Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie prostej procedury oceny względnej obfitości modyfikacji potranslacyjnych histonów, które odgrywają istotną rolę w biologii chromatyny, takiej jak regulacja ekspresji genów i kondensacja chromosomów. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii chromatyny. Na przykład, które modyfikacje histonów zmieniają ich względną obfitość pod wpływem stymulacji lub leczenia danych komórek lub tkanek.

Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki zastosowaniu proteomiki opartej na spektrometrii mas możemy jednocześnie określić ilościowo większość znanych PTM na znanych białkach w jednej analizie. Analiza modyfikacji histonów ma wiele zastosowań, w tym szacowanie zmian epigenetycznych i działania chromatyny u osób lub systemu modelowego po leczeniu farmakologicznym lub stresie. Oprócz Simone, dwaj inni członkowie mojego laboratorium zademonstrują procedury tego protokołu.

Natarajan Bhanu, specjalistka ds. badań, i Kelly Karch, doktorantka. Jak pokazano w tym przepływie pracy, jest to 10-etapowy protokół, który obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację histonów, trawienie i odsalanie oraz analizę spektrometrii mas przy użyciu nanoprzepływowej chromatografii cieczowej. W tym filmie zostaną zademonstrowane tylko wybrane procedury.

Aby rozpocząć procedurę izolowania jąder od nienaruszonych komórek, rozmrozić na lodzie komórki, które zostały wcześniej zebrane i przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. I przygotuj bufor izolacji jądrowej lub NIB, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Usunąć jedną piątą objętości NIB i dodać NP-40 Alternative do końcowego stężenia 0,2%Pozostałe cztery piąte objętości zostaną wykorzystane do płukania.

Przemyj osad komórkowy za pomocą NIB bez NP-40 Alternative, stosując stosunek objętości osadu komórkowego do objętości bufora 1:10. Wirować przy 700 RCF przez pięć minut i usunąć supernatant. Lizować osad komórkowy, umieszczając go na lodzie i dodając NIB z 0,2% NP-40 Alternative w stosunku 1:10 objętości osadu komórkowego do objętości bufora.

Homogenizować komórki przez delikatne pipetowanie. Inkubuj homogenizowane komórki na lodzie przez pięć do 10 minut, aby komórki uległy lizie i uwolniły jądra. Wirować w temperaturze 1000 RCF przez pięć do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Osad będzie zawierał głównie jądra komórkowe, podczas gdy supernatent będzie zawierał głównie składniki cytoplazmatyczne. W razie potrzeby zachowaj frakcję cytoplazmatyczną. Umyj osad jądrowy, delikatnie ponownie go zawieszając NIB bez NP-40 Alternative, stosując stosunek objętości osadu do objętości bufora 1:10.

Wirować w temperaturze 1000 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatent. Po całkowitym usunięciu NP-40 Alternative z osadu jądrowego, dodać lodowaty 0,2 molowy kwas siarkowy w stosunku 1:5 objętości jąder do objętości kwasu siarkowego. Ponownie zawiesić jądra w kwasie siarkowym przez delikatne pipetowanie.

Próbkę inkubować ze stałą rotacją lub delikatnym potrząsaniem przez dwie do czterech godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 3400 RCF w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut i przenieść supernatent do nowej probówki. Ponownie odwirować i przenieść supernatent do nowej probówki w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału.

Aby wytrącić histony, dodaj schłodzony, 100% kwas trichlorooctowy lub TCA do zebranego supernatentu w stosunku objętościowym 1:3. Na obecność histonów wskazuje fakt, że próbka staje się mętna. Wymieszaj, obracając rurkę kilka razy.

Inkubować mieszaninę na lodzie przez co najmniej godzinę. Wirować przy 3400 RCF przez pięć minut. Po odwirowaniu histony pokryją boki probówki, a także osadzają się na dnie.

Na samym dnie probówki utworzy się również biała, nierozpuszczalna osadka, która zawiera głównie białka niehistonowe i inne biocząsteczki. Ostrożnie usunąć supernatent przez aspirację, nie skrobając boków probówki ani osadu znajdującego się na dnie probówki. Za pomocą szklanej pipety Pasteura przepłucz probówkę 100% lodowatym acetonem i 0,1% kwasem solnym, tak aby pokryć wytrącone białka pokrywające boki i dno.

Wirować przy 3400 RCF przez dwie minuty. Ostrożnie zassać supernatent, nie skrobając boków ani osadu. Przepłucz probówkę 100% lodowatym acetonem, ponownie odwiruj i usuń supernatent bez skrobania boków lub osadu.

Następnie przeprowadza się kwantyfikację histonów i analizę czystości zgodnie z opisem w tekście protokołu. Opcjonalne frakcjonowanie wariantów histonów za pomocą HPLC z odwróconymi fazami można również przeprowadzić przed derywatyzacją histonów. Rozpocznij tę procedurę od rozpuszczenia próbek histonów w 40 mikrolitrach 50-milimolowego wodorowęglanu amonu o pH 8,0.

Sprawdź pH, wkładając końcówkę pipety P10 do próbki bez zasysania i dotykając końcówki pipety paskiem wskaźnika pH. Użyj wodorotlenku amonu i kwasu mrówkowego, aby dostosować pH do 8,0. Od tego momentu wszystkie czynności związane z użyciem bezwodnika propionowego muszą być wykonywane w dygestorium.

Przetwarzać maksymalnie trzy do czterech próbek na raz, aby utrzymać reaktywność bezwodnika propionowego. Przygotować świeży odczynnik propionylacyjny, mieszając bezwodnik propionowy z acetonitrylem w stosunku objętościowym 1:3. Dodać odczynnik propionylacji do każdej próbki w stosunku objętościowym 1:4.

Szybko dodaj wodorotlenek amonu, aby przywrócić pH 8,0 w roztworze. Zwykle dodanie wodorotlenku amonu do próbki o stosunku objętościowym 1:5 jest odpowiednie do przywrócenia pH 8,0. Natychmiast wymieszaj przez wirowanie.

Sprawdź pH. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po poddaniu wszystkich próbek propionylacji wysuszyć próbki do 10 do 20 mikrolitrów w koncentratorze próżniowym.

Ponownie zawiesić lub rozcieńczyć próbki za pomocą ddH20 aż do uzyskania 40 mikrolitrów końcowej objętości. Ponieważ sole utrudniają chromatografię cieczową i spektrometrię mas, próbki muszą zostać odsolone przed analizą. Na potrzeby tego filmu zostanie zademonstrowana jedynie budowa końcówek sceny.

Za pomocą końcówki do pipety P1000 przebij krążek z materiałem C18 z dysku do ekstrakcji do fazy stałej. Użyj kapilary ze stopionej krzemionki, aby wypchnąć mini-dysk z końcówki P1000 na dno końcówki pipety P100 lub P200. Upewnij się, że dysk jest dobrze zaklinowany w dolnej części końcówki.

W przypadku odsalania ponad 25 mikrogramów próbki należy użyć dwóch minidysków C18 w tej samej końcówce P100 lub P200. Użyj adaptera wirówki, aby przytrzymać końcówki stage na miejscu w 1.5 lub dwóch mililitrowych probówkach do mikrowirówek. Przepłucz żywicę, wirując 50 mikrolitrami 100% acetonitrylu, aby aktywować materiał C18 i usunąć potencjalne zanieczyszczenia.

Następnie odsalanie próbki odbywa się zgodnie z opisem w tekście protokołu. Peptydy histonowe występują w różnych formach izobarycznych. Przedstawiono dwa przykłady powszechnie występujące w analizie histonów.

Chromatogram wyekstrahowanych jonów ich masy prekursorowej i izotopów względnych, pokazany powyżej, jest identyczny. Jednak wyekstrahowany chromatogram jonowy jonów pokrewnych, pokazany poniżej, pozwala na rozróżnienie dwóch form izobarycznych. Tylko unikalne jony fragmentacyjne, zaznaczone na czerwono, powinny być używane do oszacowania względnej liczebności tych dwóch gatunków.

Analizie poddano histony wyekstrahowane z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, ze stymulacją kwasem retinowym i bez niej. Względna kwantyfikacja dwóch peptydów histonu H3 ujawniła wyraźne zmniejszenie acetylacji w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych, stymulowanych do różnicowania. Jest to zgodne z wcześniejszymi doniesieniami o wyższej acetylacji w embrionalnych komórkach macierzystych w porównaniu z komórkami różnicującymi.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Jeden dzień na ekstrakcję histonów, drugi dzień na derywatyzację i trawienie białek, a trzeci dzień na derywatyzację peptydów, etapowe przechylanie i analizę LC-MS. Oczyszczanie histonów może być wykorzystywane do innych celów niż analiza peptydów, w tym proteomiki środkowej i odgórnej, gdzie możliwe jest charaktaryzowanie kombinatorycznych modyfikacji histonów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak identyfikować i kwantyfikować modyfikację potranslacyjną histonów za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.