Name: Zliczanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Poznaj metodę zliczania ludzkich komórek macierzystych nerwowych przy użyciu hemocytometru i barwnika trypanowego. Technika ta pozwala odróżnić żywe komórki od martwych, co jest kluczowe dla prawidłowego przygotowania eksperymentów w kulturze tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dr. Philipowi H. Schwartzowi z National Human Neural Stem Cell Resource w Children s Hospital, Orange County Research Institute za udostępnienie kultur hNSPC.

Pasażowanie ludzkich komórek macierzystych neuronów
Uwaga: W celu uzyskania informacji na temat odrywania i resuspensji komórek należy zapoznać się z artykułem <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=263">Passaging Human Neural Stem Cells</a>. https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263
Przygotowanie zawiesiny komórkowej do liczenia
<ol>
<li>Do probówki typu Eppendorf wlać 25 µl 0,4% roztworu błękitu trypanowego oraz 20 µl pożywki komórkowej.</li>
<li>Resuspendować komórki przeznaczone do zliczenia, delikatnie stukując probówkę z komórkami znajdującymi się w znanej objętości pożywki, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Do probówki typu Eppendorf z poprzedniego kroku przenieść 5 µl zawiesiny komórkowej. Ten etap pozwala na rozcieńczenie stężenia komórek dziesięciokrotnie.</li>
<li>Umieścić szkiełko nakrywkę na hemocytometrze i nanieść około 11-12 µl zawiesiny komórkowej. <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_4/262_Figure-01.png" alt="Schemat hemocytometru; widok z góry i z boku do liczenia komórek z obszarami siatki i głębokością próbki 0,1 mm." width="511" height="139" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="262_Figure-01"> </li>
</ol>
Zliczanie komórek w hemocytometrze
<ol>
<li>Przejrzyj całą siatkę komory countingową (hemacytometru) pod mikroskopem fazokontrastowym. Skup się na jednym kwadracie siatki (np. zaznaczonym na czerwono). <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_5/262_Figure-02.png" alt="Schemat siatki hemacytometru z powiększeniem dla liczenia komórek, szczegóły rozmiaru kwadratu." width="492" height="278" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="262_Figure-02"> </li>
<li>Martwe lub obumierające komórki będą miały niebieski kolor, ponieważ ich błony zostały uszkodzone i nie są w stanie wykluczyć barwnika Trypan blue. Komórki żywe nie będą niebieskie i w kontraście fazowym będą otoczone jasną „aureolą” (będą „fazowo jasne”). </li>
<li>Policz liczbę żywych komórek w jednym kwadracie (obszar 1 mm2). Żywotność komórek można również określić, dzieląc liczbę komórek żywych przez całkowitą liczbę komórek. Policz komórki w 3-4 losowych kwadratach i wyznacz średnią liczbę komórek na kwadrat. Ponieważ objętość kwadratu wynosi 10-4 ml lub 0,1 µl, można wyznaczyć stężenie komórek <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_6/262_Figure-03.png" alt="Konfiguracja liczenia komórek; wzór: objętość kwadratu, czynnik rozcieńczenia; schemat hemacytometru." width="741" height="165" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="262_Figure-03"> </li>
<li>Można skorzystać z poniższego uproszczenia w celu wyznaczenia liczby komórek/µl: <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_7/262_Figure-04.png" alt="Schemat wzoru obliczeniowego stężenia komórek, liczba komórek/kwadrat x10 x10=liczba komórek/µl" width="368" height="69" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="262_Figure-04"> Całkowita liczba komórek w probówce = liczba komórek/µl X µl w probówce</li>
</ol>

<ol><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+Hemacytometer%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Using a Hemacytometer.</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3</a> (2008).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Chamber+%28Hemacytometer%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Counting Chamber (Hemacytometer).</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
</a> (2008).</li>
</ol>

Niniejszy protokół opisuje prosty i szybki sposób określania stężenia komórek dla różnych eksperymentów z wykorzystaniem komórek. Stosując metodę skróconą opisaną w punkcie 3d, można szybko i precyzyjnie wyznaczyć stężenie komórek oraz całkowitą liczbę komórek w danej objętości.

<table><tbody><tr><td>Hemacytometr do kontrastu fazowego</td><td>Narzędzie</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Dystrybuowane przez Fisher pod wskazanym numerem katalogowym</td></tr><tr><td>Barwnik Trypan Blue 0,4%</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Dystrybuowane przez Invitrogen pod wskazanym numerem katalogowym</td></tr></tbody></table>

liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych

Counting Human Neural Stem Cells

Znajomość dokładnej liczby żywych komórek w określonej objętości zawiesiny komórkowej jest niezbędna przy wielu rutynowych manipulacjach w hodowlach tkankowych, takich jak wysiew komórek do immunocytochemii lub transfekcji. Niniejszy protokół opisuje prostą i szybką metodę różnicowania komórek żywych od martwych oraz określania stężenia komórek i ich całkowitej liczby przy użyciu komory licznikowej (hemacytometru). Procedura ta wymaga w pierwszej kolejności odseparowania komórek od powierzchni wzrostu i ponownego zawieszenia ich w medium. Następnie komórki rozcieńcza się w roztworze błękitu Trypanu (najlepiej do stężenia dającego 20-50 komórek na kwadrat) i nanosi do komory licznikowej. Na koniec, poprzez wyciągnięcie średniej z liczby żywych komórek w kilku losowo wybranych kwadratach, podzielenie tej średniej przez objętość jednego kwadratu o powierzchni 1 mm2 (0,1 μl) i pomnożenie przez czynnik rozcieńczenia, otrzymuje się liczbę komórek na l. Pomnożenie tego stężenia komórek przez całkowitą objętość w μl pozwala wyznaczyć całkowitą liczbę komórek. Protokół ten opisuje liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPCs), ale można go zastosować również do wielu innych typów komórek.

Znajomość dokładnej liczby żywych komórek jest niezbędna przy wielu manipulacjach w hodowlach tkankowych. Niniejszy protokół opisuje sposób rozróżniania komórek żywych od martwych oraz ilościowego oznaczania komórek przy użyciu hemacytometru. Choć opisano w nim liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPCs), można go zastosować również do innych typów komórek.

Liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych

Znajomość dokładnej liczby żywych komórek w danej objętości zawiesiny komórkowej jest niezbędna do wielu rutynowych czynności z zakresu hodowli tkanek, takich jak ...

W tej części pokażę Państwu, jak zliczać ludzkie komórki prekursorowe neuronów. Zliczanie komórek jest konieczne przed ich przygotowaniem do immunocytochemii lub w przypadku przeprowadzenia transfekcji za pomocą nukleofektora. Używam hemocytometru z kontrastem fazowym, który posiada siatkę pomiarową, a także barwnika o nazwie błękit trypanu. Barwnik ten jest przydatny, ponieważ pozwala odróżnić komórki żywe od martwych.Martwe lub obumierające komórki pochłaniają ten barwnik i wykazują niebieskie zabarwienie. Podczas obserwacji komórek w hematometrze komórki żywe są w stanie wykluczyć ten barwnik i nie barwią się na niebiesko. W ten sposób można określić żywotność komórek, przygotowując roztwór błękitu trypanu w medium.Do tej probówki typu epi o pojemności 0,5 ml dodam 20 µL roztworu trypanu i błękitu. Następnie dodam 25 µL pożywki. W ten sposób mam obecnie 45 µL roztworu trypanu, błękitu i pożywki, dzięki czemu po dodaniu 5 µL zawiesiny komórkowej uzyskam rozcieńczenie 1:10.W związku z tym dodam teraz 5 µL zawiesiny komórkowej. Najpierw upewnię się, że komórki zostały dobrze resuspensowane poprzez delikatne potrząsanie opuszkami palców. Chcę teraz upewnić się, że roztwór jest dobrze wymieszany.W związku z tym będę kilkukrotnie przesuwać zespół z próbkami w górę i w dół. Na koniec naniosę około 12 µL tej zawiesiny komórkowej do hemocytometru. Posiada on dwa otwory i można skorzystać z dowolnego z nich.Wystarczy zatem wprowadzić roztwór przez ten port, a ciecz zostanie zassana dzięki działaniu kapilarnemu. Teraz mogę przystąpić do liczenia. Oto widok komory Bürchera przy powiększeniu 10x; widzimy tutaj kwadrant zawierający 16 pól.Jak widać, możemy tutaj zaobserwować komórki żywe i martwe. Tutaj mamy komórki żywe, takie jak ta, ta i ta. Mamy również niektóre komórki martwe, na przykład tę.Jak widać, martwa komórka jest ciemnoniebieska, natomiast żywe komórki są otoczone swoistym ореolem. Teraz policzę wszystkie żywe komórki, przesuwając się od lewej do prawej i od góry do dołu.1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Zatem w tej ćwiartce mamy łącznie trzydzieści sześć komórek. Aby zachować spójność, komórki znajdujące się na granicy ćwiartki, na przykład wzdłuż tej linii tutaj, liczę jako znajdujące się na lewej i górnej krawędzi.Konsekwentnie zliczam komórki na tych krawędziach dla wszystkich kwadrantów komory licznikowej. Teraz obliczymy, ile komórek mamy na mikrolitr. W tym celu wyciągnę średnią liczbę komórek na kwadrant, która wynosi 38, i pomnożę ją przez 10, czyli współczynnik wynikający z wymiarów komory.Następnie pomnożymy wynik przez 10, co w tym przypadku jest naszym współczynnikiem rozcieńczenia. W rezultacie otrzymamy liczbę komórek na mikrolitr. W tym przypadku jest to 3 800 komórek na mikrolitr.Ponieważ zawiesiliśmy osad komórkowy w 500 µL roztworu, można obliczyć całkowitą liczbę komórek. To wszystko.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zliczanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych

Wprowadzenie interesującego genu do komórki jest potężną metodą wyjaśniania jego funkcji in vivo. Niniejszy protokół opisuje wydajną metodę transfekcji hodowli ludzkich neuralnych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPCs) przy użyciu aparatu do elektroporacji Nucleofector firmy Amaxa.

Transfekcja ludzkich neuralnych komórek macierzystych za pomocą nukleofektora Amaxa

Zdolność do manipulowania ludzkimi komórkami macierzystymi/prekursorowymi neuronów (hNSPCs) in vitro pozwala badać ich przydatność jako przeszczepów komórkowych do celów terapeutycznych oraz zgłębiać proces rozwoju ludzkiego układu nerwowego. Niniejszy protokół przedstawia metodę hodowli i pasażowania hNSPCs w celu zwiększenia powtarzalności badań nad ludzkimi komórkami macierzystymi.

Pasażowanie ludzkich neuralnych komórek macierzystych

Immunocytochemia jest potężną metodą pozwalającą określić obecność, lokalizację subkomórkową oraz względną obfitość interesującego antygenu w hodowlach komórkowych. Niniejszy protokół przedstawia łatwą do naśladowania serię kroków, które umożliwią oszczędność przeciwciał i zoptymalizują proces barwienia.

Immunocytochemia: ludzkie neuralne komórki macierzyste

Niniejszy protokół wideo demonstruje sposób rozróżniania i zliczania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego w mieszanej populacji komórek prekursorowych układu nerwowego z wykorzystaniem testu tworzenia kolonii neuronalnych.

Test tworzenia kolonii neuronalnych: metoda różnicowania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego od komórek progenitorowych układu nerwowego

Opisano prostą i niezawodną metodę izolacji oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych z odrzuconej ludzkiej tkanki kory płodowej. Hodowle pochodzące z rozpoznanych neurologicznych schorzeń człowieka mogą być wykorzystywane do charakteryzacji patologicznych procesów komórkowych i molekularnych, a także stanowić platformę do oceny skuteczności farmakologicznej.

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Ten protokół opisuje nowatorską metodę mechanicznego siekania, która pozwala na ekspansję sferycznych agregatów nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych bez dysocjacji do zawieszenia pojedynczej komórki. Utrzymanie kontaktu komórka/komórka pozwala na szybki i stabilny wzrost przez ponad 40 przejść.

Metoda ekspansji stosowana do cGMP dla agregatów ludzkich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki mózgowej płodu

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Rdzeń kręgowy dorosłego ssaka zawiera nerwowe komórki macierzyste/progenitorowe (NSPC), które mogą być izolowane i rozwijane w hodowli. Protokół ten opisuje pobieranie, izolację, hodowlę i pasażowanie NSPC generowanych z obszaru okołokomorowego dorosłego rdzenia kręgowego od szczura i od dawców narządów po przeszczepie.

Izolacja nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z obszaru okołokomorowego dorosłego szczura i ludzkiego rdzenia kręgowego

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) odnoszą się do komórek, które mogą samoodnawiać się i różnicować w trzy linie nerwowe. W tym miejscu opisujemy protokół określania częstości NSC w danej populacji komórek za pomocą tworzenia i różnicowania neurosfery w warunkach klonalnych.

Liczenie nerwowych komórek macierzystych za pomocą testów klonalnych

Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do analizy zachowania dorosłych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w odpowiedzi na manipulację chemogenetyczną specyficznego lokalnego obwodu neuronowego.

Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

Poznaj metodę zliczania ludzkich komórek macierzystych nerwowych przy użyciu hemocytometru i barwnika trypanowego. Technika ta pozwala odróżnić żywe komórki od martwych, co jest kluczowe dla prawidłowego przygotowania eksperymentów w kulturze tkankowej.

Liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów