę, najpierw spróbuj anyżować komórki trzema mililitrami trypsyny na 15-centymetrową płytkę, aby świeżo tryps zainwestyzował komórki. Dodaj 20 mililitrów lodowatego maślanu PBS. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwiruj probówkę, aby zebrać komórki z prędkością 1000 obr./min przez pięć minut, odessać supernatant i dodać 10 mililitrów lodowatego maślanu PBS do płukania ponownie odwirować zawiesinę komórek przy 1000 obr./min przez pięć minut.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w czterech mililitrach buforu do lizy z inhibitorami proteazy, jak opisano w pisemnym protokole. Następnie pipetować komórki do homogenizatora typu B typu B na homogenizacji lodu w dół za pomocą 20 pociągnięć. Następnie przenieść homogenat do probówki wirówkowej na lodzie.

Odwirować próbkę o sile 2000 G przez 10 minut. W czterech stopniach Celsjusza. Usuń super nazwany, który zawiera materiał cytoplazmatyczny i resus.

Zawieś osad w dwóch mililitrach lodowatego buforu do mycia na zimno C Za pomocą inhibitorów proteazy delikatnie ułóż zawieszony materiał na pięciomililitrowej, 30% poduszce sacharozy w zimnej probówce wirówkowej. Aby wyizolować jądra wirowe pod ciśnieniem 2,400 G przez pięć minut w wahadłowym wiadrze, jądra wirnika będą migrować przez poduszkę, a szczątki komórkowe pozostaną na granicy faz. Po odwirowaniu ostrożnie usuń całą objętość płynu i ponownie zawiesić jądra w 250 mikrolitrach lodowatego buforu C do płukania z inhibitorami proteazy, przenieś jądra do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.

Aby rozpocząć izolację nukleosomów, dodaj trzy mikrolitry 0,1 molowego chlorku wapnia do jąder i umieść w bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż temperatura się zrównoważy. Następnie dodaj dwie jednostki nukleazy mikro kokowej do 10 mikrolitrów nukleazy mikro kokowej, buforuj i inkubuj przez 12 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Często mieszaj końcówką do pipety.

Po inkubacji zatrzymać reakcję sześcioma mikrolitrami 0,5 molowego sodu E-D-T-A-P-H osiem i umieścić na lodzie do ostygnięcia. Następnie odwirować próbkę o sile 2000 G przez cztery minuty po odwirowaniu, wyrzucić snat i ponownie zawiesić osad. W 300 mikrolitrach 0,2 milimola lub EDTA sodu inkubować próbkę na lodzie przez jedną godzinę, od czasu do czasu delikatnie pipetując w celu wymieszania.

Po odwirowaniu w stężeniu 3000 G przez cztery minuty. W temperaturze czterech stopni Celsjusza zebrać supernatant, który zawiera wolne nukleosomy w nowej probówce Fuge i przechowywać na lodzie celowo dodatkowe nukleosomy reus. Zawiesić osad w 300 mikrolitrach 0,2 milimola lub sodu EDT jak poprzednio i inkubować na lodzie przez godzinę, od czasu do czasu delikatnie mieszając.

Po inkubacji odwirować próbkę. Ponownie połącz powstały snat z pozostałą próbką w probówce z mikrofuge na lodzie. Aby rozpocząć test nukleosomów Eliza, załaduj 96-dołkową płytkę Eliza z malejącą serią pięciu dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń nukleosomów i buforu powlekającego, zaczynając od 0,1 mikrograma na 50 mikrolitrów w górnej studzience, wszystkie serie rozcieńczeń należy załadować w trzech egzemplarzach.

Należy pamiętać, aby studzienki z buforem powlekającym służyć tylko jako kontrole. Następnego dnia inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj myjki do talerzy, aby umyć płytki 200 mikrolitrami na studzienkę 0,5% między 20 w PBS w temperaturze pokojowej cztery razy, łącznie przez 10 minut.

Teraz dodaj 100 mikrolitrów roztworu blokującego na studzienkę i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze. Po inkubacji usunąć bufor blokujący, energicznie potrząsając odwróconą płytką nad zlewem. Następnie dodać rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe w objętości 50 mikrolitrów na studzienkę w roztworze 5% PSA w 0,05% między 20 w PBS, inkubować roztwór przez godzinę na rotatorze w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji przeciwciał pierwotnych umyć płytki tak jak przed użyciem myjki do płytek. Po zakończeniu procedury mycia dodać 50 mikrolitrów na studzienkę sprzężonego z peroksydazą chrzanową przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w PBS z 5% BS, A i 0,5% 20 inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę na rotatorze po inkubacji przeciwciał wtórnych. Umyj talerze jak poprzednio.

Za pomocą podkładki do płyt do wywołania płyty. Dodaj 50 mikrolitrów substratu TMB Eliza do każdej studzienki i inkubuj przez 10 minut. W temperaturze pokojowej studzienki płytki ELIZA zmienią kolor na niebieski, a intensywność jest proporcjonalna do ilości modyfikacji nukleosomów obecnych w każdym z nich.

Cóż, wtedy zatrzymaj reakcję. Dodając 50 mikrolitrów do studzienki dwóch normalnych kwasów siarkowych. Kolor zmieni się na brązowy, odwiruj płytkę z prędkością 1500 obr./min przez dwie minuty, aby rozproszyć wszelkie pęcherzyki powietrza.

Płytka jest teraz gotowa do kwantyfikacji na kolorowym czytniku płytek metrycznych. Na koniec odczytaj płytkę w 450 nanometrach i wyeksportuj wyniki do analizy. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo po jej opracowaniu.

Technika ta otworzyła drzwi naukowcom zajmującym się badaniami nad komórkami macierzystymi do zbadania reakcji epigenetycznych na zdarzenia różnicowania i przeprogramowania na poziomie całego epiproteomu.