Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych

Ogólnym celem tego eksperymentalnego protokołu jest umożliwienie niedoświadczonym badaczom PTM skutecznego określenia, czy ich docelowe białko jest endogennie modyfikowane przez jeden lub więcej PTM przy użyciu jednego kompleksowego systemu. Metoda ta przyczyni się do usprawnienia badań nad polem modyfikacji potranslacyjnej, umożliwiając wykrywanie kluczowych PTM i potencjalnych przesłuchów dla dowolnego białka docelowego przy użyciu pojedynczego, uproszczonego systemu. Główną zaletą tej techniki jest to, że eksperci niebędący specjalistami od PTM mogą wykryć, czy białko jest endogennie modyfikowane przez jeden lub więcej PTM w ich systemie modelowym.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody podczas badania mechanizmów regulacyjnych dla kilku szlaków sygnalizacji komórkowej i odkryliśmy, że nasze przyjazne dla użytkownika zestawy lub systemy nie są tak naprawdę dostępne do badania PTM bez fospu. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania komórek A431, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Należy również przygotować lizę blastera w rozcieńczających z inhibitorami.

Odlej pożywkę hodowlaną i umieść komórki na lodzie. Następnie umyj komórki dwukrotnie 10 mililitrami 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Usuń jak najwięcej PBS przed dodaniem buforu do lizy blastera, aby zmaksymalizować lizę komórek.

Dodaj 600 mikrolitrów buforu do lizy blastera do każdej 150-milimetrowej płytki. Ilość bufora zależy od oczekiwanego uzysku białka. Następnie zlizuj komórki za pomocą skrobaka do komórek.

Lisat stanie się lepki z powodu lizy jądrowej. Użyj odciętej jednomilimetrowej końcówki pipety, aby przenieść surowy lizat do filtra blastera, który został umieszczony w 15-mililitrowej probówce zbiorczej. Użyj dostarczonego tłoka filtra, aby całkowicie skompresować filtr blastera i zebrać przepływający lizat, w tym wszelkie pęcherzyki, w 15-mililitrowej probówce.

Prosty, wydajny filtr blasterowy usuwa genomowe DNA, zamiast go ścinać, jak ma to miejsce w przypadku innych powszechnie stosowanych metod. Rozcieńczyć oczyszczony lizat buforem rozcieńczającym do obróbki strumieniowo-ściernej do końcowej objętości trzech mililitrów na każdą 150 milimetrową płytkę. Ostateczna objętość zależy od oczekiwanej wydajności białka.

Ten krok jest ważny, ponieważ ostateczny skład buforu wpłynie na rygorystyczność reakcji wytrącania aminokwasów. Następnie należy przygotować test ilościowy białka, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zmierzyć absorbancję próbki lizatu przy 600 nanometrach i obliczyć stężenie białka.

Odwróć kilkakrotnie probówkę z odczynnikiem podstawowym, aby upewnić się, że kulki są całkowicie ponownie zawieszone w probówce. Dla każdego testu IP podwielokrotną zawiesinę kulek należy podzielić na oddzielne mikroprobówki wirówkowe o pojemności 1,5 mililitra na lodzie. Tutaj dodaj 20 mikrolitrów kulek powinowactwa ubikwityny, 30 mikrolitrów kulek powinowactwa fosfotyrozyny, 40 mikrolitrów kulek powinowactwa SUMOylation 2/3 lub 50 mikrolitrów kulek powinowactwa do acetylacji do poszczególnych probówek mikrowirówek

Kilkakrotnie odwróć probówki z odczynnikami zawierającymi kulki kontrolne ubikwitynacji IP i kulki kontrolne IGG, aby upewnić się, że kulki są całkowicie ponownie zawieszone w probówce. Następnie podwielokrotnić kulki kontrolne na reakcję kontrolną, aby określić niespecyficzne wiązanie. Tutaj dodaj 20 mikrolitrów kulek kontrolnych ubikwityny, 30 mikrolitrów kulek kontrolnych fosfotyrozyny, 40 mikrolitrów kulek kontrolnych SUMOylation 2/3 lub 50 mikrolitrów kulek kontrolnych acetylacji do pojedynczych 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówek na lodzie.

Zaoszczędź 20 mikrolitrów lizatu, aby działać jako kontrola lizatu wejściowego Western Blot. Dodaj pięć mikrolitrów 5x buforu do próbki do zarezerwowanego lizatu i gotuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj lizat do każdej rurki IP i kontroluj rurkę IP.

W tym przypadku użyto jednego miligrama lizatu na IP i reakcję kontrolną, co dało w sumie osiem reakcji IP. inkubować probówki na końcu i obracającej się platformie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po inkubacji zebrać kulki przez odwirowanie w temperaturze od trzech do 5 000 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odessać jak najwięcej supernatantu bez naruszania kulek, a następnie umyć kulki w jednym mililitrze buforu do płukania blastera przez pięć minut na platformie obrotowej o temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać kulki przez odwirowanie, jak poprzednio. Po odwirowaniu odessać jak najwięcej supernatantu bez naruszania kulek i powtórzyć etap mycia jeszcze dwa razy. Po końcowym płukaniu i odwirowaniu, odessać większość do supernatantu buforowego, a następnie usunąć pozostały supernatant za pomocą końcówki ładującej białko o drobnym otworze.

Dopuszczalne jest minimalne zakłócenie granulki kulki. Upewnij się, że cały bufor płuczący został usunięty, jednocześnie minimalizując zakłócenia w granulce ubijania, aby zmaksymalizować odzysk białek PTM. Następnie dodaj 30 mikrolitrów buforu elucyjnego do perełek i ponownie zawieś kulki, delikatnie stukając lub przesuwając bok probówki.

Na tym etapie nie należy używać pipety. Inkubować zawieszone kulki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odetnij koniec końcówki pipety transferowej i delikatnie przenieś zawiesinę każdej kulki do 1,5-mililitrowej mikrowirówki, która została umieszczona w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej.

Odwirować próbkę w temperaturze od 9 do 10 000 G od jednej minuty w temperaturze pokojowej w celu zebrania próbki IP, a następnie dodać dwa mikrolitry 2-merkaptoetanolu do każdej próbki i dobrze wymieszać. Umieść próbki w łaźni wodnej o temperaturze 95 stopni Celsjusza na pięć minut. Po inkubacji pobrać próbkę przez odwirowanie w temperaturze 10 000 razy G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.

Na koniec przejdź do uruchomienia SDS PAGE, transferu i analizy western blot zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Nieleczony i traktowany EGF lizat komórkowy A431 dodano do ubikwityny, fosfotyrozyny, SUMO 2/3 i kulek powinowactwa do acetylolizyny. Przeciwciało PD-L1 wykorzystano do analizy zachodnich immunoblot w celu ustalenia, czy białko PD-L1 zostało zmodyfikowane przez te cztery PTM w odpowiedzi na stymulację EGF.

Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki wskazują, że metoda ta skutecznie identyfikuje endogenne modyfikacje PTM PD-L1. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech do 4 1/2 godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykrywać enogenny PTM lub przesłuch dla docelowego białka lub szlaku sygnałowego, korzystając z tego kompleksowego systemu wykrywania PTM.