Pasażowanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych

Cześć, jestem Steve. Pracuję w laboratorium doktora Flanagana na Wydziale Patologii Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine. Dzisiaj pokażę Ci, jak podzielić ludzkie neuronalne komórki prekursorowe.

Technika ta polega na kodowaniu nowej kolby roztworem ludzkiej fibronektyny, podnoszeniu komórek za pomocą buforu dysocjacji komórek, a następnie neutralizowaniu buforu dysocjacji komórek 10% roztworem surowicy, centryfuzji zawiesiny komórek i resusowaniu zawiesiny komórek w świeżej, pożywce i przeniesieniu zawiesiny komórek do nowej kolby. W naszym laboratorium hodujemy ludzkie neuronalne komórki prekursorowe, zmieniając połowę ich pożywki co drugi dzień, a następnie przechodzimy przez nie mniej więcej raz w tygodniu, dzieląc jedną do dwóch. Kiedy przechodzę przez komórki, mogę je policzyć, jeśli chcę je wymienić na eksperyment immunochemiczny, czy jeśli chcę przeprowadzić transfekcję za pomocą efektora jądrowego.

Ważne jest, aby używać bufora dysocjacji komórek podczas pakowania komórek, ponieważ po pierwsze, jest on nieenzymatyczny, w przeciwieństwie do trypsyny, i jest znacznie łagodniejszy dla komórek. Cześć, jesteśmy teraz w pomieszczeniu do hodowli tkankowych i zanim pokażę wam, jak wygląda zlewająca się kolba ludzkich komórek prekursorowych, najpierw przygotuję hodowlę tkankową. Najpierw wyłączę światło UV i włączę światło oraz przepływ powietrza.

Następnie zamierzam zdezynfekować kaptur 70% etanolem, spryskując ręcznik papierowy i wycierając kaptur. Ważne jest, aby spryskać ręcznik papierowy 70% etanolem, a nie bezpośrednio wnętrze okapu, ponieważ spryskanie okapu 70% etanolem może uszkodzić filtr HEPA, co jest naprawdę drogie. Następnie zamierzam spryskać wszystkie odczynniki i instrumenty.

A na koniec zamierzam spryskać węże próżniowe i wszystko gotowe. Rzućmy okiem na te komórki. Więc te komórki wyglądają na około 80% zlewne.

Są to ludzkie nerwowe komórki prekursorowe wyizolowane z ludzkich płodów, które hodujemy w kolbach T 25. Dzielimy je mniej więcej co tydzień, od jednego do dwóch. Jestem teraz gotowy, aby przejść przez moje komórki.

Najpierw przyniosę nową kolbę T 25, którą przez cztery godziny pokrywałem ludzką fibronektyną z BD Biosciences. Usunąłem więc roztwór fibronektyny. Zamierzam przepłukać tę kolbę BBS, zanim przeniosę komórki do kolby.

A teraz zamierzam wyjąć komórki z inkubatora o temperaturze 37 stopni. Oto one. Teraz zamierzam usunąć roztwór płuczący PBS z nowej kolby, która była pokryta ludzką fibronektyną.

Zamierzam dodać dwa mililitry starej, kondycjonowanej pożywki do nowej kolby. Więc teraz muszę przepłukać moje komórki PBS, zanim będę mógł zdjąć go z powierzchni. Więc najpierw zamierzam usunąć pozostałe media, dodać około dwóch milili PBS od razu bez zwilżania komórek do wyschnięcia.

Zamierzam poczekać około dwóch minut przed usunięciem PBS i wprowadzeniem do sprzedaży bufora dysocjacyjnego, aby zdjąć sprzedaż z powierzchni flaka. Teraz zamierzam usunąć PBS i ponownie spróbuję od razu dodać bufor dysocjacji komórek, aby komórki nie wyschły. Więc dodam 1,5 milila bufora dysocjacji komórek.

I w przeciwieństwie do PBS, zamierzam dodać go bezpośrednio do komórek i postaram się pokryć jak największą powierzchnię. Przesuwam więc kolbę z boku na bok, powoli dodając ten bufor do komórek. Poczekam teraz około pięciu minut, aż komórki zaczną wychodzić na powierzchnię.

I zamierzam zostawić kolbę w temperaturze pokojowej w kapturze. Jak widać tutaj, komórki najpierw zaczynają zaokrąglać się w górę, a potem zaczynają odchodzić od powierzchni i faktycznie można zobaczyć, jak niektóre, niektóre komórki już unoszą się w powietrzu. A jeśli mocno stukniesz w kolbę z boku, pomoże im to zejść.

Minęło więc pięć minut i jak widzicie, roztwór stał się naprawdę gęsty od komórek, które wydostały się z powierzchni. A teraz zamierzam zneutralizować efekt bufora dysocjacji komórek, dodając 4,5 mililitra pożywki zawierającej surowicę. Zamierzam więc użyć 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej w pożywce D-M-E-M-F 12 i zamierzam dodać ją bezpośrednio na powierzchnię kolby, aby upewnić się, że nie pozostały żadne komórki.

Zamierzam delikatnie pipetować w górę i w dół, aby usunąć resztki komórek. A potem zamierzam przenieść roztwór komórkowy do stożkowej rurki o średnicy 15 mil. I zamierzam kręcić nim z prędkością tysiąca obrotów na minutę przez minutę.

Tak więc komórki są gotowe do wirowania i mamy tutaj piękną paletę komórek. Zamierzam usunąć pożywkę z serum bardzo, bardzo ostrożnie, nie próbując naruszyć palety. A potem zamierzam zawiesić paletę w czterech mililitrach nośnika.

Postaram się więc ponownie zawiesić osad tak, aby nie pozostały, nie pozostały grudki komórek, aby roztwór stał się jednorodny i zawierał, nie zawierał grudek. A ponieważ robię podział jeden na dwa, wezmę dwa z czterech młynów i przeniosę je do nowej kolby, która zawiera już dwa miliony pożywki kondycyjnej. Na koniec zamierzam oznaczyć kolbę typem komórki, numerem przejścia i datą.

To jest spojrzenie na komórki, przez które przechodziliśmy pół godziny temu. I jak widzicie, oni, większość z nich, przylgnęli do powierzchni i zaczęli wysyłać procesy. To wszystko ludzie.

A teraz jestem gotów do liczenia.