Konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie prostego sposobu badania wpływu czynników chemotaktycznych i chemorepulsywnych na migrację komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji komórkowych, takie jak wpływ różnych czynników wzrostu na gojenie się ran. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją łatwo dostosować do różnych zastosowań i jest prosta w użyciu dla badaczy na wszystkich poziomach umiejętności.

Procedurę zademonstrują Aniqa Chowdhury, studentka studiów licencjackich, i Tyler Harvey, doktorant z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, utwórz plik CAD z pożądanym kształtem mikrokanału. Dostosuj szerokość i długość kanału, aby uzyskać wymagane nachylenie.

Tutaj kwadraty o długości 2,254 centymetra są połączone kanałem o szerokości 0,127 centymetra. Następnie należy zaopatrzyć się w kawałek akrylu o pożądanej grubości, aby uzyskać odpowiednią głębokość mikrokanalika. Szerokość arkusza akrylowego wynosząca około jednej szesnastej cala jest idealna, ponieważ grubsze arkusze są trudne do cięcia, a bardzo cienkie arkusze mogą pękać lub wypaczać się podczas procesu.

Zaimportuj plik CAD do urządzenia do cięcia laserowego i umieść element akrylowy na powierzchni cięcia. Następnie wytnij komorę, zgodnie z protokołem producenta. Umieść świeżo ściętą akrylową wycinankę w kształcie sztangi na małej szalce Petriego i przykryj, aż będzie potrzebna.

W łódce wagowej dodać dziesięć części bazy elastomerowej z jedną częścią utwardzacza i mieszać za pomocą mikropipety przez pięć minut. Przenieś mieszaninę do komory próżniowej i utrzymuj próżnię przez 30 minut, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza z PDMS. Po zakończeniu wyłącz odkurzacz i wyjmij łódkę ważącą.

Wylej odgazowany PDMS na akrylową wycinankę w kształcie sztangi na małej szalce Petriego. Upewnij się, że PDMS całkowicie zakrywa wkładkę. Pozwól PDMS utwardzić się przez co najmniej 18 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie ostrożnie przetnij PDMS wokół akrylowego elementu za pomocą skalpela i wyjmij wkładkę.

W standardowej komorze do hodowli komórkowych umieść komorę mikrokanalików na szalce Petriego, stroną do góry i całkowicie przykryj ją 70% etanolem. Następnie zamknij maskę i włącz światło UV. Wystaw komorę na działanie światła UV przez jedną do dwóch godzin.

Po ekspozycji otwórz okap z przepływem laminarnym i odczekaj 15 minut, aż okap przepływowy ponownie przywróci przepływ. Następnie usuń 70% etanol i umyj komory dwukrotnie sterylnym PBS. Używaj jednego mililitra PBS do każdego prania.

Po ostatnim umyciu wyjmij PBS i pozostaw komory do wyschnięcia na noc ze zdjętymi pokrywkami. Zbierz typ komórek, które mają być badane i dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do 400 mikrolitrów 0,4% błękitu trypanowego i delikatnie wymieszaj. Nanieść 100 mikrolitrów tego roztworu na hemocytometr, delikatnie wypełniając obie komory pod szkiełkiem nakrywkowym.

Użyj mikroskopu z obiektywem 10x, aby ustawić ostrość na siatce na hemocytometrze. Następnie użyj ręcznego licznika zliczania, aby policzyć żywe, niepodtrzymywane komórki we wszystkich czterech zestawach 16 kwadratów na hemocytometrze. Podziel całkowitą liczbę komórek przez cztery i pomnóż tę liczbę przez 50 000, aby uzyskać liczbę komórek na mililitr zawiesiny komórek.

Na podstawie tych obliczeń dodaj 2500 komórek i 100 mikrolitrów pożywki do jednej studzienki w każdej komorze. Pozostaw komórki w komorze na 60 minut, a następnie dodaj dodatkowe podłoże. Na początek dodaj agarozę do wody i podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej przez minutę lub do momentu, gdy agaroza całkowicie się rozpuści, a roztwór będzie klarowny.

Pozostaw roztwór do ostygnięcia przez 15 do 30 sekund przed wlaniem na szalkę Petriego. Aby usunąć wszelkie pęcherzyki, umieść szalkę Petriego w komorze próżniowej i pozwól agarozie zestalić się w próżni przez 30 minut. Po zestaleniu pokrój kostkę agarozy o wymiarach dwa milimetry na dwa milimetry na dwa milimetry za pomocą skalpela z szalki Petriego.

Całkowicie zanurz kostkę w roztworze zawierającym pożądane stężenie czynnika taktycznego chemii i namocz blok agarozy przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie umieść blok agarozy zawierający czynnik taktyczny chemioterapii na drugim końcu komory mikrokanałowej. Użyj markera, takiego jak mikrogranulki polistyrenu lub mikroskopijny defekt w komorze.

Aby określić względne położenie początkowe komórek. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby co godzinę przez 12 godzin wykonywać zdjęcia poklatkowe ruchomego frontu komórki. Seria pokazanych tutaj zdjęć dokumentuje ruch frontu komórki w poprzek kanału w odpowiedzi na gradient płodowej surowicy bydlęcej umieszczonej na przeciwległym końcu kanału.

Odległość migracji mierzono na podstawie odległości frontu wzrostu od mikroskopijnej wady urządzenia. Na podstawie tych pomiarów stwierdzono, że średnia prędkość czoła komórki wynosi 13,4 mikrometra na godzinę. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu czterech godzin, z dodatkowymi 18 godzinami oczekiwania na utwardzenie PDMS i dodatkowymi 12 godzinami na obrazowanie poklatkowe.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom o różnych poziomach umiejętności, w tym studentom studiów licencjackich z niewielkim doświadczeniem laboratoryjnym, do łatwego badania gojenia się ran i migracji komórek in vitro. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ostrożnym wyjęciu wkładki akrylowej z formy PDMS, aby zapewnić pomyślne wyprodukowanie komory mikrokanałowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyprodukować prostą komorę mikrokanałową do badania migracji komórek w odpowiedzi na różne sygnały chemiczne.

Po tej procedurze można badać inne sygnały, takie jak wiele rozpuszczalnych gradientów chemicznych, substraty, przezroczystość płynu i pola elektryczne, w celu zbadania ich wpływu na migrację komórek. Nie zapominaj, że praca z wycinarkami laserowymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak uzyskanie odpowiedniego szkolenia i stosowanie środków ochrony osobistej.