Zmodyfikowany test oparty na embrionalnych komórkach macierzystych myszy do ilościowego określania skuteczności indukcji kardiogennej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zidentyfikowanie kluczowej regulacji czasowej wymaganej do różnicowania kardiomiocytów w embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie uformowanie ciał embrionalnych w 96-dołkowej okrągłej płytce dennej w celu standaryzacji tworzenia EB jako drugiego etapu. Modulatory białkowe lub chemiczne są dodawane do EBS w określonym czasie, co pozwoli na czasową kontrolę badanych szlaków.

Następnie, bijące EBS są ręcznie określane ilościowo w celu określenia wydajności indukcji różnych schematów modulacji sygnału. Uzyskano wyniki, które wskazują na czasowe wymagania podstawowych szlaków sygnałowych do różnicowania kardiomiocytów na podstawie procentu utworzonych uderzeń EBS i potwierdzenia metodą wiszącej kropli. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wiszące krople, jest to, że standaryzuje i upraszcza pracochłonną procedurę oraz pozwala na prosty odczyt w celu ilościowego określenia.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek macierzystych, takie jak identyfikacja niezbędnej koagulacji sygnałowej, która kieruje różnicowanie w kierunku pożądanego typu komórki. Embrionalne komórki macierzyste myszy Gro na 10-centymetrowych płytkach do hodowli komórkowych z mysią pożywką z komórek ES uzupełnioną czynnikiem hamującym białaczkę. Gdy komórki ES osiągną konfluencję od 50 do 70%, są gotowe do użycia.

Usuń pożywkę ES i przepłucz komórki raz pięcioma mililitrami sterylnego PBS. Dodaj dwa mililitry 0,05% tripsin EDTA do każdej płytki i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut. Następnie wygasz podróże w EDTA za pomocą trzech mililitrów pożywki ES na płytkę i przenieś komórki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.

Wiruj z prędkością 1000 obrotów na minutę przez trzy minuty. Po odwirowaniu usunąć supinat i ponownie zawiesić osad komórkowy z żądaną ilością pożywki EB. Policz liczbę komórek, a następnie rozcieńcz komórki pięć razy 10 do trzech komórek na mililitr.

W pożywce EB za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 mikrolitrów pożywki EB zawierającej komórki do każdej studzienki 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania z okrągłym dnem. Wymagana liczba 96 płytek dołkowych będzie zależeć od liczby warunków i punktów czasowych eksperymentu. Umieść 96 płytek do mikromiareczkowania z okrągłym dnem w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%, aby zidentyfikować krytyczne okna czasowe kluczowych szlaków sygnałowych dla genezy układu krążenia.

Do komórek ES dodawane są modulatory określonych szlaków sygnałowych. W 96 płytkach studzienkowych z okrągłym dnem dodaj modulator sygnałowy, który jest rozcieńczany w mediach do każdej studzienki w różnych punktach czasowych. Połowa studzienek w każdej płytce 96-dołkowej jest używana dla każdego punktu początkowego leczenia.

Kontrolka pojazdu jest dodawana do pozostałych 48 studzienek dla każdego punktu czasowego W różnych punktach zatrzymania zamierzamy wypłukać modulatory sygnałowe z każdej studzienki poprzez zmianę mediów i należy przy tym zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec zakłóceniu ciał embrionalnych w różnych punktach czasowych zatrzymania. Wypłukać modulatory, zmieniając media EB dla studzienek. Przechylić płytkę 96-dołkową o około 10 stopni i delikatnie usunąć pożywkę z dołka za pomocą pipety wielokanałowej.

Następnie dodaj z powrotem pożywkę EB bez modulatora do każdej studzienki dla każdego zabiegu dłuższego niż 48 godzin. Zmieniaj media EB uzupełnione nowymi modulatorami co dwa dni, aż do pożądanego czasu zatrzymania. Punkty siedem dni po indukcji EBS poprzez przeniesienie komórek ES do 96-dołkowych płytek badają skurcz EB pod mikroskopem.

Oceń dołki z zakontraktowaniem EBS jako pozytywne, aby uzyskać procent zachorowania na EBS dla każdego innego przebiegu leczenia. Okna czasowe sygnalizacji dla genezy sercowo-naczyniowej zidentyfikowane w eksperymentach z 96 płytkami dołkowymi można zweryfikować w EBS wykonanym z wiszących kropelek w celu wytworzenia wiszących kropelek EB. Najpierw przygotuj szalki Petriego, dodając trzy do czterech mililitrów PBS, aby zapobiec aberracji kropelek później.

Następnie zawiesinę komórek ES przygotowaną o końcowej gęstości 2,5 razy 10 do czterech komórek na mililitr wlewa się do naczynia bakteryjnego w celu łatwego dostępu. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 20 mikrolitrów kropli komórek ES na odwrócone pokrywki szalek Petriego. Nie pozwól, aby poszczególne kropelki stykały się ze sobą.

Ogólnie rzecz biorąc, jedna pokrywka może pomieścić do 80 kropli. Następnie odwróć pokrywkę z powrotem na szalkę Petriego zawierającą PBS, inkubuj przez 48 godzin w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić tworzenie EB. Po 48 godzinach zmyj EBS utworzony z kropelek zwisających z każdej pokrywki trzema mililitrami pożywki EB.

Wsuń dwie pokrywki EBS na nową szalkę Petriego. Inkubować szalkę Petriego przez cztery dni w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza w czwartym dniu, przenieść EBS w zawiesinie na 0,2% ogólnie pokryte żelatyną płytki sześciodołkowe. 30 EBS przenosi się do modulatorów sygnalizacyjnych inkubujących każdą studzienkę w okresie określonym na podstawie eksperymentów z 96 płytkami dołkowymi, siedem dni po wytworzeniu wiszących kropel.

Obserwuj EBS pod mikroskopem pod kątem skurczu EB: komórki ES wyhodowane w dołkach z okrągłym dnem płytki 96-dołkowej utworzą EBS, jak pokazano na tym reprezentatywnym obrazie EB utworzonego w czwartym dniu. Krytyczne punkty czasowe dla genezy ES cardio to okna czasowe, które zawierają najwyższy odsetek zakażeń EBS leczonych modulatorami sygnalizacji w porównaniu z kontrolą pojazdu. Pokazano tutaj spontanicznie kurczące się ognisko kardiomiocytów utworzonych z grzbietowych komórek ES traktowanych morfiną w 10 dniu różnicowania na 96-dołkowej płytce mikromiareczkowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie zidentyfikować krytyczną regulację czasową, okna kluczowych szlaków sygnałowych w genezie ES cardio.