Name: Wykrywanie modyfikacji potranslacyjnych na natywnych nienaruszonych nukleosomach za pomocą testu ELISA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj metodę NU-ELISA do wykrywania modyfikacji potranslacyjnych na natywnych nukleosomach. Ta technika pozwala ocenić globalne stany modyfikacji chromatyny w różnych typach komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opracowanie metody NU-ELISA zostało sfinansowane z grantu NIH RO1AG023687.

1. Kultura komórek ssaków 
Metodę NU-ELISA można przeprowadzić na dowolnym typie komórek ssaków, które można hodować in vitro. Zalecamy przygotowanie średnich lub dużych partii komórek, aby można było wyizolować nukleosomy w ilości wystarczającej do przygotowania kilku identycznie obciążonych płytek ELISA, co umożliwia przeprowadzenie analiz z użyciem kilku różnych przeciwciał (Abs). Poniższe skale hodowli zapewniają wystarczającą ilość materiału:
W przypadku embrionalnych komórek macierzystych myszy, należy hodować jedną lub dwie płytki 15 cm z komórkami bez komórek karmicieli.
W przypadku fibroblastów, należy hodować od 5 do 10 płytek 15 cm do osiągnięcia konfluencji.
2. Izolacja jąder komórkowych
Uwaga: Wszystkie etapy są wykonywane w lodzie z użyciem schłodzonych buforów, chyba że wskazano inaczej.
<ol>
	<li>Poddać komórki trypsynizacji, używając 3 ml trypsyny na płytkę, połączyć materiał i dodać 20 ml lodowatego PBS/maślanu. Wirować przy 1000 rpm przez 5 min.</li>
 <li>Resuspender komórki w 10 ml PBS/maślanu i wirować przy 1000 rpm przez 5 min.</li>
 <li>Resuspender w 4 ml buforu lizującego z inhibitorami proteaz (Sigma-Aldrich P-8340). Homogenizować w homogenizatorze Dounce, wykonując 20 ruchów tłuczkiem typu B w lodzie.</li>
 <li>Wirować przy 2000g przez 10 min w temperaturze 4°C. (Nadpływ zawiera cytoplazmę, która nie jest potrzebna do tego protokołu, ale można ją zachować do innych zastosowań, jeśli jest to pożądane).</li>
 <li>Resuspender osad w 2 ml lodowatego buforu do przemywania C (z inhibitorami proteaz).</li>
 <li>Nanieść resuspenderowany materiał na warstwę 5 ml 30% poduszki sacharozowej, a następnie wirować przy 2400g przez 5 min w rotorze z koszyczkami wahadłowymi. Jądra komórkowe przejdą przez poduszkę, a zanieczyszczenia pozostaną na granicy faz.</li>
 <li>Ostrożnie usunąć całą objętość cieczy i resuspender jądra w 250 μl lodowatego buforu do przemywania C + inhibitorów proteaz.</li>
</ol>
3. Izolacja nukleosomów poprzez trawienie nukleazą mikrok Kokową (MNase) in situ
Stosujemy procedurę, w której chromatyna jest trawiona in situ w obrębie jąder komórkowych poprzez inkubację z MNase, a następnie poddawana traktowaniu w roztworze hipotonicznym w celu uwolnienia nienaruszonych nukleosomów do nadsączu.
<ol>
	<li>Dodaj 3 μl 0,1 M CaCl22 do próbki. Włożyć 37°C blok grzejny. Pozostawić do wyrównania temperatury 37°C temperatura</li>
 <li>Dodaj 2 jednostki MNazy (nukleazy mikrokokalnej, Sigma-Aldrich, rozpuszczonej w stężeniu 2 jednostek/10μl w buforze MNase), a następnie inkubować przez 37°C przez 12 min, często mieszając za pomocą końcówki do pipety.</li>
 <li>Dodaj 6 μl 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0 w celu zatrzymania reakcji. Umieścić w lodzie.</li>
 <li>Wiruj z prędkością 2000 g przez 4 min, a następnie odlej nadsącz. Resuspenduj osad w 300 μl 0,2 mM Na-EDTA. Przechowywać w lodzie przez 1 h, sporadycznie delikatnie pipetując. (Te warunki hipotoniczne uwalniają wolne nukleosomy z jąder komórkowych).</li>
 <li>Wiruj w wirowarce przy 3000 g przez 4 min w temperaturze 4°CPrzechowuj supernatant zawierający wolne nukleosomy w lodzie. </li>
 <li>Ponownie zawiesić osad w 300 μl 0,2 mM Na-EDTA. Przechowywać w lodzie przez 1 h, wykonując sporadycznie delikatne pipetowanie.</li>
 <li>Wirować przy 3000 g przez 4 min w temperaturze 4°CZachować nadsącz i połączyć go z pierwszym nadsączem z kroku 5. Otrzymane preparaty mononukleosomów można podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -80°C. </li> 
</ol>
Uwaga: Ilość chromatyny można w przybliżeniu określić ilościowo, mierząc absorbancję przy 260 nm próbki o objętości 10 μl dodanej do 990 μl wody. Wartość A260=10 (po uwzględnieniu rozcieńczenia 1/100) odpowiada około 1mg/ml chromatyny. Ponadto, podczas powyższej procedury można zachować niewielkie próbki i przeanalizować je później pod kątem zawartości DNA, aby monitorować jakość i zakres trawienia przez MNazę, która powinna przynieść głównie fragmenty DNA o długości 146 bp. Wystąpienie drabinki świadczy o niepełnym trawieniu przez MNazę.
Uwaga: Ryc. 1 zawiera schematyczne podsumowanie etapów izolacji jąder oraz trawienia MNase.
4. NU-ELISA (ELISA nukleosomów)
Wykrywamy Modyfikacje Potranslacyjne (PTM) w frakcjach zawierających natywne, nienaruszone nukleosomy, które zostały unieruchomione na 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych do testów ELISA. Dla każdej próbki przygotowujemy serię rozcieńczeń dwukrotnych, a następnie nanosimy je na dołki w trzech powtórzeniach.
<ol>
	<li>Płytki MaxiSorp należy pokryć przez noc w temperaturze 4°C, dodając 50 μl/dołek nukleosomów rozcieńczonych w buforze do pokrywania. Sugerowane dwukrotne rozcieńczenia szeregowe nukleosomów przygotowuje się od górnego do dolnego rzędu, dodając kolejno 0,1 μg, 0,05 μg, 0,025 μg, 0,0125 μg, 0,00625 μg, 0,00313 μg, 0,00156 μg, przy czym w dolnym rzędzie znajduje się sam bufor do pokrywania (0 μg chromatyny). (Uwaga: na tym etapie wymagane są przykrywki do płytek).</li>
 <li>Rano płytki należy przemyć 4 razy, używając 200 μl/dołek PBS/0,5% Tween-20 w temperaturze pokojowej (RT) przez łącznie 10 min za pomocą myjki do płytek.</li>
 <li>Blokowanie przeprowadza się przez 1 h w RT, stosując 100 μl/dołek PBS/0,05% Tween-20/5% BSA.</li>
 <li>Bufor blokujący należy usunąć, energicznie wstrząsając odwróconą płytką nad zlewem. Płytki należy przykryć i przechowywać w temperaturze -20°C lub przejść bezpośrednio do następnego kroku.</li>
 <li>Należy dodać przeciwciała pierwszorzędowe (1° Abs) w objętości 50 μl/dołek, rozcieńczone 1:1000 (lub według potrzeb) w PBS/0,05% Tween-20/5% BSA i inkubować w RT przez 1 godzinę na rotatorze.</li>
 <li>Płytki należy przemyć 4 razy, używając 200 μl/dołek PBS/0,5% Tween-20 w RT przez łącznie 10 min w myjce do płytek.</li>
 <li>Należy dodać przeciwciała drugorzędowe (2° Abs) sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP), rozcieńczone 1:5000 (lub według potrzeb) w PBS/0,05% Tween-20/5% BSA; inkubować w RT przez godzinę na rotatorze.</li>
 <li>Płytki należy przemyć 4 razy, używając 200 μl/dołek PBS/0,5% Tween-20. Każde przemywanie odbywa się w RT przez łącznie 10 minut za pomocą myjki do płytek.</li>
 <li>Utlenianie płyt przeprowadza się poprzez dodanie 50 μl substratu TMB do każdego dołka na 10 min w RT. Reakcję należy zatrzymać, dodając 50 μl/dołek 2N H2SO4, a następnie odczytać wartości z płytek przy 450 nm. (Wskazówka: przed odczytem absorbancji należy wirować płytki przy 1500 rpm przez 2 min za pomocą rotora do płytek, aby usunąć pęcherzyki powietrza z dołków).</li>
 <li>Odczyty należy wyeksportować do arkuszy kalkulacyjnych w celu przeprowadzenia analiz ilościowych i statystycznych.</li> 
</ol>
Odczynniki
<table border="1">
 <tbody>	
 	<tr>
 	<td>PBS/maślan</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>135 mM NaCl</td>
 </tr>

	<tr>
 	<td>2,5 mM KCl</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>8 mM Na2HPO4</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>1,5 mM KH2PO4</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>10 mM butyranu sodu</td>
 </tr> 
 </tbody>
</table>
<table border="1">
	<tbody>
 	<tr>
 	<td>Bufor lizujący</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>250 mM sacharozy</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>10 mM Tris-HCl, pH 7,4</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>10 mM maślanu sodu</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>4 mM MgCl22</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>0,1% Triton X-100</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>


<table border="1">
	<tbody>
 	<tr>
 	<td>Bufor płukący C</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>250 mM sacharozy</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>10 mM Tris-HCl, pH 7,4</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>10 mM butyranu sodu</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>4 mM MgCl22</td>
 </tr>
 
 </tbody>
</table>
<table border="1">
	<tbody>
 	<tr>
 	<td>Poduszka sacharozowa</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>30% (m/v) sacharozy w buforze płuczącym C</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 	<td>Bufor do nukleazy mikrokokowej</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>5 mM NaPO44 Bufor, pH 7,0 </td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>0,025 mM CaCl22</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
	<tbody>

 <tr>
 	<td>Bufor do powlekania </td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>80 ml roztworu A + 170 ml roztworu B + 250 ml dH2O2O</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Roztwór A: 0,2 M Na2Tlenek węgla3 </td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Roztwór B: 0,2 M NaHCO33</td>
 </tr>
 </tbody>
</table> 
5. Reprezentatywne wyniki
Zastosowanie metody NU-ELISA wymaga przygotowania serii kilku identycznych płytek, na które nanosi się chromatynę w formie mononukleosomów. Zazwyczaj przygotowujemy serie identycznie obciążonych płytek, aby każdą z nich można było inkubować z innym przeciwciałem (Ab) specyficznym dla różnych modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM). Zawsze przygotowujemy również płytkę do inkubacji z przeciwciałem wykrywającym histony niezależnie od stanu ich modyfikacji, co służy jako kontrola całkowitego obciążenia chromatyną. Kontrola ta jest niezbędna do późniejszego ilościowego porównania zawartości PTM w nukleosomach przygotowanych z różnych próbek. Aby określić poziom PTM w danej próbce chromatyny, korygujemy surowe wartości absorbancji w następujący sposób: najpierw odejmujemy sygnał tła, korzystając z wartości uzyskanych z dołków kontrolnych niezawierających chromatyny (tło jest zazwyczaj pomijalne). Następnie standaryzujemy sygnały specyficzne dla PTM względem wyników NU-ELISA uzyskanych z identycznie obciążonej płytki, której analizę przeprowadzono z użyciem przeciwciała wykrywającego nukleosomy niezależnie od stanu ich modyfikacji. (W tym celu stosowaliśmy poliklonalne przeciwciała specyficzne dla histonów H2A lub H2B). Następnie wyznaczamy średnie i wariancje dla każdego rozcieńczenia chromatyny i wykorzystujemy dane uzyskane z linearnej części testu ELISA. Szczegółowe przykłady analiz matematycznych i statystycznych NU-ELISA zostały opisane we wcześniejszych publikacjach4 
<img src="/files/ftp_upload/2593/2593fig1.jpg" alt="Schemat procesu izolacji jąder: przedstawia trawienie MNazą, ekstrakcję hipotoniczną i zatrzymanie osadu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat etapów metody NU-ELISA. A. Zbiór komórek ssaków; B. Oddzielenie jąder od komórek poprzez homogenizację w homogenizatorze Dounce'a, C. Naniesienie rozbitych komórek na poduszkę z 30% w/v sacharozy, D. Po wirowaniu jądra osadzają się w osadzie; E, F. Chromatyna jest trawiona in situ przez MNazę głównie do mononukleosomów; G, H, I. Rozpuszczalne mononukleosomy są ekstrahowane poprzez traktowanie roztworem hipotonicznym i wielokrotne wirowanie pozostałego materiału jądrowego. J. Mononukleosomy z różnych próbek (oznaczone w tym przypadku jako samp. 1 i 2) są unieruchamiane w dołkach mikropłytek w serii identycznie obciążonych płytek, a następnie analizowane za pomocą przeciwciał specyficznych dla PTM oraz przeciwciał niezależnych od PTM w celu określenia całkowitej ilości naniesionej chromatyny. K. Przedstawienie różnic w poziomach detekcji sygnału w dwóch próbkach, które różnią się zawartością PTM, ale mają podobną całkowitą zawartość chromatyny, ocenianą na podstawie immunoreaktywności anty-H2B.

<ol><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+and+an+epigenetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation and an epigenetic code.</a> Bioessays. 22, 836-845 (2000).</li>
<li>Dai, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epiproteomic+signatures+distinguish+embryonic+stem+cells+from+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells.</a> Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).</li>
<li>Tanasijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+accumulation+of+epigen+etic+heterogeneity+during+human+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture.</a> Epigenetics. 4, 330-338 (2009).</li>
<li>Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThomas%2C+JO+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).</li>
<li>Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThorne%2C+AW+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Metoda NU-ELISA umożliwia określenie ogólnego stanu PTM nukleosomów występujących w konkretnym typie komórek. Badania z wykorzystaniem NU-ELISA wykazały, że globalne stany modyfikacji nukleosomów różnią się w zależności od analizowanych typów komórek 4. Ponadto profile PTM w NU-ELISA ulegają zmianie, gdy komórki są poddane działaniu czynników modyfikujących epigenetycznie, takich jak trichostatyna-A, lub gdy dochodzi do różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy 4. Metodę tę z powodzeniem zastosowano również do badania chromatyny ludzkich komórek ES5. Należy zauważyć, że NU-ELISA w obecnej formie pozwala na wykrycie jedynie zbiorczej sygnatury PTM obecnych w całkowitej sumie epigenomu komórkowego. Różni się to znacząco od genomowej immunoprecypitacji chromatyny, która pozwala określić rozkład konkretnego PTM w określonych loci genetycznych. 

Pierwsze etapy procedur NU-ELISA zostały zaadaptowane z wcześniejszych metod izolacji mononukleosomów z jąder komórek ssaków6,7. Zaadaptowane metody te stanowią szybki sposób na uzyskanie wysokiej jakości nienaruszonych mononukleosomów z komórek ssaków, a otrzymane frakcje są kompleksowe pod względem zawartości chromatyny, lecz zawierają znaczną ilość dodatkowego materiału jądrowego. Ponieważ stosowane są specyficzne przeciwciała, zanieczyszczenia materiałem nienukleosomowym są dobrze tolerowane w teście NU-ELISA, w przeciwieństwie do metod spektrometrii mas, które wymagają większej czystości. Jednakże NU-ELISA jest bardziej czuła i ilościowa niż western blotting 4, stanowiąc tym samym dobrą alternatywę dla metod western blot i spektrometrii mas w detekcji nukleosomowych PTM.

<table><tbody><tr><td>Nukleaza mikrokokkowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td>Przygotować alikwoty o stężeniu 2 U/10&amp;#x03BC;l buforu, przechowywane w -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Płytki mikrotitracyjne Nunc MaxiSorp</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-135</td><td>Przylepne pokrywy do płytek można również zamówić w firmie Fisher</td></tr><tr><td>Automatyczna myjka do płytek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-stopniowy substrat TMB-ELISA</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34028</td><td>Przechowywać w 4&amp;#x00B0;C, przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej lub zgodnie z instrukcją na karcie specyfikacji</td></tr><tr><td>Czytnik płytek mikrotitracyjnych</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Odpowiednie są większość modeli kolorymetrycznych czytników płytek</td></tr></tbody></table>

wykrywanie modyfikacji potranslacyjnych w natywnych, nienaruszonych nukleosomach metodą elisa

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Genom eukariotów występuje w postaci chromatyny, która zawiera zarówno DNA, jak i białka. Podstawową jednostką chromatyny jest nukleosom, składający się ze 146 par zasad DNA związanych z dwiema kopiami każdych z histonów H2A, H2B, H3 oraz H41. Końce N-terminalne histonów są bogate w lizynę i argininę i ulegają modyfikacjom potranskrypcyjnym poprzez acetylację, metylację oraz inne modyfikacje potranslacyjne (PTMs). Konfiguracja PTM nukleosomów może wpływać na aktywność transkrypcyjną powiązanego z nimi DNA, zapewniając tym samym mechanizm regulacji genów o charakterze epigenetycznym 2,3. Opracowaliśmy metodę zwaną NU-ELISA (nucleosome ELISA), służącą do ilościowego oznaczania globalnych sygnatur PTM nukleosomów wyekstrahowanych z komórek. Metoda NU-ELISA jest bardziej czuła i ilościowa niż western blotting i jest użyteczna do badania stanu epiproteomicznego konkretnych typów komórek. Niniejszy artykuł w formie wideo przedstawia szczegółowe procedury przeprowadzania analizy NU-ELISA.

Test NU-ELISA (Nucleosome ELISA) jest czułą i ilościową metodą wykrywania ogólnych wzorców modyfikacji potranslacyjnych w preparatach natywnych, nienaruszonych nukleosomów. Modyfikacje te obejmują metylacje, acetylacje i fosforylacje w konkretnych resztach aminokwasowych histonów, dzięki czemu NU-ELISA stanowi globalny test proteomiczny ogólnego stanu modyfikacji chromatyny w określonych typach komórek.

Wykrywanie modyfikacji potranslacyjnych w natywnych, nienaruszonych nukleosomach metodą ELISA

Genom eukariotów występuje w postaci chromatyny, która zawiera zarówno DNA, jak i białka. Podstawową jednostką chromatyny jest nukleosom, który zawiera 146...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest dokładne określenie względnych poziomów modyfikacji potranslacyjnych w preparatach całkowitych nukleosomów komórkowych otrzymanych z miliona komórek. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie wysokiej jakości jednorodnych kultur komórek ssaków. Następnie jądra są izolowane z komórek poprzez rozbicie mechaniczne za pomocą homogenizatora Dounce'a i wirowanie.Kolejnym krokiem jest uzyskanie nienaruszonych nukleosomów poprzez trawienie chromatyny obecnej w jądrach oraz przeprowadzenie serii ekstrakcji w roztworze hipotonicznym. Na koniec nukleosomy poddaje się analizie przy użyciu testu ELISA z odpowiednimi kontrolami w celu zidentyfikowania specyficznych modyfikacji potranslacyjnych. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące względne poziomy konkretnych modyfikacji występujących w próbkach nukleosomów.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak western blotting i immunoprecypitacja chromatyny, jest możliwość łatwego uzyskania globalnego obrazu wielu stanów modyfikacji nukleosomów. Metoda ta jest znacznie bardziej czuła i dokładna niż western blotting i może być wykonywana w większości laboratoriów wyposażonych do ogólnych eksperymentów z zakresu biologii molekularnej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny komórek macierzystych i epigenetyki, na przykład dotyczące tego, co dzieje się podczas głównych zdarzeń różnicowania i przeprogramowania.Aby rozpocząć procedurę, najpierw poddaj komórki trypsynizacji, stosując 3 ml trypsyny na płytkę 15 cm, aby uzyskać świeżo zdetacherowane komórki. Dodaj 20 ml lodowatego PBS z maślanem. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwiruj w celu zebrania komórek przy 1000 RPM przez 5 minut, odessaj nadsącz i dodaj 10 ml lodowatego PBS z maślanem w celu przemycia, a następnie ponownie odwiruj zawiesinę komórkową przy 1000 RPM przez 5 minut.Usunąć supernatant i resuspender pellet komórkowy w czterech mililitrach buforu do lizy z inhibitorami proteaz, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie przenieść komórki pipetą do homogenizatora z tłokiem typu B i przeprowadzić homogenizację na lodzie, wykonując 20 pociągnięć. Następnie przenieść homogenat do probówki wirówkowej na lód.Wiruj próbkę przy 2000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń nadfiltr zawierający materiał cytoplazmatyczny i zawiesinę.Osad zawiesić w 2 ml lodowatego buforu piorącego C z inhibitorami proteaz, a następnie ostrożnie nałożyć zawiesinę na poduszkę z 30% sacharozy o objętości 5 ml w zimnej probówce do wirówki. W celu izolacji jąder komórkowych odwirować przy 2 400 G przez 5 minut w rotorze z ruchomymi koszyczkami; jądra komórkowe przemieszczą się przez poduszkę, a szczątki komórkowe pozostaną na granicy faz. Po wirowaniu ostrożnie usunąć całą objętość cieczy i ponownie zawiesić jądra w 250 µL lodowatego buforu piorącego C z inhibitorami proteaz, a następnie przenieść jądra do probówki do mikrowirówki o objętości 1,5 ml.Aby rozpocząć izolację nukleosomów, dodaj trzy mikrolitry 0,1 M chlorku wapnia do jąder komórkowych i umieść je w bloku grzejnym o temperaturze 37°C aż do wyrównania temperatury. Następnie dodaj dwie jednostki nukleazy mikrokokkowej w 10 µL buforu do nukleazy mikrokokkowej i inkubuj przez 12 minut w temperaturze 37°C. Często mieszaj roztwór za pomocą końcówki pipety.Po inkubacji przerwać reakcję, dodając 6 µL 0,5 M EDTA-pH 8, i schłodzić na lodzie. Następnie odwirować próbkę z prędkością 2000 ×g przez 4 minuty; po wirowaniu odrzucić nadsącz i resuspendować osad w 300 µL 0,2 mM EDTA. Inkubować próbkę na lodzie przez jedną godzinę, okresowo delikatnie pipetując w celu wymieszania.Po wirowaniu przy 3000 G przez cztery minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, należy zebrać supernatant zawierający wolne nukleosomy do nowej probówki do wirowania i przechowywać na lodzie do późniejszego wykorzystania nukleosomów. Osad należy zawiesić w 300 µL 0,2 mM EDTA sodowego, tak jak wcześniej, i inkubować na lodzie przez jedną godzinę, wykonując okazjonalnie delikatne mieszanie.Po inkubacji odwiruj próbkę w wirówce. Ponownie połącz otrzymany nadsącz z pozostałą częścią próbki w probówce do mikrowirówki na lodzie. Aby rozpocząć test ELISA dla nukleosomów, napełnij płytkę ELISA 96-dołkową malejącą serią pięciu dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych nukleosomów w buforze do powlekania, zaczynając od 0,1 micrograms na 50 microliters w górnym dołku; wszystkie serie rozcieńczeń powinny być naniesione w trzech powtórzeniach.Należy pamiętać o uwzględnieniu dopełniaczy zawierających wyłącznie bufor do powlekania jako kontroli. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C. Używając myjki do płytek, przemyć płytki 200 µL na dołek 0,5% między 20 w PBS w temperaturze pokojowej cztery razy, przez łącznie 10 minut.Następnie do każdej studzienki dodaj 100 µL roztworu blokującego i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze. Po inkubacji usuń bufor blokujący, energicznie potrząsając odwróconą płytką nad zlewem. Następnie dodaj rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe w objętości 50 µL na studzienkę w roztworze 5% PSA w 0,05% Tween 20 w PBS i inkubuj roztwór przez jedną godzinę na rotatorze w temperaturze pokojowej.Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym należy przemyć płytki w taki sam sposób jak poprzednio, używając myjki do płytek. Po zakończeniu procedury mycia należy dodać 50 µl na dołek przeciwciała wtórnego koniugowanego z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonego w PBS z 5% BS, A oraz 0,5%20 i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę na rotatorze. Po inkubacji z przeciwciałem wtórnym należy ponownie przemyć płytki w taki sam sposób jak wcześniej.Użycie myjki do płytek w celu opracowania płytki. Do każdego dołka należy dodać 50 µL substratu TMB do testu ELISA i inkubować przez 10 minut. W temperaturze pokojowej dołki płytki ELISA zmienią kolor na niebieski, a intensywność zabarwienia będzie proporcjonalna do ilości modyfikacji nukleosomów obecnych w każdym z nich.Następnie należy zatrzymać reakcję, dodając do każdej studzienki 50 µL kwasu siarkowego o stężeniu 2 N. Kolor zmieni się na brązowy. Płytkę należy odwirować przy 1500 RPM przez dwie minuty, aby usunąć pęcherzyki powietrza.Płytka jest teraz gotowa do kwantyfikacji przy użyciu kolorymetrycznego czytnika płytek. Na koniec odczytaj wartość z płytki przy 450 nanometrach i wyeksportuj wyniki do analizy. Po opanowaniu tej techniki i jej właściwym opracowaniu, cały proces może zostać przeprowadzony w ciągu dwóch dni.Technika ta otworzyła badaczom w dziedzinie komórek macierzystych drogę do badania odpowiedzi epigenetycznych na procesy różnicowania i reprogramowania na poziomie całego epi-proteomu.

detection-post-translational-modifications-on-native-intact

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykrywanie modyfikacji potranslacyjnych na natywnych, nietkniętych nukleosomach za pomocą ELISA

Ubikwitynacja jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Mutacje genów zaangażowanych w tę modyfikację są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych in vivo oraz w probówkach in vitro.

Wykrywanie ubikwitynacji białek

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Tutaj opisujemy testy biochemiczne, które mogą być użyte do scharakteryzowania zależnych od ATP enzymów przebudowujących chromatynę pod kątem ich zdolności do 1) katalizowania przesuwania się nukleosomów zależnych od ATP, 2) angażowania się w substraty nukleosomów i 3) hydrolizy ATP w sposób zależny od nukleosomu lub DNA.

Testy biochemiczne do analizy aktywności enzymów remodelujących chromatynę zależnych od ATP

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Ten protokół opisuje rekonstytucję nukleosomów zawierających różnie znakowane izotopowo histony siostrzane. Jednocześnie asymetrycznie zmodyfikowane potranslacyjnie nukleosomy mogą być generowane po użyciu wstępnie zmodyfikowanej kopii histonu. Preparaty te mogą być z łatwością wykorzystywane do badania mechanizmów przesłuchów modyfikacji, jednocześnie na obu siostrzanych histonach, przy użyciu spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości.

Rekonstytucja nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Badanie wielu, endogennych modyfikacji potranslacyjnych dla docelowego białka może być niezwykle trudne. Opisane tutaj techniki wykorzystują zoptymalizowany bufor do lizy i system filtrów opracowany ze specyficznymi matrycami powinowactwa do kierowania PTM, do wykrywania modyfikacji acetylacji, ubikwitynacji, SUMOylacji 2/3 i fosforylacji tyrozyny dla białka docelowego przy użyciu jednego, usprawnionego systemu.

Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych

Ubikwitynacja to modyfikacja potranslacyjna, która odgrywa ważną rolę w procesach komórkowych i jest ściśle koordynowana przez deubikwitynację. Defekty w obu reakcjach leżą u podstaw ludzkich patologii. Udostępniamy protokoły do przeprowadzania reakcji ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych składników.

Testy ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro histonów nukleosomalnych

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Warianty genetyczne u członka rodziny Spindlin 4 (SPIN4) zostały niedawno zidentyfikowane u pacjentów z przerostem kości, co jest nowym zaburzeniem rozwojowym. Przedstawiono protokół oraz nowe wyniki opisujące biochemiczną identyfikację zmodyfikowanych histonów w kontekście nukleosomów jako substratów wiążących SPIN4.

Identyfikacja zmodyfikowanych histonów jako substratów wiążących członka ludzkiej rodziny spindlin 4 (SPIN4) za pomocą matryc peptydowych i natywnego pulldownu nukleosomów

Poznaj metodę NU-ELISA do wykrywania modyfikacji potranslacyjnych na natywnych nukleosomach. Ta technika pozwala ocenić globalne stany modyfikacji chromatyny w różnych typach komórek.

Wykrywanie modyfikacji potranslacyjnych w natywnych, nienaruszonych nukleosomach metodą ELISA

Przeglądaj więcej filmów