Name: Zmodyfikowany test oparty na embrionalnych komórkach macierzystych myszy do ilościowego określania skuteczności indukcji kardiogennej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę opartą na mysich embrionalnych komórkach macierzystych do ilościowego określania skuteczności indukcji kardiogennej. Technika ta umożliwia identyfikację kluczowych okien czasowych dla szlaków sygnałowych Wnt/β-catenin i BMP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez granty Veterans Affairs oraz NIH 5U01HL100398 i 1R01HL104040.

1. Tworzenie ciałek embrionalnych (EB) z wykorzystaniem 96-dołkowych płytek mikrotitracyjnych z półkolistym dnem
<ol>
	<li>Hodować mysie komórki ES na 10-centymetrowych płytkach do hodowli komórkowej w pożywce do mysich komórek ES uzupełnionej o LIF.</li>
 <li>Gdy komórki ES będą gotowe do użycia (zazwyczaj przy 50-70% konfluencji), usunąć pożywkę ES i raz przepłukać komórki 5 ml sterylnego PBS.</li>
 <li>Dodać 2 ml 0,05% trypsyny / EDTA do każdej płytki i inkubować płytki w temperaturze 37°C przez 3˜5 minut, a następnie zneutralizować trypsynę EDTA za pomocą 3 ml pożywki ES.</li>
 <li>Przenieść komórki do probówek Falcon o pojemności 50 ml i wirować przy 1000 rpm przez 3 minuty.</li>
 <li>Usunąć nadsącz i resuspendować osad komórkowy pożąganą ilością pożywki EB.</li>
 <li>Policzyć liczbę komórek i rozcieńczyć komórki w pożywce EB do stężenia 5 x103 komórek/ml.</li>
 <li>Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść 100μl pożywki EB zawierającej komórki do każdego dołka 96-dołkowych okrągłych płytek mikrotitracyjnych.</li>
 <li>Umieścić 96-dołkowe okrągłe płytki mikrotitracyjne w inkubatorze.</li>
</ol>
2. Identyfikacja krytycznych okien czasowych kluczowych szlaków sygnalizacyjnych dla kardiogenezy
<ol>
	<li>Do każdego dołka 96-dołkowych płytek mikrotitracyjnych zawierających komórki ES w różnych punktach czasowych, takich jak dzień 0, dzień 1, dzień 2, dzień 3, dzień 4 itd., dodać modulatory specyficznych szlaków sygnalizacyjnych oraz kontrolę nośnikiem. Połowa dołków w każdej 96-dołkowej płytce (48 dołków) jest wykorzystywana dla każdego początkowego punktu czasowego traktowania.</li>
 <li>Wypłukać modulatory poprzez wymianę pożywki EB dla każdych 48 dołków w różnych punktach końcowych. Na przykład, aby uzyskać dwudniowy czas traktowania komórek ES rozpoczynający się w dniu 0, modulatory należy wypłukać w dniu 2. W przypadku każdego traktowania trwającego dłużej niż 48 godzin, wymieniać pożywkę EB uzupełnioną o świeże modulatory co dwa dni aż do osiągnięcia pożądanych punktów końcowych.</li>
 <li>Po 7 dniu zbadać skurcze ciał embroidalnych (EB) pod mikroskopem. Dołki z kurczących się EB ocenić jako pozytywne, aby obliczyć procent kurczących się EB dla każdego z różnych przebiegów czasowych traktowania.</li>
 <li>Krytyczne punkty czasowe dla kardiogenezy komórek ES to przedziały czasowe, w których odnotowano najwyższy procent kurczących się EB traktowanych modulatorami sygnalizacji w porównaniu z kontrolą nośnikiem.</li>
</ol>
3. Weryfikacja okien czasowych sygnalizacji dla kardiogenezy w ciałach embryoidalnych (EB) wytworzonych z wiszących kropel
<ol> 
 <li>Przygotować szalki Petriego, dodając do nich 3-4 ml PBS w celu zapobiegania odparowywaniu. </li>
 <li>Postępować zgodnie z krokami 1.1 ˜ 1.5, aby przygotować komórki ES o końcowej gęstości 2,5x104 komórek / ml.</li>
 <li>Przelać mieszaninę komórek do szalki bakteriologicznej dla łatwiejszego dostępu. Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść krople o objętości 20 μl (zawierające około 500 komórek) na odwrócone pokrywki. Należy dopilnować, aby poszczególne krople nie stykały się ze sobą. Zazwyczaj na jednej pokrywce można zmieścić do 80 kropli. Przykryć szalkę z PBS ponownie pokrywką. Inkubować w inkubatorze przez 24 lub 48 godzin, aby umożliwić formowanie się ciał embroidalnych (EB).</li>
 <li>Zmyć uformowane EB z wiszących kropli z każdej pokrywki za pomocą 3 ml pożywki EB i zebrać EB z dwóch pokrywek do nowej szalki Petriego. Dodać pożywkę EB do uzyskania całkowitej objętości 10 ml.</li>
 <li>W 4. dniu przenieść EB w zawiesinie na płytki 6-dołkowe pokryte 0,2% żelatyną. Zazwyczaj do każdego dołka przenosi się 30 EB. Dodać pożywkę EB, aby uzyskać końcową objętość 2 ml dla każdego dołka.</li> 
 <li>Inkubować z modulatorami sygnalizacji w okresie czasu określonym na podstawie eksperymentów na płytkach 96-dołkowych. </li>
 <li>Obserwować skurcze EB pod mikroskopem po 7. dniu; w razie potrzeby kardiogenezę można dalej charakteryzować za pomocą RT-PCR, immunobarwienia i innych metod.</li>
</ol>

<ol><li>Fukuda, K., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+a+source+of+regenerative+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes.</a> Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).</li>
<li>Foley, A. C., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+induction+by+Wnt+antagonists+depends+on+the+homeodomain+transcription+factor+Hex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex.</a> Genes Dev. 19, 387-396 (2005).</li>
<li>Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+biphasic+roles+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+cardiomyogenesis+and+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).</li>
<li>Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling%2C+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Metoda wiszącej kropli jest konwencjonalną metodą stosowaną do tworzenia ciał embrynoidalnych (EB) i różnicowania in vitro. Jest ona jednak pracochłonna i ogranicza elastyczność eksperymentalną ze względu na kwestie logistyczne. Równie istotne jest to, że wyniki są trudniejsze do walidacji, ponieważ umiejętności eksperymentatora są kluczowe dla sukcesu tworzenia i manipulowania EB w wiszących kroplach. Prostszą metodą jest tworzenie EB w płytce 96-dołkowej z okrągłym dnem jako proces jednoczynnościowy. Taki format pozwala na standaryzację różnicowania in vitro i umożliwia zastosowanie większej liczby warunków eksperymentalnych dzięki łatwości tworzenia EB i późniejszych manipulacji (np. dodawaniu lub usuwaniu modulatorów). Ponadto format płytki 96-dołkowej może zostać zoptymalizowany jako wydajne narzędzie przesiewowe dla komórek ES myszy.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Głównie stosuje się mysie komórki CGR8.</td></tr><tr><td colspan="4">Pożywka ES: pożywka GMEM uzupełniona o 10% inaktywowanego ciepłem FBS, 2 mM L-glutaminy, 0,05 mM 2-merkapto&amp;#8211;etanolu oraz 200 U/ml mysiego LIF.</td></tr><tr><td colspan="4">Pożywka EB: przygotować pożywkę IMDM z 20% inaktywowanego ciepłem FBS, 1,6 mM L-glutaminy, 0,08 mM 2-merkapto&amp;#8211;etanolu oraz 1X roztworem nieessentialnych aminokwasów MEM.</td></tr></tbody></table>

zmodyfikowany test oparty na mysich embrionalnych komórkach macierzystych do ilościowego określania wydajności indukcji kardiogennej

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych jest ściśle kontrolowane przez regulację czasową i przestrzenną wielu kluczowych szlaków sygnalizacyjnych. Jedną z przeszkód w zrozumieniu tego procesu były zróżnicowane metody korelacji zmian w kluczowych zdarzeniach sygnalizacyjnych z wydajnością różnicowania. Opisujemy tutaj wykorzystanie testu opartego na mysich embrionalnych komórkach macierzystymi (ES) w celu zidentyfikowania krytycznych okien czasowych dla aktywacji sygnałów Wnt/β-catenin i BMP podczas indukcji kardiogenicznej. Poprzez ocenę kurczliwych ciałek embrionalnych (EB) w formacie płytki 96-dołkowej, możemy szybko określić ilościowo wydajność kardiogenną i zidentyfikować kluczowe okna czasowe dla aktywacji sygnałów Wnt/β-catenin i BMP w przebiegu czasowym po zastosowaniu specyficznych modulatorów. Przedstawiona tutaj zasada nie ogranicza się wyłącznie do indukcji kardiogennej i może być zastosowana w badaniach nad wieloma innymi liniami komórkowymi. Ponadto format 96-dołkowy ma potencjał do dalszego rozwoju jako wysokoprzepustowy, zautomatyzowany test, umożliwiający weryfikację bardziej złożonych hipotez eksperymentalnych.

Opisujemy zastosowanie testu opartego na komórkach ES myszy w celu zidentyfikowania krytycznych okien czasowych aktywacji sygnałów Wnt/β-catenin i BMP podczas indukcji kardiogennej. Metoda ta stanowi standaryzowaną platformę, która pozwala na wiarygodne ilościowe określenie wydajności kardiogennej i może być stosowana do badania innych linii komórkowych.

Zmodyfikowany test oparty na mysich embrionalnych komórkach macierzystych do ilościowego określania wydajności indukcji kardiogennej

Różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych jest ściśle kontrolowane przez czasową i przestrzenną regulację wielu kluczowych szlaków sygnałowych. Jedną z przeszkód...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zidentyfikowanie kluczowej regulacji czasowej niezbędnej do różnicowania kardiomiocytów w embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Osiąga się to poprzez utworzenie w pierwszym etapie ciałek embrionalnych (EB) w płytce 96-dołkowej z okrągłym dnem, aby zstandaryzować proces tworzenia EB. W drugim kroku do EB dodaje się modulatory białkowe lub chemiczne w określonym przebiegu czasowym, co pozwala na czasową kontrolę badanych szlaków.Następnie liczbę bijących EBS określa się manualnie, aby ustalić wydajność indukcji różnych schematów modulacji sygnału. Uzyskane wyniki wykazują wymagania czasowe istotnych szlaków sygnalizacyjnych dla różnicowania kardiomiocytów na podstawie procentu powstałych bijących EBS oraz potwierdzenia z wykorzystaniem metody wiszącej kropli. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wiszące krople, jest to, że standaryzuje i upraszcza ona pracochłonną procedurę oraz umożliwia bezpośredni odczyt do kwantyfikacji.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek macierzystych, takie jak identyfikacja niezbędnych szlaków sygnalizacyjnych kierujących różnicowaniem w stronę pożądanego typu komórek. Aby rozpocząć tę procedurę, należy hodować embrionalne komórki macierzyste myszy w 10 centymetrowych płytkach hodowlanych w pożywce do komórek ES myszy uzupełnionej o czynnik hamujący białaczkę (leukemia inhibitory factor). Komórki ES są gotowe do użycia, gdy osiągną 50 do 70% konfluencji.Usunąć pożywkę ES i raz przepłukać komórki pięcioma mililitrami sterylnego PBS. Do każdej płytki dodać dwa mililitry 0,05% trypsyny EDTA i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez trzy do pięciu minut. Następnie zneutralizować działanie trypsyny EDTA, dodając trzy mililitry pożywki ES na płytkę, a następnie przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów.Wirować z prędkością 1000 obr./min przez trzy minuty. Po wirowaniu usunąć nadsącz i zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości medium EB. Policzyć komórki, a następnie rozcieńczyć zawiesinę do stężenia 5 × 10³ komórek/ml.Do pożywki EB, używając pipety wielokanałowej, dodaj 100 µL pożywki EB zawierającej komórki do każdego dołka 96-dołkowej mikropłytki z okrągłym dnem. Liczba wymaganych płytek 96-dołkowych będzie zależeć od liczby warunków i punktów czasowych eksperymentu. Umieść 96-dołkowe mikropłytki z okrągłym dnem w inkubatorze z wilgotnym środowiskiem w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide, aby zidentyfikować krytyczne okna czasowe kluczowych szlaków sygnalizacyjnych dla kardiogenezy.Do komórek ES dodaje się modulatory specyficznych szlaków sygnalizacyjnych. Do płytek 96-dołkowych o okrągłym dnie dodaje się modulator sygnalizacji rozcieńczony w pożywce, wprowadzając go do każdego dołka w różnych punktach czasowych. Połowę dołków w każdej płytce 96-dołkowej wykorzystuje się dla każdego początkowego punktu czasowego traktowania.Kontrolę nośnikiem dodaje się do pozostałych 48 studni dla każdego punktu czasowego. W różnych punktach końcowych wypłukujemy modulatory sygnałowe z każdej studni poprzez wymianę medium; podczas tej czynności należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić ciał embrionalnych. W różnych punktach czasowych zakończenia eksperymentu wypłukujemy modulatory, wymieniając medium EB w studniach. Płytkę 96-dołkową przechylamy pod kątem około 10 stopni i ostrożnie odsysamy medium ze studni za pomocą pipety wielokanałowej.Następnie, w przypadku każdej inkubacji trwającej dłużej niż 48 godzin, do każdego dołka należy dodać ponownie pożywkę EB bez modulatora. Pożywkę EB uzupełnioną o świeże modulatory należy wymieniać co dwa dni aż do osiągnięcia pożądanego czasu zakończenia eksperymentu. W siódmej dobie po indukcji EB, przeprowadzonej poprzez przeniesienie komórek ES na płytki 96-dołkowe, należy ocenić stopień kurczenia się EB pod mikroskopem.Dołki z kurczących się EBS należy oznaczyć jako pozytywne, aby obliczyć procent kurczących się EBS dla każdego z różnych przebiegów czasowych traktowania. Okna czasowe sygnalizacji kardiogenezy zidentyfikowane w eksperymentach na płytkach 96-dołkowych można zweryfikować w EBS utworzonych z wiszących kropli, aby stworzyć wiszące krople EB. W pierwszej kolejności należy przygotować szalki Petriego, dodając od trzech do czterech mililitrów PBS, aby zapobiec późniejszej aberracji kropli.Następnie zawiesinę komórek ES przygotowaną w końcowym zagęszczeniu 2,5 × 10⁴ komórek/ml przelewa się do szalki bakteriologicznej w celu łatwiejszego dostępu. Za pomocą pipety wielokanałowej nanosi się krople komórek ES o objętości 20 µL na odwrócone pokrywki szalek Petriego. Należy dopilnować, aby poszczególne krople nie stykały się ze sobą.Zazwyczaj na jednej pokrywce można zmieścić do 80 kropli. Następnie nakłada się pokrywkę z powrotem na szalkę Petriego zawierającą PBS i inkubuje przez 48 godzin w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide, aby umożliwić formowanie się EB. Po 48 godzinach powstałe EB z wiszących kropli z każdej pokrywki spłukuje się trzema mililitrami medium do EB.Przenieś dwa wieczka z EBS do nowej szalki Petriego. Inkubuj szalkę Petriego przez cztery dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. W czwartym dniu przenieś EBS w zawiesinie na sześciodołkowe płytki pokryte 0,2% Gelatin w warunkach ogólnych. Do każdego dołka przenosi się 30 EBS. Inkubuj modulatory sygnalizacji przez okres określony na podstawie eksperymentów na płytkach 96-dołkowych, siedem dni po przygotowaniu kropli wiszących.Obserwuj EBS pod mikroskopem w celu stwierdzenia skurczów EB; komórki ES hodowane w dołkach o okrągłym dnie płytki 96-dołkowej tworzą EBS, co pokazano na tym reprezentatywnym obrazie EB uformowanego w czwartym dniu. Krytyczne punkty czasowe dla kardiogenezy ES to okna czasowe, w których występuje najwyższy odsetek kurczących się EBS poddanych działaniu modulatorów sygnalizacji w porównaniu z kontrolą nośnikiem. Przedstawiono tutaj spontanicznie kurczące się ognisko kardiomiocytów powstałe z komórek ES traktowanych morfiną dorsalną w 10. dniu różnicowania na płytce mikrotitracyjnej 96-dołkowej.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak efektywnie identyfikować krytyczną regulację czasową oraz okna kluczowych szlaków sygnalizacyjnych w kardiogenezie komórek ES.

modified-mouse-embryonic-stem-cell-based-assay-for-quantifying

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zmodyfikowany test oparty na zarodkowych komórkach mysich do ilościowego określania efektywności indukcji kardiogenezy

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Ten manuskrypt opisuje krok po kroku protokół generowania i kwantyfikacji różnych przeprogramowanych podtypów serca przy użyciu retrowirusowego dostarczania Gata4, Hand2, Mef2c i Tbx5 za pośrednictwem retrowirusa.

Ocena podtypów kardiomiocytów po przeprogramowaniu fibroblastów embrionalnych myszy za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Tutaj prezentujemy solidną metodę przeprogramowania pierwotnych fibroblastów embrionalnych w funkcjonalne kardiomiocyty poprzez nadekspresję GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 i miR-133 (GHMT2m) wraz z hamowaniem sygnalizacji TGF-β. Nasz protokół generuje bicie kardiomiocytów już po 7 dniach od transdukcji z wydajnością do 60%.

Tłumienie sygnalizacji pro-fibrotycznej nasila przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy w indukowane kardiomiocyty za pośrednictwem czynników

Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.

Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek

W tym protokole pokazujemy i rozwijamy, jak używać ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do różnicowania i oczyszczania kardiomiocytów, a ponadto, jak poprawić efektywność ich przeszczepu za pomocą wstępnego leczenia inhibitorem kinazy białkowej związanej z Rho w modelu zawału mięśnia sercowego u myszy.

Zwiększenie wszczepienia indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez przejściowe hamowanie aktywności kinazy Rho

Opisujemy tutaj, założenie i zastosowanie mysiej linii reporterowej Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (określanej poniżej jako αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) do oceny przeprogramowania serca. Noworodkowe fibroblasty serca (NCF) wyizolowane ze szczepu myszy są przekształcane w indukowane kardiomiocyty (iCM), co pozwala na wygodną i efektywną ocenę skuteczności przeprogramowania i funkcjonalnego dojrzewania iCM poprzez strumień wapnia (Ca2+).

Ocena in vitro przeprogramowania serca poprzez pomiar specyficznego dla serca strumienia wapnia za pomocą reportera GCaMP3

Dostarczanie komórek pod kontrolą ultradźwięków w miejscu zawału mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym, skutecznym i wygodnym sposobem przeszczepu komórek.

Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego

Kombinacja poracji laserowej i matryc mikroelektrod (MEA) pozwala na rejestrację kardiomiocytów z hodowanych pierwotnych i pochodzących z komórek macierzystych zapisów podobny do potencjału czynnościowego. Kształt fali zapewnia lepszy wgląd w sposób działania badanych związków niż standardowe nagrania. Łączy on patch-clamp i odczyt MEA, aby jeszcze bardziej zoptymalizować badania nad bezpieczeństwem kardiologicznym w przyszłości.

Indukowane laserowo pomiary potencjału czynnościowego kardiomiocytów na układach mikroelektrod w celu zwiększenia predykcyjności bezpieczeństwa farmakologii

Ten protokół przedstawia szczegółowe ramy metodologiczne dla opartej na elektroporacji transgenezy komórek serca w rozwijających się sercach myszy. Udostępnione tutaj materiały wideo ułatwią naukę tej wszechstronnej techniki.

Skuteczne podejście do transgenezy w dostarczaniu genów w embrionalnym sercu myszy

Protokół ten ilościowo mierzy stabilność i okres półtrwania intergenowych i intragenowych RNA wzmacniających w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą leczenia aktinomycyną D, RT-qPCR oraz analizy regresji nieliniowej. Stosuje się strategie normalizacji specyficzne dla pozycji, aby dokładnie modelować dynamikę rozpadu eRNA w sposób zależny od kontekstu.

Zoptymalizowana ilościowa ocena stabilności RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Poznaj zmodyfikowaną metodę opartą na mysich embrionalnych komórkach macierzystych do ilościowego określania skuteczności indukcji kardiogennej. Technika ta umożliwia identyfikację kluczowych okien czasowych dla szlaków sygnałowych Wnt/β-catenin i BMP.

Zmodyfikowany test oparty na embrionalnych komórkach macierzystych myszy do ilościowego określania skuteczności indukcji kardiogennej (Wideo) | JoVE Journal

Zmodyfikowany test oparty na mysich embrionalnych komórkach macierzystych do ilościowego określania wydajności indukcji kardiogennej

Przeglądaj więcej filmów