Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przedstawienie prostej procedury oceny względnego stopnia występowania potranslacyjnych modyfikacji histonów, które odgrywają kluczowe role w biologii chromatyny, takie jak regulacja ekspresji genów i kondensacja chromosomów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii chromatyny, na przykład: które modyfikacje histonów zmieniają swoją względną obfitość po stymulacji lub podaniu preparatu określonym komórkom lub tkankom.

Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki zastosowaniu proteomiki opartej na spektrometrii mas możemy w ramach jednej analizy jednocześnie wyznaczyć ilość większości znanych PTM na znanych białkach. Analiza modyfikacji histonów ma liczne zastosowania, w tym szacowanie zmian epigenetycznych i funkcjonowania chromatyny u osobników lub w systemach modelowych po podaniu leku lub poddaniu stresowi. Oprócz Simone, procedury zawarte w tym protokole zaprezentuje dwóch innych członków mojego laboratorium.

Natarajan Bhanu, specjalista ds. badań, oraz Kelly Karch, doktorantka. Jak pokazano w tym schemacie postępowania, jest to 10-etapowy protokół, który obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację histonów, trawienie i odsalanie oraz analizę spektrometrią mas z zastosowaniem nanoflowowej chromatografii cieczowej. W tym filmie zaprezentowane zostaną jedynie wybrane procedury.

Aby rozpocząć procedurę izolacji jąder z nieuszkodzonych komórek, rozmrozić na lodzie komórki, które zostały wcześniej zebrane i przechowywane w temperaturze -80°C. Następnie przygotować bufor do izolacji jąder (NIB), zgodnie z opisem w tekście protokołu. Odlać jedną piątą objętości NIB i dodać NP-40 Alternative do stężenia końcowego 0,2%. Pozostałe cztery piąte objętości zostaną wykorzystane do przemyć.

Przemyj osad komórkowy buforem NIB bez NP-40 Alternative, stosując stosunek objętości osadu komórkowego do objętości buforu wynoszący 1:10. Odwiruj próbkę przy 700 RCF przez pięć minut i usuń nadsącz. Zlizuj osad komórkowy, umieszczając go na lodzie i dodając bufor NIB z 0,2% NP-40 Alternative w stosunku objętości osadu komórkowego do objętości buforu 1:10.

Zhomogenizuj komórki poprzez delikatne pipetowanie. Inkubuj zhomogenizowane komórki na lodzie przez 5 do 10 minut, aby doszło do lizy komórek i uwolnienia jąder. Odwiruj przy 1000 RCF przez 5 do 10 minut w temperaturze 4°C.

Osad będzie zawierał głównie jądra komórkowe, natomiast supernatant będzie zawierał głównie komponenty cytoplazmatyczne. W razie potrzeby należy zachować frakcję cytoplazmatyczną. Osad z jąder należy przemyć, delikatnie resuspendując go w NIB bez NP-40 Alternative, stosując stosunek objętości osadu do objętości buforu 1:10.

Wiruj przy 1000 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie usuń nadsącz. Po całkowitym usunięciu NP-40 Alternative z osadu jąder dodaj lodowaty 0,2 molarny kwas siarkowy w stosunku objętości jąder do objętości kwasu siarkowego wynoszącym 1:5. Ponownie zawieś jądra w kwasie siarkowym, delikatnie pipetując.

Inkubować próbkę przy stałym obrocie lub delikatnym wstrząsaniu przez dwie do czterech godzin w temperaturze 4°C. Następnie odwirować próbkę przy 3400 RCF w temperaturze 4°C przez pięć minut i przenieść nadsącz do nowej probówki. Odwirować ponownie i przenieść nadsącz do nowej probówki, aby usunąć wszelkie nierozpuszczalne materiały.

Aby wytrącić histony, należy dodać schłodzony, 100% kwas trójchlorooctowy (TCA) do zebranego supernatantu w stosunku objętości 1:3. Obecność histonów jest sygnalizowana przez zmętnienie próbki. Wymieszać, kilkukrotnie odwracając probówkę.

Inkubować mieszaninę na lodzie przez co najmniej jedną godzinę. Centryfugować przy 3400 RCF przez pięć minut. Po wirowaniu histony oblepią ścianki probówki i osadzą się również na jej dnie.

Na samym dnie probówki utworzy się również biały, nierozpuszczalny osad, składający się głównie z białek niehistonowych i innych biomolekuł. Ostrożnie usuń nadsącz poprzez aspirację, nie dotykając ścianek ani osadu na dnie probówki. Za pomocą szklanej pipety Pasteura opłucz probówkę 100% lodowatym acetonem z dodatkiem 0,1% kwasu solnego, tak aby pokryć wytrącone białka osadzone na ściankach i dnie.

Wirować przy 3400 RCF przez dwie minuty. Ostrożnie odprowadzić supernatant, nie dotykając ścianek probówki ani osadu. Przepłukać probówkę 100% lodowatym acetonem, ponownie wirować i usunąć supernatant, nie dotykając ścianek probówki ani osadu.

Następnie, zgodnie z opisem w tekście protokołu, przeprowadza się kwantyfikację histonów oraz analizę czystości. Przed derywatyzacją histonów można również przeprowadzić opcjonalne frakcjonowanie wariantów histonowych za pomocą HPLC w fazie odwróconej. Procedurę tę należy rozpocząć od rozpuszczenia próbek histonów w 40 µL 50 mM wodorowęglanu amonu o pH 8,0.

Sprawdź pH, wkładając końcówkę pipety P10 do próbki bez aspiracji, a następnie dotykając nią paska wskaźnika pH. Użyj wodorotlenku amonu i kwasu mrówkowego, aby dostosować pH do wartości 8,0. Od tego momentu wszystkie etapy obejmujące użycie bezwodnika propionowego muszą być przeprowadzane w dygestorium.

Przetwarzać maksymalnie od trzech do czterech próbek jednocześnie, aby zachować reaktywność bezwodnika propionowego. Przygotować świeży odczynnik do propionylacji, mieszając bezwodnik propionowy z acetonitrylem w stosunku objętościowym 1:3. Dodać odczynnik do propionylacji do każdej próbki w stosunku objętościowym 1:4.

Szybko dodaj wodorotlenek amonu, aby przywrócić roztworowi pH 8.0. Zazwyczaj odpowiednie dla przywrócenia pH 8.0 jest dodanie wodorotlenku amonu do próbki w stosunku objętościowym 1:5. Natychmiast wymieszaj za pomocą vortexa.

Sprawdź pH. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po przeprowadzeniu propionylacji wszystkich próbek, odparuj je do objętości od 10 do 20 µL w koncentratorze próżniowym.

Resuspendować lub rozcieńczyć próbki w ddH20 aż do uzyskania końcowej objętości 40 µL. Ponieważ sole utrudniają przeprowadzanie chromatografii cieczowej i spektrometrii mas, próbki muszą zostać odsolone przed analizą. Na potrzeby tego filmu zostanie zaprezentowane jedynie przygotowanie końcówek typu stage-tip.

Używając końcówki do pipety P1000, wyciąć krążek materiału C18 z dysku do ekstrakcji do fazy stałej. Za pomocą kapilary z topionego kwarcu wypchnąć mini-krążek z końcówki P1000 do dna końcówki pipety P100 lub P200. Należy upewnić się, że krążek jest stabilnie osadzony na dnie końcówki.

Jeśli odsalany jest materiał o masie powyżej 25 µg, należy użyć dwóch mini-dysków C18 w tej samej końcówce P100 lub P200. Do stabilizacji końcówek w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 lub 2 ml należy użyć adaptera do wirówki. Żywicę należy przepłukać, wirując z 50 µL 100% acetonitrylu, aby aktywować materiał C18 i usunąć potencjalne zanieczyszczenia.

Następnie przeprowadzono odsolenie próbek zgodnie z opisem w treści protokołu. Peptydy histonowe występują w wielu formach izobarycznych. Przedstawiono dwa przykłady powszechnie występujących w analizie histonów.

Ekstrahowany chromatogram jonowy ich masy prekursorowej oraz izotopów względnych, pokazany powyżej, jest identyczny. Jednakże ekstrahowany chromatogram jonowy jonów produktowych, pokazany poniżej, pozwala na rozróżnienie dwóch form izobarycznych. Do oszacowania względnej obfitości obu gatunków należy używać wyłącznie unikalnych jonów fragmentacyjnych, wyróżnionych na czerwono.

Przeanalizowano histony wyekstrahowane z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, z pobudzeniem kwasem retinowym i bez niego. Ilościowa analiza względna dwóch peptydów histony H3 wykazała wyraźny spadek acetylacji w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych pobudzonych do różnicowania. Jest to zgodne z wcześniejszymi doniesieniami o wyższym poziomie acetylacji w embrionalnych komórkach macierzystych w porównaniu z komórkami różnicującymi się.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu trzech dni. Pierwszego dnia następuje ekstrakcja histonów, drugiego pochodniana i trawienie białek, a trzeciego pochodniana peptydów, oczyszczanie za pomocą stage-tipów oraz analiza LC-MS. Oczyszczanie histonów może być wykorzystywane do innych celów niż analiza peptydów, w tym w proteomice middle-down i top-down, gdzie możliwe jest scharakteryzowanie kombinatorycznych modyfikacji histonów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak identyfikować i kwantyfikować potranslacyjne modyfikacje histonów przy użyciu proteomiki opartej na spektrometrii mas.