Name: Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę wykrywania endogennych modyfikacji potranslacyjnych białek docelowych w komórkach A431. System umożliwia jednoczesną detekcję acetylacji, ubikwitynacji, SUMOylacji i fosforylacji tyrozynowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy naukowcom z Cytoskeleton Inc. oraz doktorom Brianowi Hooverowi i Ashley Davis za ich krytyczną recenzję, redakcję i owocne dyskusje na temat rękopisu. Dodatkowo dziękujemy dr. Robertowi Homowi za jego wkład w tworzenie rękopisu wideo. Prace te były wspierane przez fundusze firmy Cytoskeleton Inc.

1. Przygotowanie próbki: Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Wyhoduj cztery 150-milimetrowe płytki komórek A431 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą.
	<ol>
		<li>Zwiększ liczbę komórek A431 do 50% konfluencji.</li>
		<li>Surowica ogranicza cztery płytki komórek A431 za pomocą DMEM bez surowicy przez 24 godziny.</li>
		<li>Dwie płytki komórek A431 należy traktować 33,3 mg/ml naskórkowego czynnika wzrostu przez 1 godzinę. Pozostałe dwie płytki należy pozostawić nieleczone. 
		UWAGA: Przedstawione tutaj warunki wzrostu komórek i leczenia stanowią przykład; Jednak metodologia ta ma zastosowanie do wielu różnych typów komórek i warunków leczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować do wybuchu i rozcieńczania z inhibitorami (Tabela 1). Połącz 2,895 ml buforu do lizy blastR z 15 μl inhibitora fosfatazy tyrozynowej, 30 μl inhibitora deubikwitynazy i deSUMOylazy, 30 μl inhibitora deacetylazy histonowej (HDAC) i 30 μl koktajlu inhibitorów proteazy.
	<ol>
		<li>Połączyć 9,65 ml buforu rozcieńczającego blastR z 50 μl inhibitora fosfatazy tyrozynowej, 100 μl inhibitora deubikwitynazy i desumo-ylazy, 100 μl inhibitora deacetylazy histonowej (HDAC) i 100 μl koktajlu inhibitorów proteazy. 
		UWAGA: Patrz Tabela materiałów, aby uzyskać informacje o składzie buforu i inhibitorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odlej pożywkę hodowlaną i umieść komórki na lodzie. Następnie przemyj komórki dwukrotnie 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
	<ol>
		<li>Usuń jak najwięcej PBS przed dodaniem buforu do lizy blastR, aby zmaksymalizować lizę komórek. 
		UWAGA: Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się ze składem buforu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 600 μl buforu do lizy blastR na każdą płytkę o średnicy 150 mm. Wielkość bufora opiera się na oczekiwanym uzysku białka (tabela 2).
	<ol>
		<li>Zlikwiduj komórki za pomocą skrobaka do komórek. Lisat stanie się lepki z powodu lizy jądrowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj odciętej końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby przenieść surowy lizat do filtra blastR, który został umieszczony w probówce zbiorczej o pojemności 15 ml (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1). W tym przypadku używana jest probówka sokoła o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Użyj dostarczonego tłoka filtra, aby całkowicie skompresować filtr blastR i zebrać przepływ lizatu, w tym wszelkie pęcherzyki, w probówce o pojemności 15 ml (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Opcjonalnie: Przenieść oczyszczony lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować lizat przy stężeniu około 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Przenieść supernatant do nowej probówki Falcon o pojemności 15 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć sklarowany lizat buforem rozcieńczającym do strzału R do końcowej objętości 3 ml na każdą płytkę o średnicy 150 mm. Ostateczna objętość opiera się na oczekiwanej wydajności białka (tabela 2). 
	UWAGA: Ten krok jest ważny, ponieważ ostateczny skład buforu będzie miał wpływ na rygorystyczność reakcji IP.</li>
	<li>Określić ilościowo stężenie białka (sekcja 2).</li>
</ol>
2. Test ilościowy białka
UWAGA: Użyj standardowego kolorymetrycznego testu ilościowego białka, aby określić ilościowość białka. W tym przypadku oznaczanie ilościowe białka jest oznaczane za pomocą precyzyjnego zaawansowanego testu białek czerwonych.
<ol>
	<li>Dodaj 1 ml precyzyjnego czerwonego zaawansowanego odczynnika do oznaczania białek do każdej z dwóch kuwet o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Wymieszać 10 μl buforu do lizy blastR i 40 μl buforu rozcieńczającego blastR w czystej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie. 
	UWAGA: Zostanie to wykorzystane do odczytu ślepej próbki białka.</li>
	<li>Dodać 20 μl mieszaniny buforowej do lizy/rozcieńczania (z kroku 2.2) do pierwszej kuwety i wymieszać, odwracając dwa do trzech razy.</li>
	<li>Dodać 20 μl rozcieńczonego lizatu komórkowego (z eksperymentu) do drugiej kuwety, mieszając jak wyżej.</li>
	<li>Próbki inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ślepa próba spektrofotometru z próbką mieszaniny buforu do lizy/rozcieńczania (od etapu 2.3).</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję próbki lizatu (od etapu 2.4) przy długości fali 600 nm.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie białka lizatu w następujący sposób; 
	odczyt próbki OD600 x 5 = stężenie białka w mg/ml 
	UWAGA: Odczyty OD poniżej 0,05 lub powyżej 0,5 są zbliżone do pojemności zakresu liniowego testu białka. W przypadku odczytów >0,5 próbki można rozcieńczyć. W przypadku odczytów <0,05 można dodać więcej lizatu do precyzyjnego czerwonego zaawansowanego odczynnika do oznaczania białek (do 50 μl). W tabeli 3 przedstawiono mnożniki służące do przeliczania odczytów spektrofotometru na stężenie białka lizatu mg/mL. Jeśli na jednej płytce nie ma wystarczającej ilości białka, zaleca się użycie 2 lub więcej płytek na IP. W takim przypadku płytki będą zbierane szeregowo, przenosząc oryginalne 300 μl buforu do lizy między płytkami.</li>
	<li>Na podstawie stężenia białka rozcieńczyć próbkę mieszanką buforową (1 część lizy blastR: 4 części rozcieńczenia blastR) do pożądanego stężenia końcowego (zwykle 1 mg/ml).</li>
	<li>Zamroź zatrzaskowo porcje próbek, które nie zostaną natychmiast wykorzystane.
	<ol>
		<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -70 °C.</li>
		<li>Przejdź do sekcji 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test immunoprecypitacji (IP)
UWAGA: Stężenia kulek powinowactwa, stężenia lizatu i czasy inkubacji są zalecanymi wytycznymi i mogą być unikalne dla każdego białka docelowego i konkretnego PTM, który jest badany.
<ol>
	<li>Kilkakrotnie odwróć probówki z odczynnikami zawierającymi koraliki powinowactwa Ub, koraliki powinowactwa pY, koraliki powinowactwa SUMO 2/3 i koraliki powinowactwa Ac, aby upewnić się, że kulki są całkowicie ponownie zawieszone w probówce.</li>
	<li>Dla każdego testu IP, podwielokrotną zawiesinę kulek do oddzielnych 1,5 ml probówek mikrowirówek na lodzie (probówka IP). Tutaj dodaj 20 μl kulek powinowactwa do ubikwityny, 30 μl kulek powinowactwa fosfotyrozyny, 40 μl kulek powinowactwa SUMOylation 2/3 lub 50 μl kulek powinowactwa do acetylacji do pojedynczych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml na lodzie. 
	UWAGA: Patrz Tabela 4, aby zapoznać się z zalecaną objętością zawiesiny stopki do użycia dla każdego koralika o powinowactwie.</li>
	<li>Kilkakrotnie odwróć probówki z odczynnikami zawierającymi kulki kontrolne ubikwitynacji IP i kulki kontrolne IgG, aby upewnić się, że kulki są całkowicie ponownie zawieszone w probówce.</li>
	<li>Podwielokrotne kulki kontrolne na reakcję kontrolną w celu określenia niespecyficznego wiązania (probówka kontrolna IP). W tym przypadku dodaj 20 μl kulek kontrolnych Ub, 30 μl kulek kontrolnych pY, 40 μl kulek kontrolnych SUMO 2/3 lub 50 μl kulek kontrolnych Ac do pojedynczych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml na lodzie. 
	UWAGA: Patrz Tabela 4, aby zapoznać się z zalecaną objętością zawiesiny stopki do użycia dla każdego rodzaju stopki powinowactwa.</li>
	<li>Zaoszczędź niewielką ilość lizatu (20 μl), aby działała jako kontrola lizatu wejściowego Western Blot. Dodać 5 μl buforu do 5 próbek i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 min. 
	UWAGA: Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się ze składem buforu.</li>
	<li>Dodaj lizat do każdej lampy IP i kontroluj lampę IP. W tym przypadku użyto 1 mg lizatu na IP i reakcję kontrolną, co dało w sumie 8 reakcji IP. 
	UWAGA: Jako punkt wyjścia zaleca się 1,0 mg lizatu na test. Wymagana ilość lizatu będzie się różnić w zależności od obfitości zmodyfikowanego białka docelowego.</li>
	<li>Inkubować probówki na platformie obrotowej w temperaturze 4 °C przez 2 godziny. W tym przypadku zastosowano rotator rurowy ATR przy prędkości 22.</li>
	<li>Zbierać kulki przez odwirowanie w temperaturze 3.000 - 5.000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać jak najwięcej supernatantu, nie naruszając kulek.</li>
	<li>Płukać kulki w 1 ml buforze do płukania blastR (na tym etapie inhibitory nie są konieczne) przez 5 minut na platformie obrotowej o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zbierać kulki przez odwirowanie w temperaturze 3.000 - 5.000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać jak najwięcej supernatantu, nie naruszając kulek.</li>
	<li>Powtórz krok prania (kroki 3.10 - 3.12) jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Po ostatnim myciu całkowicie usunąć supernatant buforowy. Dopuszczalne jest minimalne rozerwanie granulki kulki (do 5% straty). Usunąć resztki supernatantu za pomocą końcówki ładującej białko o drobnym otworze.</li>
	<li>Dodać 30 μl buforu elucyjnego do elucji perełkowej i ponownie zawiesić kulki, delikatnie stukając/przesuwając bok probówki. Na tym etapie NIE WOLNO używać pipety. 
	UWAGA: Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się ze składem buforu.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Delikatnie przenieś zawiesinę każdej kulki do 1,5 ml kolumny wirowej mikrowirówki, która została umieszczona w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Zaleca się odcięcie końcówki pipety transferowej w celu delikatniejszego przenoszenia.</li>
	<li>Wirować przy 9 000 - 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w celu pobrania próbki IP.</li>
	<li>Dodać 2 μl 2-merkaptoetanolu do każdej próbki i dobrze wymieszać. 
	UWAGA: Wygodnie jest zdjąć pokrywkę z kolumny wirującej i użyć jej do zakręcenia probówki zbiorczej do dalszego przetwarzania.</li>
	<li>Umieścić próbki w łaźni wodnej o temperaturze 95 °C na 5 minut. Pobrać próbkę przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze suchej masy.</li>
	<li>W razie potrzeby przechowywać próbki w temperaturze -70 °C i zatrzymać się w tym miejscu lub przejść do przeprowadzania SDS-PAGE, transferu i analizy western blot (sekcja 4).</li>
</ol>
4. Analiza Western Blot: Identyfikacja białka będącego przedmiotem zainteresowania
<ol>
	<li>Oddzielić próbki za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) i przenieść do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF), zgodnie ze standardowymi protokołami laboratoryjnymi32.</li>
	<li>Użyj przeciwciała pierwszorzędowego, aby wykryć zmodyfikowane potranslacyjnie wersje białka będącego przedmiotem zainteresowania. W tym przypadku przeciwciało PD-L1 zastosowano do wykrywania zmodyfikowanego potranslacyjnie PD-L1.</li>
	<li>Do wykrywania użyj ultraczułego odczynnika do wykrywania chemiluminescencji. 
	UWAGA: Odczynnik chemiluminescencyjny powinien być stosowany w połączeniu z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym HRP, zdolnym do wykrywania przeciwciała pierwszorzędowego.</li>
	<li>Użyć objętości 2 ml odczynnika chemiluminescencyjnego na membranę transferową wielkości miniżelu (około 8 x 7 cm).
	<ol>
		<li>Po inkubacji z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym (zalecane 60 minut w temperaturze pokojowej) przemyć blot 6 x 10 min w 30 ml soli fizjologicznej z tris-bufferem tween-20 (TBST). 
		UWAGA: Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się ze składem buforu.</li>
		<li>Bezpośrednio przed użyciem zmieszać 1 ml odczynnika chemiluminescencyjnego A z 1 ml odczynnika chemiluminescencyjnego B (wystarczy na jedną membranę o wymiarach 8 cm x 7 cm).</li>
		<li>Dodać odczynnik chemiluminescencyjny do membrany i inkubować z delikatnym kołysaniem w temperaturze pokojowej przez 1 - 5 minut przed wizualizacją sygnału białkowego za pomocą kliszy rentgenowskiej lub obrazowania kamery CCD (Charge-coupled Device). 
		UWAGA: Krótsze czasy inkubacji w odczynniku chemiluminescencyjnym mogą być konieczne w przypadku białek o dużej obfitości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27296530">The world of protein acetylation.</a> Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).</li>
<li>Swatek, K. N., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin modifications.</a> Cell Res. 26 (4), 399-422 (2016).</li>
<li>Eifler, K., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation-Mediated+Regulation+of+Cell+Cycle+Progression+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.</a> Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).</li>
<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3996475/">The genesis of tyrosine phosphorylation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (5), 1-15 (2014).</li>
<li>International Human Genome Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finishing+the+euchromatic+sequence+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finishing the euchromatic sequence of the human genome.</a> Nature. 431 (7011), 931-945 (2004).</li>
<li>Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification-specific+proteomics%3A+characterization+of+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 8 (1), 33-41 (2004).</li>
<li>Pellegrino, S., Altmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Ubiquitin%2C+SUMO%2C+and+Poly%28ADP-Ribose%29+in+the+Cellular+Response+to+Genotoxic+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Interplay between Ubiquitin, SUMO, and Poly(ADP-Ribose) in the Cellular Response to Genotoxic Stress.</a> Front Genet. 7 (63), 1-8 (2016).</li>
<li>Liddy, K. A., White, M. Y., Cordwell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+decorations%3A+post-translational+modifications+and+heart+disease+delineated+by+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Functional decorations: post-translational modifications and heart disease delineated by targeted proteomics.</a> Genome Med. 5 (2), 20(2013).</li>
<li>Margolin, D. H., Kousi, M., Chan, Y. M., Lim, E. T., Schmahmann, J. D., Hadjivassiliou, M., Hall, J. E., Adam, I., Dwyer, A., Plummer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxia%2C+dementia%2C+and+hypogonadotropism+caused+by+disordered+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Ataxia, dementia, and hypogonadotropism caused by disordered ubiquitination.</a> N Engl J Med. 368 (21), 1992-2003 (2013).</li>
<li>Droescher, M., Chaugule, V. K., Pichler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+rules%3A+regulatory+concepts+and+their+implication+in+neurologic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Med%22%5BJournal%5D)">SUMO rules: regulatory concepts and their implication in neurologic functions.</a> Neuromolecular Med. 15 (4), 639-660 (2013).</li>
<li>Anbalagan, M., Huderson, B., Murphy, L., Rowan, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+nuclear+receptors+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Recept+Signal%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of nuclear receptors and human disease.</a> Nucl Recept Signal. 10 (e001), 1-13 (2012).</li>
<li>Kim, M. Y., Bae, J. S., Kim, T. H., Park, J. M., Ahn, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transcription+factor+modifications+in+the+pathogenesis+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Role of transcription factor modifications in the pathogenesis of insulin resistance.</a> Exp Diabetes Res. 2012 (716425), 1-16 (2012).</li>
<li>West, A. C., Johnstone, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+emerging+HDAC+inhibitors+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">New and emerging HDAC inhibitors for cancer treatment.</a> J Clin Invest. 124 (1), 30-39 (2014).</li>
<li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors%3A+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> Am J Transl Res. 3 (2), 166-179 (2011).</li>
<li>Gu, B., Zhu, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surf+the+post-translational+modification+network+of+p53+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Surf the post-translational modification network of p53 regulation.</a> Int J Biol Sci. 8 (5), 672-684 (2012).</li>
<li>Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%3A+molecular+components%2C+readout+mechanisms%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions.</a> J Cell Biol. 206 (4), 461-472 (2014).</li>
<li>Nguyen, L. K., Kolch, W., Kholodenko, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+ubiquitination+meets+phosphorylation%3A+a+systems+biology+perspective+of+EGFR%2FMAPK+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">When ubiquitination meets phosphorylation: a systems biology perspective of EGFR/MAPK signalling.</a> Cell Commun Signal. 11 (52), 1-15 (2013).</li>
<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age+of+crosstalk%3A+phosphorylation%2C+ubiquitination%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond.</a> Mol Cell. 28 (5), 730-738 (2007).</li>
<li>Butler, P. L., Staruschenko, A., Snyder, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+stimulates+the+epithelial+sodium+channel+by+reducing+its+ubiquitination+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acetylation stimulates the epithelial sodium channel by reducing its ubiquitination and degradation.</a> J Biol Chem. 290 (20), 12497-12503 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Wang, Y., Zhang, H., Gao, Y., Huang, C., Zhou, A., Zhou, Y., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+posttranslational+modifications+regulate+PKC+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential posttranslational modifications regulate PKC degradation.</a> Mol Biol Cell. 27 (2), 410-420 (2016).</li>
<li>Guo, Z., Kanjanapangka, J., Liu, N., Liu, S., Liu, C., Wu, Z., Wang, Y., Loh, T., Kowolik, C., Jamsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+posttranslational+modifications+program+FEN1+degradation+during+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential posttranslational modifications program FEN1 degradation during cell-cycle progression.</a> Mol Cell. 47 (3), 444-456 (2012).</li>
<li>Cui, W., Sun, M., Zhang, S., Shen, X., Galeva, N., Williams, T. D., Staudinger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SUMO-acetyl+switch+in+PXR+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A SUMO-acetyl switch in PXR biology.</a> Biochim Biophys Acta. 1859 (9), 1170-1182 (2016).</li>
<li>Doll, S., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+detection+and+assignment+of+protein+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications.</a> ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).</li>
<li>Siuti, N., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+protein+modifications+using+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Decoding protein modifications using top-down mass spectrometry.</a> Nat Methods. 4 (10), 817-821 (2007).</li>
<li>Mischerikow, N., Heck, A. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21246731">Targeted large-scale analysis of protein acetylation.</a> Proteomics. 11 (4), 571-589 (2011).</li>
<li>Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+endogenous+SUMO1+and+SUMO2%2F3+targets+in+mammalian+cells+and+tissues+using+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies.</a> Nat Protoc. 9 (4), 896-909 (2014).</li>
<li>Emmerich, C. H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+methods+for+the+preservation%2C+capture+and+identification+of+ubiquitin+chains+and+ubiquitylated+proteins+by+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Optimising methods for the preservation, capture and identification of ubiquitin chains and ubiquitylated proteins by immunoblotting.</a> Biochem Biophys Res Commun. 466 (1), 1-14 (2015).</li>
<li>Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+of+proteins%3A+the+importance+of+lysis+buffer+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Solubilization of proteins: the importance of lysis buffer choice.</a> Methods Mol Biol. 1312, 49-60 (2015).</li>
<li>Grabski, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+preparation+of+biological+extracts+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Advances in preparation of biological extracts for protein purification.</a> Methods Enzymol. 463, 285-303 (2009).</li>
<li>Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Regulatory+Posttranslational+Modifications+of+PD-L1%3A+A+Focus+on+Monoubiquitinaton%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Identifying Regulatory Posttranslational Modifications of PD-L1: A Focus on Monoubiquitinaton.</a> Neoplasia. 19 (4), 346-353 (2017).</li>
<li>Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+toolset+to+identify+endogenous+post-translational+modifications+for+a+target+protein%3A+a+snapshot+of+the+EGFR+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">A simple toolset to identify endogenous post-translational modifications for a target protein: a snapshot of the EGFR signaling pathway.</a> Biosci Rep. 37 (4), 1-14 (2017).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Li, C. L., Sathyamurthy, A., Oldenborg, A., Tank, D., Ramanan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRF+phosphorylation+by+glycogen+synthase+kinase-3+promotes+axon+growth+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SRF phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 promotes axon growth in hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 34 (11), 4027-4042 (2014).</li>
<li>Fuchs, S. M., Strahl, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+histone+post-translational+modifications%3A+emerging+issues+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of histone post-translational modifications: emerging issues and future prospects.</a> Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).</li>
<li>Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+combinatorial+histone+modifications+on+antibody+and+effector+protein+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition.</a> Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).</li>
<li>Lim, S. O., Li, C. W., Xia, W., Cha, J. H., Chan, L. C., Wu, Y., Chang, S. S., Lin, W. C., Hsu, J. M., Hsu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitination+and+Stabilization+of+PD-L1+by+CSN5%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Deubiquitination and Stabilization of PD-L1 by CSN5.</a> Cancer Cell. 30 (6), 925-939 (2016).</li>
<li>Wu, R., Haas, W., Dephoure, N., Huttlin, E. L., Zhai, B., Sowa, M. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+method+to+measure+absolute+protein+phosphorylation+stoichiometries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A large-scale method to measure absolute protein phosphorylation stoichiometries.</a> Nat Methods. 8 (8), 677-683 (2011).</li>
<li>Ordureau, A., Munch, C., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+ubiquitin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying ubiquitin signaling.</a> Mol Cell. 58 (4), 660-676 (2015).</li>
<li>Lefebvre, T., Ferreira, S., Dupont-Wallois, L., Bussiere, T., Dupire, M. J., Delacourte, A., Michalski, J. C., Caillet-Boudin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+balance+between+phosphorylation+and+O-GlcNAc+glycosylation+of+Tau+proteins--a+role+in+nuclear+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Evidence of a balance between phosphorylation and O-GlcNAc glycosylation of Tau proteins--a role in nuclear localization.</a> Biochim Biophys Acta. 1619 (2), 167-176 (2003).</li>
<li>Wang, X., Li, D., Wu, G., Bazer, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Roles+of+Fructose%3A+Crosstalk+between+O-Linked+Glycosylation+and+Phosphorylation+of+Akt-TSC2-MTOR+Cell+Signaling+Cascade+in+Ovine+Trophectoderm+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Functional Roles of Fructose: Crosstalk between O-Linked Glycosylation and Phosphorylation of Akt-TSC2-MTOR Cell Signaling Cascade in Ovine Trophectoderm Cells.</a> Biol Reprod. 9 (5), 1-17 (2016).</li>
<li>Levkowitz, G., Waterman, H., Zamir, E., Kam, Z., Oved, S., Langdon, W. Y., Beguinot, L., Geiger, B., Yarden, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Cbl%2FSli-1+regulates+endocytic+sorting+and+ubiquitination+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor.</a> Genes Dev. 12 (23), 3663-3674 (1998).</li>
<li>Luo, H. B., Xia, Y. Y., Shu, X. J., Liu, Z. C., Feng, Y., Liu, X. H., Yu, G., Yin, G., Xiong, Y. S., Zeng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+at+K340+inhibits+tau+degradation+through+deregulating+its+phosphorylation+and+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SUMOylation at K340 inhibits tau degradation through deregulating its phosphorylation and ubiquitination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (46), 16586-16591 (2014).</li>
</ol>

H.H. i A.L. są pracownikami Cytoskeleton Inc. K.M. jest założycielem Cytoskeleton Inc.

Wstępne podejścia stosowane w celu określenia, czy białko docelowe jest modyfikowane przez PTM, można przeprowadzić przy użyciu przeciwciała swoistego dla białka docelowego dla IP, a następnie Western blot z przeciwciałem PTM (np. anty-acetylolizyna) lub przy użyciu przeciwciała PTM dla IP, a następnie Western blot z przeciwciałem specyficznym dla białka docelowego30,31, Lokal mieszkalny 33. Chociaż oba podejścia teoretycznie działają, wykorzystanie przeciwciała specyficznego dla białka docelowego ma więcej potencjalnych pułapek, takich jak przeciwciało może nie być kompatybilne z IP lub duże modyfikacje PTM mogą blokować miejsce rozpoznawania przeciwciał na białku docelowym34,35. Zaletą koralików powinowactwa PTM jest to, że przeciwciało lub domeny wiążące specyficznie rozpoznają interesujący PTM; W związku z tym modyfikacje białka docelowego nie powinny wpływać na rozpoznawanie przez kulki powinowactwa. Na przykład PD-L1 Ub zidentyfikowano za pomocą opisanej tutaj techniki i zaobserwowano zarówno endogenny mono-, jak i poli-Ub (ryc. 4). Niedawna publikacja Lim et al. wykorzystano techniki Ub in vitro do zbadania PD-L1 Ub, a wynik był bardzo podobny do wyników pokazanych na rysunku 436. Co ciekawe, wykonali również IP z przeciwciałem PD-L1 w celu wzbogacenia PD-L1 z lizatu komórkowego, w którym Ub uległ nadekspresji, a MG-132 dodano w celu wzmocnienia sygnału. Wzór Ub nie był solidny i bardzo różnił się od wzorca Ub in vitro. Badania endogennego PD-L1 Ub w modelach hodowli komórkowych nie zostały przeprowadzone w Lim i wsp. w celu wyjaśnienia różnicy między ich hodowlą komórkową a danymi z badań in vitro.
Zbadanie, czy białko jest modyfikowane przez PTM, może być trudne ze względu na jego niską liczebność i przejściowy charakter37,38 i często wymaga wzbogacenia za pomocą IP. Efektywne IP PTM wymaga optymalizacji kilku kluczowych kroków i odczynników, takich jak do lizy i odczynniki powinowactwa. Podczas badania wielu PTM białka docelowego wymagana optymalizacja prawdopodobnie wzrasta. Wykorzystanie systemu blastR lysis jest krytycznym krokiem w tym protokole, ponieważ utrzymuje on solidną zdolność IP, umożliwiając jednocześnie wykrywanie PTM pY, SUMO 2/3, Ub i Ac PTM w jednym systemie. Technika ta optymalizuje czas i zasoby wymagane do określenia, czy określone białko docelowe jest modyfikowane przez te cztery PTM, i potencjalnie zapewnia lepszy obraz przesłuchów PTM w porównaniu z porównywaniem wyników PTM wykonanych przy użyciu wielu systemów lizy. Zbadano kompatybilność systemu blastR lysis z alternatywnymi PTM, takimi jak glikozylacja; jednak nie zostało to zbadane wyczerpująco w odniesieniu do wszystkich typów PTM.
Obfite genomowe DNA może zakłócać pomiary białek przy użyciu metod kolorymetrycznych lub nanokropli, wpływać na migrację białek w żelu akrylamidowym SDS oraz zapobiegać interakcji białek i macierzy powinowactwa podczas testów IP. Opisana tutaj metoda wykorzystuje specjalistyczny filtr do skutecznego usuwania zanieczyszczenia genomowego DNA, co jest kolejnym krytycznym krokiem tego protokołu. Aby podkreślić tę kwestię, testy lepkości przeprowadzono przed i po obróbce filtrem blastR, a wyniki wykazały zmniejszenie lepkości z wysokiej lepkości do lepkości wody (dane nie pokazane). Ta zmiana lepkości została poparta wynikami na rysunku 3, pokazującymi, że prawie całe genomowe DNA zostało usunięte. Co ważne, DNA nie jest ścinane tą metodą, ponieważ jakiekolwiek ścięte DNA nie zostanie wychwycone przez filtr (dane nie są pokazane). To narzędzie jest lepsze od konwencjonalnych metod, takich jak sonikacja lub strzykawkowe ścinanie DNA, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu, jest wysoce powtarzalne i usuwa DNA zamiast go ścinać. Co więcej, nie powoduje degradacji białka w lizacie, co może nastąpić przy użyciu konwencjonalnych metod29. Użycie filtra zajmuje 5 - 30 sekund na próbkę w porównaniu z alternatywnymi metodami, w których skuteczny rozkład DNA może zająć kilka minut (np. ścinanie strzykawki) i może powodować niejednorodność próbki, ponieważ zanieczyszczenia DNA pozostają w lizacie. Przeprowadzono obszerną analizę filtracji lizatu przed i po blastR i nie zaobserwowano żadnej obserwowalnej różnicy w profilu białkowym za pomocą analiz Coomassie, zachodnich specyficznych dla celu lub całkowitych i specyficznych dla celu; w związku z tym odfiltrowanie genomowego DNA mogło nie mieć wpływu na integralność profilu białkowego. Ostatecznie ten system filtrów jest korzystny dla wszelkich aplikacji zachodnich lub IP, w których obecne jest genomowe DNA i może wpływać na interpretację analizy białka.
Ważne jest, aby pamiętać, że istnieje możliwość wykrywania fałszywie ujemnego przy użyciu tej techniki, co może być częściowo spowodowane nasyceniem koralików powinowactwa, zakłóceniami miejsca wiązania lub maskowaniem PTM. Na przykład, określone białko docelowe może być modyfikowane przez Ac na bardzo niskich poziomach; w związku z tym nie można go wyizolować za pomocą kulek powinowactwa do panacetylolizyny, które zostały nasycone przez bardziej obfite białka docelowe modyfikowane Ac. Trwają badania mające na celu ocenę granic wykrywalności odczynników powinowactwa stosowanych w tym protokole, ale niedawna publikacja sugeruje bardzo solidną granicę wykrywalności. Dane wykazały, że technika ta może zidentyfikować zaledwie 17 acetylowanych cząsteczek białka docelowego na komórkę31. Jednak określone okoliczności, takie jak specyficzność typu komórki, przejściowe PTM w odpowiedzi na określone bodźce lub maskowanie PTM w wyniku interakcji białek, mogą skutkować fałszywie ujemnymi wynikami. Są to potencjalne pułapki tej techniki, jak również większości metod PTM IP. Dlatego zaleca się potwierdzanie wyników przy użyciu wielu podejść.
Wykazano, że modyfikacje, takie jak glikozylacja i fosforylacja, konkurują o podobne aminokwasy39,40, a inne PTM, takie jak ubikwitynacja i fosforylacja, działają sekwencyjnie, aby regulować funkcję białka17,41. Niedawne prace nad neuropatologicznym białkiem Tau podkreśliły znaczenie przesłuchów PTM, w których hiperfosforylacja Tau i SUMOylacja Tau wzmacniały się nawzajem42. Co więcej, grupa ta wykazała, że sumoylacja Tau zapobiegała poli-Ub i późniejszej degradacji Tau, co może prowadzić do agregacji. Jest to tylko jeden z wielu przykładów regulacyjnych przesłuchów PTM, a użyteczność tej techniki pomoże naświetlić znaczenie PTM i ich przesłuchów w regulacji kluczowych białek w zdrowiu i chorobie.

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) to wysoce regulowane zmiany w białku, w wyniku których modyfikacja jest dodawana lub usuwana w określony sposób. PTM są często dynamicznymi, przejściowymi zmianami, które znacząco zmieniają strukturę białka, interakcje z białkami partnerskimi i lokalizację przestrzenną, a ostatecznie umożliwiają białku pełnienie różnych funkcji1,2,3,4. PTM są tak obfite, że zwiększają liczbę unikalnych form białek (lub proteoform) z około 30 000 produktów genów do ponad miliona proteoform5,6. Identyfikacja PTM i określenie ich wpływu na białko docelowe ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia fizjologicznych i patologicznych funkcji białka7,8,9,10,11,12,13,14. Prace nad wybranymi białkami, takimi jak tubulina, p53 i receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), wyjaśniły regulacyjne role PTMs15,16,17. Badania te ujawniły fakt, że regulacja tych białek zachodzi przez wiele PTM, a w wielu przypadkach modyfikacje te działają wspólnie, aby promować określoną funkcję. Nowe badania wykazały, że zarówno kooperacyjny, jak i ujemny przesłuch PTM może wystąpić na kilku różnych białkach18,19,20,21,22,23,24,25. Jednak profile PTM większości białek są zbudowane na podstawie kilku badań, w których wykorzystano różne modele i unikalne warunki. Posiadanie zoptymalizowanego systemu do badania wielu PTM w jednym systemie byłoby bardzo korzystne dla uzyskania wglądu w potencjalne przesłuchy PTM dla docelowego białka.
Jednym z wyzwań związanych z badaniem PTM w jednym systemie jest to, że konkretne PTM są badane przy użyciu odrębnych lizy. Na przykład, wykorzystanie takich jak RIPA lub NP-40, które są powszechnie używane do badań fosforylacji lub ubikwitynacji, może być niewystarczające do badania labilnego PTM, takiego jak mały modyfikator podobny do ubikwityny (SUMO)ylation26. Ponadto niedenaturujące są nieodpowiednie do dysocjacji interakcji białkowych i mogą prowadzić do fałszywie dodatniej identyfikacji PTM27. Preferowane może być badanie PTM w denaturującym buforze do lizy, ponieważ jest on znacznie lepszy w izolowaniu białek ze wszystkich przedziałów komórkowych28, zdysocjuje większość interakcji białkowych i zahamuje proteazy, które zmieniają stany PTM, takie jak deSUMOylazy 26; Jednak denaturacja może zagrozić integralności określonych odczynników powinowactwa, takich jak ubikwityna wiążąca narzędzia oparte na domenie27. Opracowanie systemu lizy podobnego do denaturacji w celu badania wielu PTM białka w systemie kompatybilnym z odczynnikiem powinowactwa byłoby bardzo korzystne dla badań przesłuchów PTM.
Chociaż denaturujące mają kluczowe zalety w porównaniu z niedenaturującymi do badania PTM, są one rzadziej używane ze względu na ich istotne wady, takie jak niekompatybilność z konwencjonalnymi testami białkowymi, znaczne zanieczyszczenie genomowym kwasem dezoksyrybonukleinowym (DNA) i zakłócenie działania odczynników immunoprecypitacyjnych (IP)29. Te wady mogą skutkować wydłużonym czasem przygotowania i potencjalnym uszkodzeniem docelowych białek podczas ścinania genomowego DNA. Dwie powszechnie stosowane metody cięcia DNA to liza strzykawką i sonikacja29. Obie metody wymagają rozległej optymalizacji i często brakuje im precyzyjnej odtwarzalności. Alternatywne metody usuwania genomowego DNA obejmują dodawanie DNAz; Może to jednak wymagać dodatkowej optymalizacji i zmian w składzie bufora. Ostatecznie prosta i powtarzalna metoda usuwania zanieczyszczenia genomowego DNA byłaby korzystna podczas pracy z denaturującymi lizy do badań PTM.
Celem tej techniki jest opracowanie systemu do izolowania i badania ubikwitynacji (Ub), fosforylacji tyrozyny (pY), SUMOylacji 2/3 (SUMO 2/3) i acetylacji (Ac) PTM w jednym systemie, aby lepiej badać przesłuchy PTM dla docelowego białka. Ten system wykrywania PTM został wykorzystany do szybkiego zbadania endogennego profilu PTM kilku docelowych białek w jednym systemie. Zidentyfikowano nowy wgląd w potencjalne przesłuchy30,31. Ogólnie rzecz biorąc, opisana tutaj technika ulepsza istniejące metody badania PTM i przesłuchów PTM na trzy różne sposoby: 1) opracowano unikalny bufor denaturujący, który izoluje białka ze wszystkich przedziałów komórkowych, a jednocześnie jest kompatybilny z odczynnikami powinowactwa PTM, 2) opracowano unikalny system filtrów, który szybko usuwa zanieczyszczenie genomowego DNA z denaturowanych lizatów z wysoką odtwarzalnością i nie wymaga specjalistycznego sprzętu, oraz 3) Solidne kulki powinowactwa, system lizy i odczynniki hamujące są kompatybilne; w ten sposób upraszcza izolację tych czterech PTM dla białka docelowego, aby zmaksymalizować wzbogacenie PTM i skutecznie badać potencjalne przesłuchy.

<table><tbody><tr><td><silny> Liza komórek/Usuwanie i analiza genomowego DNA< / silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x buforowany fosforanem soli fizjologicznej (PBS)</td> <td>wspólny bufor</td><td></td><td>Receptura: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4</td></tr><tr><td>Bufor do lizy BlastR</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>BLST01</td><td>Zastrzeżona mieszanina detergentów, soli i innych dodatków buforowych</td></tr><tr><td>Bufor do oznaczania radioimmunoprecypitacji (RIPA)</td><td>wspólny bufor</td><td></td><td>Receptura: Tris-HCl, NaCl, SDS, Deoksycholan Sodu, Igepal</td></tr><tr><td>Odczynnik do ekstrakcji białek ssaków (mPER)</td><td>Thermofisher</td><td>78503</td><td>Zastrzeżona mieszanina detergentów, soli i innych dodatków buforowych</td></tr><tr><td>Immunoprecypitacja (IP) Przebijanie lizy</td><td></td><td>87787</td><td>Zastrzeżona mieszanina detergentów, soli i innych dodatków buforowych</td></tr><tr><td>1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) bufor denaturujący</td><td>wspólny bufor</td><td></td><td>Receptura: PBS, SDS, EDTA, EGTA</td></tr><tr><td>Wspólny bufor</td><td></td><td>Laemmli</td><td>Receptura: Tris-HCl, SDS, glicerol, błękit bromofenolowy</td></tr><tr><td>Bufor rozcieńczający BlastR</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>BDB01</td><td>Zastrzeżona mieszanina detergentów, soli i innych dodatków buforowych</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Koktajl</td><td>Cytoszkielet Inc.</td><td>PIC02</td><td></td></tr><tr><td>N-etylomaleimid (NEM) i N,N,N&prime;,N&prime;-tetrakis(2-pirydylometylo)etylenodiamina (TPEN)</td><td>Cytoszkielet Inc.</td><td></td><td></td>NEM09BB</tr><tr><td>Trichostatyna A (TSA) i Cytoszkielet nikotynamidu</td><td>Inc.</td><td>TSA01</td><td></td></tr><tr><td>Aktywowany ortowananian sodu (Na3VO4)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>Skrobaki komórkowe PYI01</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Costar</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Filtr BlastR</td><td>Cytoszkielet Inc.</td><td>BLR02</td><td></td></tr><tr><td>BD Igła do strzykawki insulinowej</td><td>BD</td><td>08290-3284-11</td><td></td></tr><tr><td>sonikator (Branson Sonifier)</td><td>Branson</td><td>Sonifier 450</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjny czerwony zaawansowany odczynnik białkowy</td><td>Cytoszkielet Inc.</td><td>ADV02</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety 1 ml</td><td>Fisher</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr (Genesys20)</td><td>Thermofisher</td><td>4001</td><td>Inne spektrofotomery mogą być używane do pomiaru stężenia białka</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher</td><td>BP1356-500</td><td></td></tr><tr><td>1kb Drabinka kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA)</td><td>NEB</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko na żel DNA</td><td>Thermofisher</td><td>7312 B1A</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Tris/Boran/EDTA (TBE)</td><td>wspólny bufor</td><td></td><td>Receptura: Tris-HCl, kwas borowy, EDTA</td></tr><tr><td>PTM Immunoprecypitacja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kulki fosfotyrozyny</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>APY03-koraliki Koraliki</td><td></td></tr><tr><td>ubikwitynacyjne</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>UBA01-koraliki</td><td></td></tr><tr><td>SUMOylacja 2/3 koraliki</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>Koraliki ASM24 Koraliki</td><td></td></tr><tr><td>acetylacyjne</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>Koraliki AAC04 Koraliki</td><td></td></tr><tr><td>kontrolne fosfotyrozyny</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>CIG01-koraliki Koraliki</td><td></td></tr><tr><td>kontrolujące ubikwitynację</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>Koraliki CUB02 Koraliki</td><td></td></tr><tr><td>kontrolne SUMOylacja 2/3</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>CIG01-koraliki Koraliki</td><td></td></tr><tr><td>kontrolujące acetylację</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>CIG02-koraliki</td><td></td></tr><tr><td>Bufor myjący BlastR</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>BWB02</td><td>Zastrzeżona mieszanina detergentów, soli i innych dodatków buforowych</td></tr><tr><td>Bufor elucyjny do kulek</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>BEB01</td><td>Zastrzeżona mieszanina detergentów, soli i innych dodatków buforowych</td></tr><tr><td>mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5417</td><td>Można stosować inne mikrowirówki&nbsp;</td></tr><tr><td>rotator rurowy</td><td>ATR</td><td>RKVSD</td><td>Można stosować inne rotatory rurowe typu end-over-end&nbsp;</td></tr><tr><td>Wskazówki dotyczące ładowania białka</td><td>VWR</td><td>37001-150</td><td></td></tr><tr><td>kolumny wirujące</td><td>Cytoskeleton Inc.</td>Blok grzejny <td>SPN22</td><td></td></tr><tr><td>95 & deg; C</td><td>Benchmark</td><td>BSH1002</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE/Transfer/Analiza zachodnia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5x bufor próbki</td><td>wspólna receptura bufora</td><td></td><td>: błękit bromofenolowy, ditiotreitol (DTT), glicerol, SDS, Tris-HCl</td></tr><tr><td>novex wedge well 4-20% żele Tris-gly</td><td>Invitrogen</td><td>XP04200BOX</td><td>Duże wgłębienia klinowe doskonale nadają się do załadunku dużych objętości</td></tr><tr><td>1x Wspólna</td> receptura <td>bufora</td><td></td> do biegania<td>: Tris-HCl, glicyna, SDS</td></tr><tr><td>seeblue drabinka białkowa Life</td><td>Technologies</td><td>LC5625</td><td></td></tr><tr>komórka<td>do elektroforezy</td><td>Invitrogen</td><td>Xcell surelock</td> można <td>stosować inne ogniwa do elektroforezy, jednak są one kompatybilne z żelami Novex Wedgewell&nbsp;</td></tr><tr><td>zasilacz</td><td>Biorad</td><td>PowerPac HC</td><td>Można zastosować inne zasilacze&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Bufor transferowy</td><td>wspólna receptura buforu</td><td></td><td>: Tris-HCl, glicyna, metanol</td></tr><tr><td>Komórka transferowa</td><td>Biorad</td><td>mini komórka trans-blot</td><td>Można zastosować inne komórki transferowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Membrany Immobilon-P (PVDF)</td> <td>miliporowe</td><td>IPVH 304F0</td><td></td></tr><tr><td>mleko beztłuszczowe</td><td>rozwijają się</td><td>813503015095</td><td></td></tr><tr><td>Tris buforowana sól fizjologiczna z tween (TBST)</td> <td>wspólna receptura bufora</td><td></td><td>: Tris-HCl, NaCl, Tween 20</td></tr><tr><td>Odczynnik do wykrywania chemiluminescencyjnego</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>CLRA/CLRB</td><td></td></tr><tr><td>Wzrost i leczenie komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Surowica płodowa bydlęca</td><td>ATLAS&</td><td>nbsp; F-0500-A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>CN02-A Płytki do hodowli</td><td></td></tr><tr><td>komórkowych 150 mm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Obecnie powszechnie uznaje się, że modyfikacje potranslacyjne (PTM) odgrywają integralną rolę w regulacji struktury i funkcji białka, co może być niezbędne dla roli danego białka zarówno fizjologicznie, jak i patologicznie. Wzbogacenie PTM jest często konieczne podczas badania statusu PTM białka docelowego, ponieważ PTM są często przejściowe i mają stosunkowo niską liczebność. Podczas wzbogacania o PTM białka docelowego napotyka się wiele pułapek, takich jak niezgodność buforu, przeciwciało białka docelowego nie jest kompatybilne z IP, utrata sygnału PTM i inne. Stopień trudności jest zwiększany podczas badania wielu PTM, takich jak acetylacja, ubikwitynacja, SUMOylacja 2/3 i fosforylacja tyrozyny dla danego białka docelowego. Badanie kombinacji tych PTM może być konieczne, ponieważ przesłuchy między PTM są powszechne i mają kluczowe znaczenie dla regulacji białek. Często te PTM są badane w różnych do lizy i z unikalnymi składami inhibitorów. Aby uprościć ten proces, opracowano unikalny system lizy denaturującej, który skutecznie izoluje i konserwuje te cztery PTM; Umożliwiając w ten sposób badanie potencjalnych przesłuchów w pojedynczym systemie lizy. Unikalny system filtrów został opracowany w celu usunięcia z lizatu zanieczyszczającego genomowego DNA, który jest problematycznym produktem ubocznym denaturacji. Solidne matryce powinowactwa ukierunkowane na każdy z czterech PTM zostały opracowane we współpracy z systemem buforowym, aby zmaksymalizować wzbogacenie i wykrywanie stanów endogennych tych czterech PTM. Ten kompleksowy zestaw narzędzi do wykrywania PTM usprawnia proces uzyskiwania krytycznych informacji o tym, czy białko jest modyfikowane przez jeden lub więcej z tych PTM.

Zdolność tych narzędzi do badania wzajemnego oddziaływania (crosstalk) modyfikacji potranslacyjnych (PTM) poprzez skuteczne wykrywanie tych 4 PTM zależy częściowo od unikalnego systemu buforu do lizy. Bufor denaturujący blastR skutecznie izoluje białka ze wszystkich przedziałów komórkowych, podobnie jak inne bufory denaturujące, co zapewnia kompletny profil białkowy (Ryc. 2A). Dodatkowo pozwala on zachować sygnały bardzo nietrwałych PTM, takich jak SUMO 2/3, które szybko zanikają w buforach niedenaturujących, np. w buforze do testów radioimmunoprecypitacyjnych (RIPA) (Ryc. 2B). Co ważne, po odpowiednim rozcieńczeniu nie wpływa on na integralność odczynników powinowactwa, w przeciwieństwie do innych buforów denaturujących (np. bufor Laemmliego).
Istotną przeszkodą podczas pracy z buforami denaturującymi jest możliwość skutecznego usunięcia zanieczyszczeń w postaci genomowego DNA. Konwencjonalna metoda zmniejszania lepkości polega na rozrywaniu DNA za pomocą igły strzykawki lub sonikacji próbki. Rysunek 3A przedstawia zanieczyszczenie genomowym DNA w lizacie komórek A431 po zastosowaniu filtra BlastR, igły strzykawki lub sonikacji. Po zastosowaniu filtra BlastR następuje niemal całkowite usunięcie genomowego DNA, co nie występuje w przypadku użycia konwencjonalnej igły strzykawki lub sonikacji. Zanieczyszczenie genomowym DNA znacząco wpływa na migrację białek w żelu SDS-akrylamidowym; jednakże zastosowanie filtra BlastR usuwa genomowe DNA, co skutkuje prawidłową migracją białek (Rysunek 3B). Zmieniona migracja spowodowana zanieczyszczeniem genomowym DNA może znacząco wpłynąć na interpretację western blotów; na przykład rozmyty wzorzec EGFR widoczny w niefiltrowanym lizacie może zostać błędnie zinterpretowany jako zwiększona ekspresja w porównaniu z próbką filtrowaną (Rysunek 3C).
Wykorzystując ten zoptymalizowany system wzbogacania i detekcji PTM, można szybko określić, czy białko docelowe jest modyfikowane przez jedną lub więcej PTM. Badanie profilu PTM dla PD-L1 zostało niedawno przeprowadzone przy użyciu tej techniki, a wyniki wykazały, że w odpowiedzi na EGF białko PD-L1 uległo ubikwitynacji, acetylacji i fosforylacji tyrozyny (Rysunek 4). Co istotne, dane te dotyczyły zmian PTM endogennego PD-L1, który stanowił niewielki procent całkowitej ilości zidentyfikowanego PD-L1.
<img alt="Proces oczyszczania DNA z wykorzystaniem metody filtracji strzykawkowej; etapy eksperymentu z użyciem dłoni w rękawiczkach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Filtrowanie genomowego DNA z lizatu komórkowego za pomocą filtra BlastR. (A) Zdjęcie filtra BlastR. (B) Lizat naniesiono na filtr umieszczony w probówce zbiorczej o pojemności 15 ml. (C) Tłok zostaje umieszczony w strzykawce, a lizat jest przepuszczany przez filtr poprzez wywieranie nacisku. (D) Należy zebrać lizat, w tym wszelkie pęcherzyki powietrza, poprzez całkowite ściśnięcie. (E) Przefiltrowany lizat.
<img alt="Analiza western blot; markery białkowe w komponentach komórkowych (A) oraz analiza immunoblotowa SUMO2/3 (B)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Porównanie buforu lizującego BlastR z alternatywnymi buforami lizującymi. Rysunek 2A opracowano na podstawie Hority i wsp. 2017. Biosci. Rep.31 (A) Komórki A431 poddano lizie z użyciem buforów: BlastR, RIPA, mPER, buforu do immunoprecypitacji (IP), denaturującego (1% SDS) oraz buforu Laemmliego. Z wszystkich lizatów denaturujących usunięto genomowe DNA przy użyciu filtra BlastR. Izolację białek z markerów błonowych, cytoplazmatycznych, mitochondrialnych i jądrowych określono z użyciem przeciwciał przeciwko odpowiednim białkom markerowym poszczególnych przedziałów komórkowych. (B) Komórki A431 poddano lizie z zastosowaniem buforu BlastR, RIPA oraz denaturującego buforu z 1% SDS. Lizaty poddano immunoprecypitacji przy użyciu kulek powinowactwa z przeciwciałem anty-SUMO 2/3 lub kontrolnego przeciwciała IgG. Próbki rozdzielono metodą SDS-PAGE i przeanalizowano za pomocą western blottingu, wykorzystując przeciwciało anty-SUMO 2/3 sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP). Przedstawiono reprezentatywne bloty z N≥3 niezależnych eksperymentów. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56912/56912fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej; rozdzielanie DNA i białek; markery kilobazowe i kDa; metody filtracji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Filtr lizujący BlastR skutecznie usuwa DNA genomiczne. (A) Komórki A431 poddano lizie w denaturującym buforze lizującym. DNA genomiczne usunięto lub pofragmentowano za pomocą filtra BlastR, igły strzykawki lub sonikacji przez 5, 10, 20 lub 30 sekund. 2% lizatu przeanalizowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym z użyciem bromku etydyny. (B) Lizat z komórek A431, poddanych lizie w buforze denaturującym, pozostawiono bez filtrowania lub przefiltrowano za pomocą filtra BlastR. Próbki rozdzielono metodą SDS-PAGE i zwizualizowano przy użyciu barwienia Coomassie. (C) Powielone próbki z grupy B rozdzielono metodą SDS-PAGE, przeniesiono na membranę PVDF, a następnie badano poziom białka EGFR z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko EGFR. Przedstawiono reprezentatywne bloty z N ≥3 niezależnych eksperymentów. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56912/56912fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunoblot wykazujący ekspresję PD-L1; analiza kompleksu przeciwciało-białko G; wyniki rozdziału białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wykrywanie indukowanych przez EGF modyfikacji potranslacyjnych białka PD-L1. Rysunek opracowany na podstawie publikacji Hority i in. 2017. Nowotwór30 (A)Komórki A431 z ograniczoną podażą surowicy pozostawiono bez stymulacji (UT) lub stymulowano EGF przez jedną godzinę przed lizą za pomocą buforu lizującego BlastR. WCL analizowano pod kątem poziomu PD-L1 (ścieżki 1, 2). Do immunoprecypitacji (IP) białek ubikwitynowanych zastosowano kulek wiążących ubikwitynę (UBA01) (ścieżki 3, 4). Do IP białek fosforylowanych po tyrozynie zastosowano kulki wiążące fosfotyrozynę (APY03) (ścieżki 5, 6). Do IP białek sumoilowanych 2/3 zastosowano kulki wiążące SUMO 2/3 (ASM24) (ścieżki 7, 8). Do IP białek acetylowanych zastosowano kulki wiążące acetylowaną lizynę (AAC01) (ścieżki 9, 10). Kontrolne kulki wiążące IgG zastosowano do IP białek wiążących niespecyficznie (ścieżki 1, 12). Próbki rozdzielono metodą SDS-PAGE i analizowano za pomocą western blotu z użyciem przeciwciała przeciwko PD-L1. Przedstawiono reprezentatywny blot z N ≥3 niezależnych eksperymentów. Białe gwiazdki posłużyły do zaznaczenia prążków białka PD-L1 pY oraz Ac. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56912/56912fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Obliczenia dla buforu lizującego BlastR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1,0 ml</td>
			<td>2,0 ml</td>
			<td>5,0 ml</td>
			<td>10,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor lizujący BlastR</td>
			<td>965 µL</td>
			<td>1930 µL</td>
			<td>4,825 ml</td>
			<td>9,650 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor fosfatazy tyrozynowej</td>
			<td>5 µL</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>25 µL</td>
			<td>50 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inhibitor deubikwitinazy/desumoilazy</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>20 µL</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>100 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inhibitor HDAC</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>20 µL</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>100 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koktajl inhibitorów proteaz</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>20 µL</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>100 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Obliczenia dla buforu rozcieńczającego BlastR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4,0 ml</td>
			<td>8,0 ml</td>
			<td>20,0 ml</td>
			<td>40,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor lizujący BlastR</td>
			<td>3,86 ml</td>
			<td>7,72 ml</td>
			<td>19,3 ml</td>
			<td>38,6 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor fosfatazy tyrozynowej</td>
			<td>20 µL</td>
			<td>40 µL</td>
			<td>100 µL</td>
			<td>200 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inhibitor deubikwitinazy/desumoilazy</td>
			<td>40 µL</td>
			<td>80 µL</td>
			<td>200 µL</td>
			<td>400 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inhibitor HDAC</td>
			<td>40 µL</td>
			<td>80 µL</td>
			<td>200 µL</td>
			<td>400 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koktajl inhibitorów proteaz</td>
			<td>40 µL</td>
			<td>80 µL</td>
			<td>200 µL</td>
			<td>400 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Schemat przygotowania buforu do lizy i rozcieńczeń. Schemat zawierający stężenia inhibitorów, które należy dodać dla danej objętości buforu do lizy i rozcieńczeń podczas przygotowywania buforów do lizy komórek.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zawartość białka na płytce</td>
			<td>Zalecana objętość buforu do lizy BlastR</td>
			<td>Zalecana objętość buforu do rozcieńczania BlastR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&lt; 1 mg</td>
			<td>Łączenie białek z wielu płytek</td>
			<td>Aby uzyskać objętość końcową 1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-2 mg</td>
			<td>300 µL</td>
			<td>Aby uzyskać objętość końcową 1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-4 mg</td>
			<td>600 µL</td>
			<td>Aby uzyskać objętość końcową 3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-6 mg</td>
			<td>900 µL</td>
			<td>Aby uzyskać objętość końcową 4,5 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Tabela buforów do lizy/rozcieńczania BlastR. Tabela zawierająca zalecane objętości buforów do lizy i rozcieńczania podczas pozyskiwania lizatu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Objętość lizatu komórkowego dodana do 1 ml odczynnika Precision Red Protein Assay (µL)</td>
			<td >Mnożnik do zastosowania przy odczycie OD60próbki</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10</td>
			<td >10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20</td>
			<td >5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30</td>
			<td >3.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40</td>
			<td >2.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50</td>
			<td >2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Mnożniki do przeliczenia odczytów spektrofotometrycznych na mg/mL lizatu. Tabela zawierająca wartości przeliczeniowe wspomagające obliczanie stężenia białka.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>perełki powinowactwa</td>
			<td>objętość zawiesiny kulek/IP (ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubikwitynacja</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fosfotyrozyna</td>
			<td>30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sumoilacja 2/3</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylacja</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kulki kontrolne</td>
			<td>objętość zawiesiny kulek/IP (ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kuleczki kontrolne do ubikwitynacji</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kuleczki kontrolne z fosfotyrozyną</td>
			<td>30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kuleczki kontrolne do sumorylacji 2/3</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kuleczki do kontroli acetylacji</td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Wykres zalecanej objętości kulek/IP. Wykres zawierający zalecane ilości kulek powinowactwa do zastosowania w jednej reakcji IP.

Badanie wielu, endogennych modyfikacji potranslacyjnych dla docelowego białka może być niezwykle trudne. Opisane tutaj techniki wykorzystują zoptymalizowany bufor do lizy i system filtrów opracowany ze specyficznymi matrycami powinowactwa do kierowania PTM, do wykrywania modyfikacji acetylacji, ubikwitynacji, SUMOylacji 2/3 i fosforylacji tyrozyny dla białka docelowego przy użyciu jednego, usprawnionego systemu.

Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Ogólnym celem tego eksperymentalnego protokołu jest umożliwienie niedoświadczonym badaczom PTM skutecznego określenia, czy ich docelowe białko jest endogennie modyfikowane przez jeden lub więcej PTM przy użyciu jednego kompleksowego systemu. Metoda ta przyczyni się do usprawnienia badań nad polem modyfikacji potranslacyjnej, umożliwiając wykrywanie kluczowych PTM i potencjalnych przesłuchów dla dowolnego białka docelowego przy użyciu pojedynczego, uproszczonego systemu. Główną zaletą tej techniki jest to, że eksperci niebędący specjalistami od PTM mogą wykryć, czy białko jest endogennie modyfikowane przez jeden lub więcej PTM w ich systemie modelowym.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody podczas badania mechanizmów regulacyjnych dla kilku szlaków sygnalizacji komórkowej i odkryliśmy, że nasze przyjazne dla użytkownika zestawy lub systemy nie są tak naprawdę dostępne do badania PTM bez fospu. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania komórek A431, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Należy również przygotować lizę blastera w rozcieńczających z inhibitorami.Odlej pożywkę hodowlaną i umieść komórki na lodzie. Następnie umyj komórki dwukrotnie 10 mililitrami 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Usuń jak najwięcej PBS przed dodaniem buforu do lizy blastera, aby zmaksymalizować lizę komórek.Dodaj 600 mikrolitrów buforu do lizy blastera do każdej 150-milimetrowej płytki. Ilość bufora zależy od oczekiwanego uzysku białka. Następnie zlizuj komórki za pomocą skrobaka do komórek.Lisat stanie się lepki z powodu lizy jądrowej. Użyj odciętej jednomilimetrowej końcówki pipety, aby przenieść surowy lizat do filtra blastera, który został umieszczony w 15-mililitrowej probówce zbiorczej. Użyj dostarczonego tłoka filtra, aby całkowicie skompresować filtr blastera i zebrać przepływający lizat, w tym wszelkie pęcherzyki, w 15-mililitrowej probówce.Prosty, wydajny filtr blasterowy usuwa genomowe DNA, zamiast go ścinać, jak ma to miejsce w przypadku innych powszechnie stosowanych metod. Rozcieńczyć oczyszczony lizat buforem rozcieńczającym do obróbki strumieniowo-ściernej do końcowej objętości trzech mililitrów na każdą 150 milimetrową płytkę. Ostateczna objętość zależy od oczekiwanej wydajności białka.Ten krok jest ważny, ponieważ ostateczny skład buforu wpłynie na rygorystyczność reakcji wytrącania aminokwasów. Następnie należy przygotować test ilościowy białka, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zmierzyć absorbancję próbki lizatu przy 600 nanometrach i obliczyć stężenie białka.Odwróć kilkakrotnie probówkę z odczynnikiem podstawowym, aby upewnić się, że kulki są całkowicie ponownie zawieszone w probówce. Dla każdego testu IP podwielokrotną zawiesinę kulek należy podzielić na oddzielne mikroprobówki wirówkowe o pojemności 1,5 mililitra na lodzie. Tutaj dodaj 20 mikrolitrów kulek powinowactwa ubikwityny, 30 mikrolitrów kulek powinowactwa fosfotyrozyny, 40 mikrolitrów kulek powinowactwa SUMOylation 2/3 lub 50 mikrolitrów kulek powinowactwa do acetylacji do poszczególnych probówek mikrowirówek.Kilkakrotnie odwróć probówki z odczynnikami zawierającymi kulki kontrolne ubikwitynacji IP i kulki kontrolne IGG, aby upewnić się, że kulki są całkowicie ponownie zawieszone w probówce. Następnie podwielokrotnić kulki kontrolne na reakcję kontrolną, aby określić niespecyficzne wiązanie. Tutaj dodaj 20 mikrolitrów kulek kontrolnych ubikwityny, 30 mikrolitrów kulek kontrolnych fosfotyrozyny, 40 mikrolitrów kulek kontrolnych SUMOylation 2/3 lub 50 mikrolitrów kulek kontrolnych acetylacji do pojedynczych 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówek na lodzie.Zaoszczędź 20 mikrolitrów lizatu, aby działać jako kontrola lizatu wejściowego Western Blot. Dodaj pięć mikrolitrów 5x buforu do próbki do zarezerwowanego lizatu i gotuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj lizat do każdej rurki IP i kontroluj rurkę IP.W tym przypadku użyto jednego miligrama lizatu na IP i reakcję kontrolną, co dało w sumie osiem reakcji IP. inkubować probówki na końcu i obracającej się platformie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po inkubacji zebrać kulki przez odwirowanie w temperaturze od trzech do 5 000 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odessać jak najwięcej supernatantu bez naruszania kulek, a następnie umyć kulki w jednym mililitrze buforu do płukania blastera przez pięć minut na platformie obrotowej o temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać kulki przez odwirowanie, jak poprzednio. Po odwirowaniu odessać jak najwięcej supernatantu bez naruszania kulek i powtórzyć etap mycia jeszcze dwa razy. Po końcowym płukaniu i odwirowaniu, odessać większość do supernatantu buforowego, a następnie usunąć pozostały supernatant za pomocą końcówki ładującej białko o drobnym otworze.Dopuszczalne jest minimalne zakłócenie granulki kulki. Upewnij się, że cały bufor płuczący został usunięty, jednocześnie minimalizując zakłócenia w granulce ubijania, aby zmaksymalizować odzysk białek PTM. Następnie dodaj 30 mikrolitrów buforu elucyjnego do perełek i ponownie zawieś kulki, delikatnie stukając lub przesuwając bok probówki.Na tym etapie nie należy używać pipety. Inkubować zawieszone kulki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odetnij koniec końcówki pipety transferowej i delikatnie przenieś zawiesinę każdej kulki do 1,5-mililitrowej mikrowirówki, która została umieszczona w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej.Odwirować próbkę w temperaturze od 9 do 10 000 G od jednej minuty w temperaturze pokojowej w celu zebrania próbki IP, a następnie dodać dwa mikrolitry 2-merkaptoetanolu do każdej próbki i dobrze wymieszać. Umieść próbki w łaźni wodnej o temperaturze 95 stopni Celsjusza na pięć minut. Po inkubacji pobrać próbkę przez odwirowanie w temperaturze 10 000 razy G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.Na koniec przejdź do uruchomienia SDS PAGE, transferu i analizy western blot zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Nieleczony i traktowany EGF lizat komórkowy A431 dodano do ubikwityny, fosfotyrozyny, SUMO 2/3 i kulek powinowactwa do acetylolizyny. Przeciwciało PD-L1 wykorzystano do analizy zachodnich immunoblot w celu ustalenia, czy białko PD-L1 zostało zmodyfikowane przez te cztery PTM w odpowiedzi na stymulację EGF.Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki wskazują, że metoda ta skutecznie identyfikuje endogenne modyfikacje PTM PD-L1. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech do 4 1/2 godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykrywać enogenny PTM lub przesłuch dla docelowego białka lub szlaku sygnałowego, korzystając z tego kompleksowego systemu wykrywania PTM.

utilizing-comprehensive-immunoprecipitation-enrichment-system-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Opisujemy tutaj protokół oczyszczania i charakterystyki kompleksów białek roślinnych. Pokazujemy to, immunoprecypitując pojedyncze białko w kompleksie, dzięki czemu możemy zidentyfikować jego modyfikacje potranslacyjne i oddziałujących partnerów.

Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Ustaliliśmy metodę oczyszczania białek interakcji koregulacyjnych za pomocą systemu LC-MS/MS.

Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Interakcje białko-białko są ważne dla wyjaśnienia funkcji docelowych białek, a koimmunoprecypitacja (co-IP) może łatwo potwierdzić IPP. Przejściowo transfekowaliśmy plazmid kodujący białko znakowane epitopem do komórek HEK-293 i opracowaliśmy metodę immunoprecypitacji, aby łatwo potwierdzić wiązanie dwóch białek docelowych.

Immunoprecypitacja za pomocą żelu powinowactwa do znaczników antyepitopowych w celu zbadania interakcji białko-białko

Poznaj uproszczoną metodę wykrywania endogennych modyfikacji potranslacyjnych białek docelowych w komórkach A431. System umożliwia jednoczesną detekcję acetylacji, ubikwitynacji, SUMOylacji i fosforylacji tyrozynowej.

Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych

Przeglądaj więcej filmów