Name: Pasażowanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj metodę pasażowania ludzkich nerwowych komórek macierzystych (hNSPCs) w warunkach in vitro. Technika ta poprawia powtarzalność badań nad rozwojem układu nerwowego i potencjalnymi zastosowaniami terapeutycznymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy wyrażają wdzięczność dr. Philipowi H. Schwartzowi z National Human Neural Stem Cell Resource w Children's Hospital, Orange County Research Institute za udostępnienie hNSPCs oraz wstępne instrukcje dotyczące ich hodowli.

Uwaga: W przypadku rutynowego hodowania naszych hNSPCs wymieniamy od 50% do 100% pożywki co drugi dzień i zazwyczaj pasażujemy je w stosunku 1:2 raz w tygodniu. Pożywka hodowlana zawiera 20% BIT-9500, 1X antybiotyk/antybiotyk przeciwgrzybiczy oraz czynniki wzrostu (EGF, FGF i PDGF, każdy w stężeniu 40 ng/ml) w pożywce podstawowej DMEM:F12.
Przygotowanie powlekanej kolby i dysocjacja komórek
<ol>
<li>Aby przygotować nowe kolby dla pasażowanych komórek, pokryj kolby T25 warstwą 10 µg/ml ludzkiej fibronektyny w EMEM przez 4 godziny lub przez noc w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C. Bezpośrednio przed pasażowaniem komórek usuń roztwór fibronektyny i wypłucz kolby za pomocą PBS.</li>
<li>Przenieś stare „warunkowane” medium z komórek przeznaczonych do pasażowania do nowych kolb pokrytych fibronektyną (tak, aby połowę końcowej objętości medium w każdej kolbie stanowiło medium „warunkowane”). Takie warunki hodowli pomagają utrzymać komórki w stanie niezróżnicowanym.</li>
<li>Po usunięciu całego medium z komórek przeznaczonych do pasażowania, wypłucz komórki raz za pomocą PBS. Należy zadbać o to, aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek.</li>
<li>Dodaj bufor do dysocjacji komórek (CDB) bezpośrednio na komórki (1,0-1,5 ml dla kolby T25). Inkubuj komórki w buforze przez około 5 minut w temperaturze pokojowej. Delikatne opukiwanie kolby pomoże przyspieszyć odrywanie się komórek.</li>
</ol>
Wirowanie, resuspensja i wysiewanie komórek
<ol>
<li>Do kolby z odseparowanymi komórkami dodać pożywkę z surowicą (DMEM:F12 z 10% nieaktywną termicznie surowicą cielęcą) (użyć objętości ok. 3X objętości CDB). Przenieść pożywkę i komórki do probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Użyć niewielkiej objętości świeżej pożywki z surowicą, aby wypłukać kolbę i odzyskać pozostałe komórki.</li>
<li>Wirować pożywkę z komórkami przy 1000 rpm (~200xg) przez 5 minut.</li>
<li>Odssać pożywkę z surowicą i resuspenderć komórki w świeżej pożywce hodowlanej, pipetując w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórkową.</li>
<li>Przenieść połowę&nbsp;resuspenderowanych komórek do każdej nowej kolby, aby uzyskać podział 1:2. Zapisać numer nowego pasażu na kolbie.</li>
</ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell culture.</a> Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture.+Progenitor+cells+from+human+brain+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture. Progenitor cells from human brain after death.</a> Nature. 411, 42-43 (2001).</li>
<li>Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+neural+progenitor+cells+from+post-mortem+human+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex.</a> J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).</li>
</ol>

Stwierdziliśmy, że niniejszy protokół pozwala na uzyskanie niezawodnych kultur hNSPCs. Krytycznym czynnikiem dla naszych komórek jest konieczność utrzymywania ich w postaci dość gęstych kultur; nie mogą one być pasażowane do momentu, w którym stają się rzadkie. W naszych doświadczeniach rzadkie kultury rosną bardzo powoli lub całkowicie przestają się dzielić. Z tego powodu zazwyczaj dzielimy nasze kultury w stosunku 1:2 lub 1:3, gdy kultura jest bardzo gęsta. Pokrycie powierzchni szalki hodowlanej fibronektyną jest istot...

<table><tbody><tr><td>BIT-9500 (BSA, insulina, transferryna)</td><td>Odczynnik</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>09500</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-antymykotyk</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12 (1X)</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>Odczynnik</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>Dystrybuowane przez Fisher pod wskazanym numerem katalogowym</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>FGF, ludzki rekombinowany podstawowy</td><td>Odczynnik</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AB</td><td>Odczynnik</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>EGF, ludzki rekombinowany</td><td>Odczynnik</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40052</td><td>Dystrybuowane przez Fisher pod wskazanym numerem katalogowym</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowej, 25 cm2</td><td>Narzędzie</td><td>Corning</td><td>10-126-28</td><td>Dystrybuowane przez Fisher pod wskazanym numerem katalogowym</td></tr><tr><td>Fibronektyna, ludzka, naturalna</td><td>Odczynnik</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40008A</td><td>Dystrybuowane przez Fisher pod wskazanym numerem katalogowym</td></tr><tr><td>Ludzkie neuralne komórki macierzyste/prekursorowe</td><td>Komórki</td><td>National Human Neural Stem Cell Resource</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do dysocjacji komórek</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>13150-016</td><td></td></tr></tbody></table>

pasażowanie ludzkich neuralnych komórek macierzystych

Passaging Human Neural Stem Cells

Możliwość manipulowania ludzkimi neuralnymi komórkami macierzystymi/progenitorowymi (hNSPC) in vitro umożliwia badanie ich przydatności jako transplantów komórkowych w celach terapeutycznych, a także zgłębianie wielu fundamentalnych procesów rozwoju i patologii układu nerwowego człowieka. Niniejszy protokół przedstawia prostą metodę hodowli i pasażowania hNSPC w celu standaryzacji tej techniki i zwiększenia odtwarzalności badań nad ludzkimi komórkami macierzystymi. Wykorzystane przez nas hNSPC zostały wyizolowane z korzy kory mózgowej tkanek pośmiertnych okresu ponatalnego przez National Human Neural Stem Cell Resource i hodowane jako kultury przylegające w kolbach powlekanych fibronektyną (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003). hNSPC hodujemy w bezsurowiczym medium DMEM:F12 uzupełnionym o EGF, FGF i PDGF, a pasażowania dokonujemy w stosunku 1:2 mniej więcej co siedem dni. W tych warunkach większość komórek w hodowli zachowuje morfologię bipolarną i wykazuje ekspresję markerów niezróżnicowanych neuralnych komórek macierzystych (takich jak nestyna i sox2).

Zdolność do manipulowania ludzkimi komórkami macierzystymi/prekursorowymi neuronów (hNSPCs) in vitro pozwala badać ich przydatność jako przeszczepów komórkowych do celów terapeutycznych oraz zgłębiać proces rozwoju ludzkiego układu nerwowego. Niniejszy protokół przedstawia metodę hodowli i pasażowania hNSPCs w celu zwiększenia powtarzalności badań nad ludzkimi komórkami macierzystymi.

Pasażowanie ludzkich neuralnych komórek macierzystych

Zdolność do manipulowania ludzkimi komórkami macierzystymi/prekursorowymi neuronów (hNSPCs) in vitro daje możliwość zbadania ich przydatności jako przeszczepów komórkowych w celu...

Cześć, jestem Steve. Pracuję w laboratorium dr. Flanagana w Katedrze Patologii na UC Irvine. Dzisiaj pokażę wam, jak pasażować ludzkie komórki prekursorowe neuronów.Technika ta polega na powleczeniu nowej kolby roztworem ludzkiej fibronektyny, ododerwaniu komórek za pomocą buforu do dysocjacji komórek, a następnie zneutralizowaniu buforu do dysocjacji komórek 10% roztworem surowicy, odwirowaniu zawiesiny komórkowej, ponownym zawieszeniu komórek w świeżym medium i przeniesieniu zawiesiny komórkowej do nowej kolby. W naszym laboratorium hodujemy ludzkie komórki prekursorowe neuronów, wymieniając połowę medium co drugi dzień i pasażując je około raz w tygodniu w rozcieńczeniu od 1:2. Podczas pasażowania komórek mogę je policzyć, jeśli chcę wykorzystać je do eksperymentu z immunochemii lub jeśli planuję przeprowadzić transfekcję efektorem jądrowym.Podczas pakowania komórek ważne jest zastosowanie buforu do dysocjacji komórek, ponieważ po pierwsze nie jest on enzymatyczny (w przeciwieństwie do trypsyny) i jest znacznie łagodniejszy dla komórek. Cześć, znajdujemy się teraz w pomieszczeniu do hodowli tkanek i zanim pokażę wam, jak wygląda konfluencyjna kolba z ludzkimi komórkami prekursorowymi, najpierw przygotuję stanowisko do hodowli tkanek. Najpierw wyłączę lampę UV, a następnie włączę oświetlenie i przepływ powietrza.Następnie zdezynfekuję komorę dygestorium za pomocą 70% ethanolu, spryskując ręcznik papierowy i przecierając nim powierzchnię. Ważne jest, aby spryskać 70% ethanolem ręcznik papierowy, a nie wnętrze komory bezpośrednio, ponieważ rozpylanie 70% ethanolu wewnątrz dygestorium może uszkodzić filtr HEPA, który jest bardzo kosztowny. Następnie spryskam wszystkie odczynniki i przyrządy.Na koniec spryskam węże próżniowe i będziemy gotowi. Przyjrzyjmy się tym komórkom. Wyglądają one na około 80% konfluencji.Są to ludzkie komórki prekursorowe neuronów wyizolowane z ludzkich płodów, które hodujemy w kolbach T 25. Przesiewamy je mniej więcej co tydzień, w stosunku od jeden do dwóch. Jestem teraz gotowy do pasażowania komórek.Najpierw wezmę nową kolbę T 25, którą powlekałem przez cztery godziny ludzką fibronektyną od BD biosciences. Usunąłem roztwór fibronektyny. Przepłuczę tę kolbę za pomocą BBS przed przeniesieniem do niej komórek.A teraz wyjmę komórki z inkubatora ustawionego na 37°C. Oto są. Teraz usunę roztwór płuczący PBS z nowej kolby, która została pokryta ludzką fibronektyną.Następnie dodam 2 mL starej pożywki kondycjonowanej do nowej kolby. Teraz muszę opłukać komórki roztworem PBS przed ich odseparowaniem z powierzchni. Najpierw usunę pozostałą pożywkę i niezwłocznie dodam około 2 mL PBS, aby zapobiec wyschnięciu komórek.Odczekam około dwóch minut przed usunięciem PBS i dodaniem buforu do dysocjacji komórek, aby oddzielić komórki od powierzchni kolby. Teraz usunę PBS i ponownie postaram się bezzwłocznie dodać bufor do dysocjacji komórek, aby zapobiec ich wyschnięciu. Dodam 1,5 ml buforu do dysocjacji komórek.W przeciwieństwie do PBS, dodam go bezpośrednio na komórki, starając się pokryć jak największą powierzchnię. Przesuwam więc kolbę z boku na bok, powoli dodając bufor na komórki. Teraz odczekam około pięciu minut, aż komórki zaczną odrywać się od powierzchni.Kolbę pozostawię w temperaturze pokojowej w dygestorium. Jak widać, komórki najpierw zaczynają się zaokrąglać, a następnie odrywać od powierzchni; można już zauważyć niektóre pływające komórki. Delikatne opukanie kolby z boku pomoże im się odrodzić.Minęło pięć minut i, jak widać, roztwór stał się bardzo gęsty od komórek, które oddzieliły się od powierzchni. Teraz zneutralizuję działanie buforu do dysocjacji komórek, dodając 4,5 ml pożywki z surowicą. Użyję pożywki DMEM/F12 z dodatkiem 10% inaktywowanego ciepłem płodowej surowicy bydlęcej i dodam ją bezpośrednio na powierzchnię kolby, aby upewnić się, że żadne komórki nie pozostały przytwierdzone.Następnie będę delikatnie pipetować roztwór w górę i w dół, aby odłączyć wszystkie pozostałe komórki. Potem przeniosę zawiesinę komórkową do stożkowej probówki 15 ml i odwiruję ją z prędkością 1000 RPM przez jedną minutę.Wirowanie komórek dobiegło końca i otrzymaliśmy wyraźny osad komórkowy. Bardzo ostrożnie usunę pożywkę z surowicą, aby nie naruszyć osadu. Następnie zawieszę osad w 4 ml pożywki.Spróbuję teraz resuspender osad w taki sposób, aby nie pozostały żadne skupiska komórek, tak aby roztwór stał się jednorodny i nie zawierał grudek. Ponieważ wykonuję pasaż w stosunku 1:2, pobiorę 2 ml z 4 ml i przeniosę je do nowej kolby, która zawiera już 2 ml pożywki warunkowej. Na koniec opiszę kolbę, podając typ komórek, numer pasażu oraz datę.Oto widok komórek, które pasażowaliśmy pół godziny temu. Jak widać, większość z nich przywarła do powierzchni i zaczęła wytwarzać wypustki. To wszystko.A teraz jestem gotowy do odliczania.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przeszczepiamy ludzkie komórki macierzyste neuronów

Wprowadzenie interesującego genu do komórki jest potężną metodą wyjaśniania jego funkcji in vivo. Niniejszy protokół opisuje wydajną metodę transfekcji hodowli ludzkich neuralnych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPCs) przy użyciu aparatu do elektroporacji Nucleofector firmy Amaxa.

Transfekcja ludzkich neuralnych komórek macierzystych za pomocą nukleofektora Amaxa

Znajomość dokładnej liczby żywych komórek jest niezbędna przy wielu manipulacjach w hodowlach tkankowych. Niniejszy protokół opisuje sposób rozróżniania komórek żywych od martwych oraz ilościowego oznaczania komórek przy użyciu hemacytometru. Choć opisano w nim liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPCs), można go zastosować również do innych typów komórek.

Liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych

Neuronalne komórki macierzyste przygotowano z hipokampa dorosłych, niehibernujących, rocznych wiewiórek arktycznych (AGS). Komórki te można namnażać w wielu pasażach, różnicować i utrzymywać jako kulturę neuronów i gleju w stosunku bliskim 50:50.

Wzrost i różnicowanie dorosłych komórek macierzystych neuronów hipokampa wiewiórki syberyjskiej

Opisano prostą i niezawodną metodę izolacji oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych z odrzuconej ludzkiej tkanki kory płodowej. Hodowle pochodzące z rozpoznanych neurologicznych schorzeń człowieka mogą być wykorzystywane do charakteryzacji patologicznych procesów komórkowych i molekularnych, a także stanowić platformę do oceny skuteczności farmakologicznej.

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Ten film demonstruje metodę różnicowania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z neurosfer na progenitory neuronalne i astrocyty za pomocą leczenia enzymatycznego i hodowli w pożywce bogatej w czynniki wzrostu, co ostatecznie prowadzi do dojrzewania do wyspecjalizowanych komórek progenitorowych.

Różnicowanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych w progenitory neuronów i astrocytów

Neuronalne komórki macierzyste pobrane z dorosłego mózgu są coraz częściej wykorzystywane w różnych zastosowaniach, począwszy od podstawowych badań nad rozwojem układu nerwowego, a skończywszy na odkrywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej. To sprawia, że rygorystyczna kontrola warunków izolacji i hodowli stosowanych do hodowli tych komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania solidnych wyników eksperymentalnych.

Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Ten protokół opisuje nowatorską metodę mechanicznego siekania, która pozwala na ekspansję sferycznych agregatów nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych bez dysocjacji do zawieszenia pojedynczej komórki. Utrzymanie kontaktu komórka/komórka pozwala na szybki i stabilny wzrost przez ponad 40 przejść.

Metoda ekspansji stosowana do cGMP dla agregatów ludzkich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki mózgowej płodu

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Rdzeń kręgowy dorosłego ssaka zawiera nerwowe komórki macierzyste/progenitorowe (NSPC), które mogą być izolowane i rozwijane w hodowli. Protokół ten opisuje pobieranie, izolację, hodowlę i pasażowanie NSPC generowanych z obszaru okołokomorowego dorosłego rdzenia kręgowego od szczura i od dawców narządów po przeszczepie.

Izolacja nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z obszaru okołokomorowego dorosłego szczura i ludzkiego rdzenia kręgowego

W tym badaniu przedstawiamy szczegółową technikę prostego, ale solidnego systemu hodowli organoidów korowych przy użyciu standardowych kultur hPSC bez karmienia. Jest to szybki, wydajny i powtarzalny protokół generowania organoidów, które modelują aspekty starzenia się mózgu in vitro.

Solidna i wysoce odtwarzalna generacja organoidów korowych mózgu do modelowania starzenia się neuronów mózgu in vitro

Poznaj metodę pasażowania ludzkich nerwowych komórek macierzystych (hNSPCs) w warunkach in vitro. Technika ta poprawia powtarzalność badań nad rozwojem układu nerwowego i potencjalnymi zastosowaniami terapeutycznymi.

Pasażowanie ludzkich neuralnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów