Name: Urządzenie mikroprzepływowe z wzorami rowków do badania zachowania komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania mikroprzepływowych urządzeń z wzorami rowków do hodowli i badania zachowania komórek. Technika ta umożliwia tworzenie obszarów o niskim naprężeniu ścinającym, sprzyjających dokowaniu komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

A. Mikrowytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego
<ol>
<li>4-calowy wafelek krzemowy (Si) poddaje się działaniu reaktywnej plazmy tlenowej (5 min przy 30W, Harrick Scientific, NY).</li>
<li>Negatywny fotorezyst (SU-8 2015, Microchem, MA) nanosi się metodą spin-coatingu na wafelek Si przy 900 rpm przez 1 min.</li>
<li>Wafelek poddaje się wstępnemu wypalaniu (soft bake) w temperaturze 95°C przez 6 min na płycie grzewczej, a następnie naświetla światłem UV (200W) przez 4 min przez maskę z naniesionym wzorem mikrokanałów.</li>
<li>Wafelek poddaje się wypalaniu końcowemu (post bake) w temperaturze 95°C przez 6 min, a następnie wywołuje przy użyciu wywoływacza do fotorezystu SU-8.</li>
<li>Wzorowany fotorezystem wafelek zawierający mikrokanały umieszcza się w płytce Petriego.</li>
<li>Formy z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) (Sylgard 184) przygotowuje się poprzez zmieszanie elastomeru silikonowego z utwardzaczem (w stosunku 10:1).</li>
<li>Mieszaninę PDMS wlewa się na matrycę krzemową, a następnie umieszcza w desykatorze próżniowym w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.</li>
<li>PDMS utwardza się w temperaturze 70°C przez 1~2 godziny.</li>
<li>Formy PDMS odlepia się następnie od matrycy krzemowej.</li>
</ol>
B. Montaż urządzenia
<ol>
<li>Górne kanały fluido-dydynamiczne o grubości 40 µm oraz dolne kanały z mikrowgłębieniami o grubości 40 µm (o szerokości 25, 50, 75 i 100 μm) zostają otrzymane z dwóch różnych form macierzystych z Si.</li>
<li>W urządzeniu fluidycznym wycinane są otwory wlotowe i wylotowe kanałów.</li>
<li>Kanały fluidyczne i kanały z mikrowgłębieniami są nieodwracalnie łączone za pomocą reaktywnej plazmy tlenowej (5 min przy 30W, Harrick Scientific, NY).</li>
<li>Wnętrze urządzenia mikrofluidycznego jest powlekane macierzą pozakomórkową (ECM) (tj. fibronektyną) przez 1 godzinę w inkubatorze (37°C).</li>
</ol>
C. Wysiew komórek i przygotowanie eksperymentu
<ol>
<li>Fibroblasty mysie NIH-3T3 są hodowane w kolbie do hodowli tkanek w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). </li>
<li>Komórki są trypsynizowane i dysocjowane. </li>
<li>Dysocjowane komórki są wprowadzane do kanałów z mikrorowkami przy gęstości komórek 3×106 cells/ml (Rysunek 1). <img src="/files/ftp_upload/old/270_2008_8_24_3/270_Figure-01.png" alt="Mikrofluidyczna hodowla komórkowa; etapy łączenia, powlekania ECM i wysiewania komórek; schemat inżynierii tkankowej." width="191" height="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1">     Rysunek 1 </li>
<li>Do kanału za pomocą pompy strzykawkowej (1 µl/min) wprowadzane jest 2 mL pożywki, 100 mM H2O2 oraz zestaw do badania apoptozy (20 µL Annexin V i 40 µL jodku propidyny, Invitrogen, CA).</li>
<li>Komórki są monitorowane w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskobu odwróconego (Nikon TE 2000). </li>
</ol>

<ol><li>Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+microfluidic-vacuum+device+for+interfacing+with+conventional+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform.</a> BMC Biotechnol. 7, (2007).</li>
<li>Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+docking+inside+microwells+within+reversibly+sealed+microfluidic+channels+for+fabricating+multiphenotype+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays.</a> Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).</li>
<li>Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+analysis+of+hydrogen+peroxide-induced+cell+death+in+primary+neuronal+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture.</a> Neuroscience. 67, 921-932 (1995).</li>
</ol>

Komórki unieruchomiono i ułożono w wzory wewnątrz mikrorowkowanych podłoży w urządzeniu mikroprzepływowym. Proces apoptozy komórek eksponowanych na nadtlenek wodoru obserwowano w czasie rzeczywistym i analizowano przy użyciu Annexin V oraz jodku propidyny. Zatem to urządzenie mikroprzepływowe zawierające kanały z mikrorowkami może być użyteczne w wysokoprzepustowym przesiewaniu leków.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Odczynnik</td><td>K.R. Anderson Co.</td><td>2065622</td><td>Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>pożywka</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>Pożywka Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s </td></tr><tr><td>FBS</td><td>surowica</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>Płodowa surowica bydlęca</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Test apoptozy</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>V13242</td><td>Aneksyna A, jodek propidyny</td></tr><tr><td>Negatywny fotorezyst </td><td></td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 2015</td><td></td></tr><tr><td>Wafer krzemowy </td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td>4-calowy wafer krzemowy</td></tr><tr><td>Reaktywna plazma tlenowa </td><td>Odczynnik</td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td></td><td>obróbka wafera przez 5 min przy 30W</td></tr><tr><td>mikroskop odwrócony </td><td>Narzędzie</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

urządzenie mikrofluidyczne z wzorami rowków do badania zachowania komórek

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

Opisujemy urządzenie mikrofluidyczne z mikrożłobionymi wzorami do badania zachowania komórek. Platforma mikrofluidyczna ta składa się z górnego kanału fluidycznego i dolnej mikrożłobionej podłoża. W celu wykonania mikrożłobionych kanałów, górna forma z polidimetylosiloksanu (PDMS) zawierająca odciśnięte kanały mikrofluidyczne została wyrównana i połączona z mikrożłobionym podłożem. Przy użyciu tego urządzenia unieruchomiono i ukształtowano w mikrożłobionych podłożach (o szerokości 25, 50, 75 i 100 μm) fibroblasty mysie. Aby zbadać apoptozę w urządzeniu mikrofluidycznym, do kanału fluidycznego przez 2 godziny perfundowano medium zawierające nadtlenek wodoru, Aneksynę V oraz jodek propidyny. Stwierdzono, że komórki narażone na stres oksydacyjny uległy apoptozie. Obecność tych apoptotycznych komórek potwierdzono za pomocą Aneksyny V, która wiąże się z fosfatydyloseryną w zewnętrznej warstwie błony plazmatycznej podczas procesu apoptozy. Przy użyciu tego urządzenia mikrofluidycznego z mikrożłobionymi wzorami proces apoptozy obserwowano w czasie rzeczywistym i analizowano za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w komorę inkubacyjną (37°C, 5% CO2). W związku z tym urządzenie mikrofluidyczne zintegrowane z mikrożłobionymi podłożami może być użyteczne w badaniu zachowania komórek oraz w przeprowadzaniu wysokoprzepustowego przesiewania leków.

Opisujemy protokół wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych, które umożliwiają wychwytywanie i hodowlę komórek. W tym podejściu wykorzystuje się ustrukturyzowane mikrostruktury, takie jak rowki wewnątrz kanałów mikrofluidycznych, aby stworzyć obszary o niskim naprężeniu ścinającym, w których komórki mogą zostać unieruchomione.

Urządzenie mikrofluidyczne z wzorami rowków do badania zachowania komórek

Opisujemy urządzenie mikrofluidyczne z mikrowzorami rowków do badania zachowania komórek. Ta platforma mikrofluidyczna składa się z górnego kanału fluidycznego...

Nazywam się Jiang, jestem stypendystą przygotowującym poster na Harvardzie i w MIT w dziedzinie zdrowia, nauki i technologii. Moją specjalnością w tym laboratorium jest tworzenie nowatorskich urządzeń mikrofluidycznych do badania zachowań komórkowych. Potrafię projektować nowatorskie urządzenia do generowania gradientów, a także integrować je z moimi urządzeniami mikrofluidycznymi.Urządzenie TC pozwala na precyzyjne manipulowanie interakcjami międzykomórkowymi, a także kontaktem komórek z czynnikami zewnętrznymi. Dzięki zastosowaniu systemu TC mogę badać i rozumieć podstawową biologię komórki, a także stosować wiedzę z zakresu biologii rozwoju oraz bioinżynierii komórek macierzystych. Nazywam się Amir Manchi i jestem studentem studiów licencjackich w laboratorium profesora Haana w Harvard, MIT Division of Health Sciences and Technology.Pracuję nad urządzeniami mikrofluidycznymi i staramy się, w ramach dowodu koncepcji, wykazać, że urządzenia mikrofluidyczne mają ogromny potencjał w hodowli komórek oraz przeprowadzaniu różnego rodzaju badań, takich jak badania toksyczności. Próbowaliśmy również badać i optymalizować charakterystykę płynów wewnątrz tych urządzeń w zależności od szybk

a-microfluidic-device-with-groove-patterns-for-studying-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy protokół mikrofabrykacji mikroprzepływowego urządzenia do generowania gradientów, które umożliwia tworzenie przestrzennych i czasowych gradientów w ściśle określonym mikrośrodowisku. W tym podejściu mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów może być wykorzystane do badania kierunkowej migracji komórek, embriogenezy, gojenia ran oraz przerzutów nowotworowych.

Mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów w biologii komórki

Urządzenia mikrofluidyczne mogą być wykorzystywane do wizualizacji złożonych procesów naturalnych w czasie rzeczywistym i w odpowiednich skalach fizycznych. Opracowaliśmy proste urządzenie mikrofluidyczne, które naśladuje kluczowe cechy naturalnych ośrodków porowatych, służące do badania wzrostu i transportu bakterii w podłożu gruntowym.

Okno na mikroświat: Proste systemy mikrofluidyczne do badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych

Przedstawiamy prostą metodę wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych zdolnych do stosowania podobnych warunków dynamicznych w odniesieniu do wielu odrębnych szczepów, bez konieczności korzystania z pomieszczeń typu clean room lub litografii miękkiej.

Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu odrębnych szczepów

Źródło: Cabeen, M. T. i in. Analiza mikrofluidyczna pojedynczych komórek Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)Film pokazuje użycie urządzenia mikrofluidycznego do obserwacji wzrostu bakterii na poziomie pojedynczych komórek. Pokazuje, jak nieruchome komórki bakteryjne, zamknięte w mikroskalowych rowach, są nieustannie odżywiane i obrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym. System ten umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym podziału komórek i śledzenia linii genealogicznej na przestrzeni...

Śledzenie wzrostu bakterii z rozdzielczością pojedynczych komórek w układzie mikrofluidowym

Źródło: Scheidweiler, D. i in. Łączenie urządzeń płynowych z mikroskopią i cytometrią przepływową do badania transportu mikroorganizmów w ośrodkach porowatych na skalach przestrzennych. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do ilościowego określania ruchliwości bakterii poprzez porowatą matrycę złożoną z losowo ułożonych filarów. Do urządzenia wprowadzane są fluorescencyjnie znakowane bakterie, obrazowane mikroskopią podczas przemieszczania się przez...

Ocena ruchliwości bakteryjnej za pomocą urządzenia mikrofluidycznego

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Pokazujemy test oparty na mikrofluidyce do pomiaru skali czasowej dla komórek do przejścia przez sekwencję zwężeń w skali mikronów.

Technika mikroprzepływowa do badania odkształcalności komórek

Mikro-prefabrykowane urządzenia zintegrowane z komponentami fluidycznymi stanowią platformę in vitro do badań komórkowych naśladujących mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy mikroprzepływowe chipy na bazie polimetakrylanu metylu do badania reakcji komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających.

Projektowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania odpowiedzi komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających

Mikroprzepływowy chip został stworzony do produkcji par złotych kropek do generowania pęcherzyków tandemowych i pokrytych fibronektyną wysp do tworzenia wzorów pojedynczych komórek w pobliżu. Wynikowe pole przepływu scharakteryzowano za pomocą prędkości obrazu cząstek i wykorzystano do badania różnych efektów biologicznych, w tym poracji błony komórkowej, deformacji błony i wewnątrzkomórkowej odpowiedzi wapnia.

System mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki

Ten protokół szczegółowo opisuje konfigurowalną metodę pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na chemoatraktanty, które mogą być również użyte do określenia szybkości dyfuzji leku z matrycy polimerowej.

Konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek

Kontrola gradientów chemicznych i tlenu jest niezbędna dla hodowli komórkowych. W artykule opisano urządzenie mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu (PDMS-PC) zdolne do niezawodnego generowania kombinacji gradientów chemicznych i tlenowych do badań migracji komórek, które można praktycznie wykorzystać w laboratoriach biologicznych bez wyrafinowanego oprzyrządowania.

Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badań migracji komórek w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu

Poznaj metodę wytwarzania mikroprzepływowych urządzeń z wzorami rowków do hodowli i badania zachowania komórek. Technika ta umożliwia tworzenie obszarów o niskim naprężeniu ścinającym, sprzyjających dokowaniu komórek.

Urządzenie mikrofluidyczne z wzorami rowków do badania zachowania komórek

Przeglądaj więcej filmów