Zmodyfikowany test oparty na mysich embrionalnych komórkach macierzystych do ilościowego określania wydajności indukcji kardiogennej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zidentyfikowanie kluczowej regulacji czasowej niezbędnej do różnicowania kardiomiocytów w embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Jest to realizowane poprzez formowanie w pierwszym kroku ciałek embrionalnych w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem, aby ustandaryzować proces powstawania EB. W drugim kroku do EB dodaje się modulatory białkowe lub chemiczne w określonym przedziale czasowym, co pozwala na czasową kontrolę badanych szlaków sygnałowych.

Następnie dokonuje się manualnego policzenia bijących EBS, aby określić wydajność indukcji dla różnych schematów modulacji sygnałów. Otrzymane wyniki wskazują wymagania czasowe kluczowych szlaków sygnalizacyjnych dla różnicowania kardiomiocytów, opierając się na procencie utworzonych bijących EBS oraz potwierdzeniu z wykorzystaniem metody wiszącej kropli. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wiszące krople, jest to, że standaryzuje i upraszcza ona pracochłonną procedurę oraz umożliwia bezpośredni odczyt do celów kwantyfikacji.

Niniejsza metoda może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek macierzystych, takie jak identyfikacja istotnych szlaków sygnalizacyjnych kierujących różnicowaniem w stronę pożądanego typu komórek. Aby rozpocząć tę procedurę, hoduje się embrionalne komórki macierzyste myszy w 10 cm płytkach do hodowli komórkowej w pośrodku do hodowli komórek ES myszy z dodatkiem czynnika hamującego białaczkę (LIF). Komórki ES są gotowe do użycia, gdy osiągną 50-70% konfluencji.

Usunąć pożywkę ES i raz przepłukać komórki pięcioma mililitrami sterylnego PBS. Do każdej płytki dodać dwa mililitry 0,05% trypsyny EDTA i inkubować płytki w temperaturze 37°C przez trzy do pięciu minut. Następnie zneutralizować działanie trypsyny EDTA, dodając trzy mililitry pożywki ES na każdą płytkę, a następnie przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów.

Wiruj z prędkością 1000 obrotów na minutę przez trzy minuty. Po wirowaniu odlej nadsącz i resuspenduj pellet komórkowy pożądaną ilością pożywki EB. Policz komórki, a następnie rozcieńcz je do stężenia pięciu razy 10³ komórek na mililitr.

Używając pipety wielokanałowej, nanieś 100 µL pożywki EB zawierającej komórki do każdego dołka 96-dołkowej mikropłytki z okrągłym dnem. Liczba wymaganych płytek 96-dołkowych będzie zależeć od liczby warunków i punktów czasowych eksperymentu. Umieść 96-dołkowe mikropłytki z okrągłym dnem w inkubatorze z nawilżeniem, w temperaturze 37 °C i przy 5% carbon dioxide, aby zidentyfikować krytyczne okna czasowe kluczowych szlaków sygnałowych dla kardiogenezy.

Do komórek ES dodaje się modulatory specyficznych szlaków sygnalizacyjnych. Do płytek 96-dołkowych o okrągłym dnie dodaje się modulator sygnalizacji, rozcieńczony w pożywce, do każdego dołka w różnych punktach czasowych. Połowa dołków w każdej płytce 96-dołkowej jest wykorzystywana dla każdego początkowego punktu czasowego traktowania.

Do pozostałych 48 studni dla każdego punktu czasowego dodaje się kontrolę nośnika. W różnych punktach końcowych wypłukujemy modulatory sygnalizacji z każdej studni poprzez wymianę medium; podczas tej czynności należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić ciał embrionalnych. W określonych punktach czasowych wypłucz modulatory, wymieniając medium EB w studniach. Przechyl płytkę 96-dołkową pod kątem około 10 stopni i delikatnie usuń medium ze studni za pomocą pipety wielokanałowej.

Następnie, w przypadku każdej inkubacji trwającej powyżej 48 godzin, do każdego dołka należy dodać ponownie medium EB bez modulatora. Wymieniać medium EB uzupełnione o świeże modulatory co dwa dni aż do osiągnięcia pożądanego czasu zakończenia. Siedem dni po indukcji EBS, po przeniesieniu komórek ES na płytki 96-dołkowe, należy zbadać skurcz EB pod mikroskopem.

Oznacz studzienki z kurczącymi się EBS jako pozytywne, aby uzyskać procent kurczących się EBS dla każdego z różnych przebiegów czasowych traktowania. Okna czasowe sygnalizacji dla kardiogenezy zidentyfikowane w eksperymentach na płytkach 96-dołkowych można zweryfikować w EBS przygotowanych z wiszących kropli, tworząc wiszące krople EB. Najpierw przygotuj szalki Petriego, dodając trzy do czterech mililitrów PBS, aby zapobiec późniejszej aberracji kropli.

Następnie zawiesinę komórek ES, przygotowaną w końcowym zagęszczeniu 2,5 × 10⁴ komórek/ml, przelewa się do szalki bakteriologicznej w celu ułatwienia dostępu. Za pomocą pipety wielokanałowej nanosi się krople komórek ES o objętości 20 µl na odwrócone pokrywki szalek Petriego. Należy dopilnować, aby poszczególne krople nie stykały się ze sobą.

Zazwyczaj jedna pokrywka może pomieścić do 80 kropel. Następnie należy odwrócić pokrywkę z powrotem na płytkę Petriego zawierającą PBS i inkubować przez 48 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide, aby umożliwić formowanie się EB. Po 48 godzinach należy wypłukać powstałe EB z wiszących kropel z każdej pokrywki, używając trzech mililitrów pożywki EB.

Przenieś dwie pokrywki z EBS do nowej szalki Petriego. Inkubuj szalkę Petriego przez cztery dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. W czwartym dniu przenieś EBS w zawiesinie na 6-dołkowe płytki powlekane 0,2% Gelatin. Do każdego dołka przenosi się 30 EBS. Inkubuj modulatory sygnalizacji w okresie czasu określonym na podstawie eksperymentów na płytkach 96-dołkowych, siedem dni po przygotowaniu wiszących kropel.

Obserwuj EBS pod mikroskopem w celu wykrycia skurczów EB; komórki ES hodowane w dołkach o okrągłym dnie płytki 96-dołkowej utworzą EBS, co pokazano na tym reprezentatywnym obrazie EB powstałego w czwartym dniu. Krytycznymi punktami czasowymi dla kardiogenezy ES są okna czasowe, w których występuje najwyższy procent kurczących się EBS poddanych działaniu modulatorów sygnalizacji w porównaniu z kontrolą nośnikiem. Przedstawiono tutaj spontanicznie kurczący się ognisko kardiomiocytów powstałe z komórek ES traktowanych morfiną grzbietową w 10. dniu różnicowania na 96-dołkowej płytce mikrotitracyjnej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak efektywnie identyfikować krytyczną regulację czasową oraz okna kluczowych szlaków sygnalizacyjnych w kardiogenezie z komórek ES.