Name: Konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj konfigurowalną metodę pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na czynniki chemotaktyczne. Protokół umożliwia badanie gojenia ran i interakcji komórkowych z wykorzystaniem mikrokanalów PDMS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują programowi Creative Inquiry Uniwersytetu Clemson oraz CBET1254609 NSF za zapewnienie finansowania tego projektu.

1. Wykonanie komory z mikrokanałami w celu utworzenia gradientu stężeń
<ol>
	<li>Wycinanie elementu formy akrylowej
	<ol>
		<li>Należy przygotować kawałek akrylu o pożądanej szerokości. Zazwyczaj stosuje się arkusze akrylowe o grubości 1/16 cala. Grubsze arkusze są trudne do precyzyjnego wycięcia, natomiast arkusze bardzo cienkie nie posiadają wymaganej wytrzymałości mechanicznej, co powoduje ich pękanie lub odkształcanie się podczas procesu.</li>
		<li>Należy utworzyć plik CAD z pożądanym kształtem elementu akrylowego, aby wytworzyć wgłębienie w polidimetylosiloksanie (PDMS). Należy dostosować szerokość i długość kanału, aby uzyskać gradient odpowiedni dla poszczególnych protokołów eksperymentalnych.
		<ol>
			<li>W niniejszym przypadku należy użyć elementu akrylowego o następujących wymiarach: dwa kwadraty (0,254 cm x 0,254 cm) połączone kanałem o szerokości 0,127 cm (o długości 0,254 cm) (Rysunek 1).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Należy zaimportować plik CAD do urządzenia do cięcia laserowego i umieścić element akrylowy w wycinarce laserowej zgodnie z protokołem producenta. 
		UWAGA: Alternatywnie element można wydrukować w technologii 3D na podstawie projektu CAD. Zaletą tej metody jest możliwość zastosowania innych materiałów do wykonania formy; jednakże rozdzielczość i powtarzalność mogą być niższe w przypadku druku 3D w porównaniu z cięciem laserowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat modelowania 3D przedstawiający wymiary geometryczne komponentu strukturalnego." src="/files/ftp_upload/55264/55264fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Reprezentacja w systemie wspomagania projektowania komputerowego (CAD) komory mikrokanałowej. Na obrazie przedstawiono rysunek CAD akrylowej wkładki niezbędnej do stworzenia komory mikrokanałowej. 1A) Widok z góry rysunku CAD, 1B) Widok z boku rysunku CAD z wymiarami w calach, 1C) Widok z góry rysunku CAD z wymiarami w calach <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="2">
	<li>Wlewanie polidimetylosiloksanu (PDMS)
	<ol>
		<li>W łódzce wagowej wymieszać 10 części wagowych komercyjnej bazy elastomerowej (np. Sylgard 184) z 1 częścią wagową komercyjnego utwardzacza elastomerowego (np. Sylgard 194). Zazwyczaj miesza się 10 g bazy elastomerowej z 1 g utwardzacza elastomerowego.</li>
		<li>Mieszać bazę i utwardzacz za pomocą mikropipety przez 5 min do połączenia składników.</li>
		<li>Przygotować dzwon próżniowy i umieścić łódzkę wagową z PDMS w próżni na 30 min w celu usunięcia uwięzionych pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Wyłączyć próżnię i wyjąć łódzkę wagową. Wlać PDMS na akrylowy wycinek w małej szalce Petriego. Upewnić się, że PDMS całkowicie pokrywa wkładkę.</li>
		<li>Pozostawić PDMS do utwardzenia przez noc (przynajmniej 18 h) w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie wkładki z PDMS
	<ol>
		<li>Po utwardzeniu PDMS usunąć wkładkę, ostrożnie wycinając PDMS wokół akrylowego elementu za pomocą skalpela.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wysiewanie komórek do komory mikrokanałowej
<ol>
	<li>Sterylizacja komory przed wysiewem komórek. 
	UWAGA: Chociaż PDMS można sterylizować tlenkiem etylenu lub innymi technikami, szybka obróbka promieniami UV jest szybka, niedroga i wystarczająca dla badań hodowli komórkowych. Krótki czas naświetlania UV nie upośledził struktury ani integralności mechanicznej elementu z PDMS.
	<ol>
		<li>W standardowej komorze do hodowli komórek całkowicie pokryć komorę 70% etanolem.</li>
		<li>Umieścić szalkę Petriego w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza bez przykrywek.</li>
		<li>Zamknąć dygestorium i włączyć lampę UV. Naświetlać promieniami UV przez 1-2 h.</li>
		<li>Otworzyć dygestorium i odczekać 15 min do przywrócenia przepływu powietrza.</li>
		<li>Usunąć 70% etanol.</li>
		<li>Przemyć komory dwukrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Do każdego przemycia użyć 1 mL PBS. Usunąć PBS i pozostawić komory do wyschnięcia przez noc bez przykrywek. 
		UWAGA: Alternatywnie, zamiast dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, można użyć komory UV do sterylizacji, jeśli jest dostępna. Komorę UV można wykonać, umieszczając źródło światła UV z tyłu kartonowego pudełka wyłożonego folią aluminiową. Folia aluminiowa odbija światło, co zapewnia równomierne naświetlenie próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiew komórek do komory
	<ol>
		<li>Policzyć komórki przy użyciu błękitu trypanu i hemocytometru.
		<ol>
			<li>Dodać 100 µL zawiesiny komórkowej do 400 µL 0,4% błękitu trypanu i delikatnie wymieszać. Nanieść 100 µL tego roztworu na hemocytometr, delikatnie wypełniając obie komory pod szkiełkiem nakrywnym.</li>
			<li>Użyć mikroskopu z obiektywem 10X, aby ustawić ostrość na siatkę hemocytometru. Użyć ręcznego licznika do zliczenia żywych, niebarwionych komórek w jednym zestawie 16 pól na hemocytometrze.</li>
			<li>Policzyć komórki we wszystkich 4 zestawach po 16 pól. Obliczyć średnią liczbę komórek z 4 zestawów 16 pól i pomnożyć ją przez 5x104. Otrzymana liczba stanowi liczbę komórek/mL w zawiesinie komórkowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać 2 500 komórek do jednego dołka w każdej komorze. Odpowiada to gęstości komórek bliskiej konfluencji na poziomie ~30 000/cm2.</li>
		<li>Pozostawić komórki w komorze na 60 min przed dodaniem pożywki (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Bloki agarozy nasączone dekstranem
<ol>
	<li>Przygotowanie bloku agarozy
	<ol>
		<li>Wlej 3% agarozę do wydrukowanej w technologii 3D formy (2 mm x 2 mm x 2 mm).</li>
		<li>Pozostaw agarozę do stężenia w komorze próżniowej przez 30 min w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Wyjmij blok agarozy z formy. 
		UWAGA: Alternatywnie można wlać 3% agarozę do małej szalki Petriego, tworząc warstwę o grubości 2 mm. Następnie należy wyciąć blok o wymiarach 2 mm x 2 mm x 2 mm za pomocą skalpela lub innego narzędzia tnącego. Metoda ta jest mniej precyzyjna niż system z formą, ale może być nieco łatwiejsza do wykonania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Całkowicie zanurz blok agarozy w roztworze czynnika chemotaktycznego o pożądanym stężeniu. Aby ocenić tworzenie się gradientu stężeń, należy najpierw przepłukać komorę fluorescencyjnym dekstranem. Stężenie i masa cząsteczkowa dekstranu powinny odpowiadać stężeniu i masie cząsteczkowej badanego czynnika rozpuszczalnego lub leku.</li>
	<li>Namaczaj blok agarozy przez noc.</li>
</ol>
4. Time-lapse dyfuzji dekstranu w celu oceny gradientu stężeń czynnika rozpuszczalnego
<ol>
	<li>Umieść blok agarozy nasączony dekstranem w małym kwadratowym dołku komory mikrokanałowej.</li>
	<li>Umieść komorę mikrokanałową w systemie obrazowania komórek lub użyj innego mikroskopu fluorescencyjnego z funkcją time-lapse. Rozpocznij rejestrację time-lapse zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Przedstawione wyniki uzyskano przy użyciu filtra GFP, 50% natężeniu światła, pH 4/10 oraz 4-krotnym powiększeniu.</li>
</ol>
5. Time-lapse wzrostu komórek
<ol>
	<li>Wysiej komórki w komorze mikrokanału na jednym z jego końców. W tym przypadku należy użyć fibroblastów 3T3. Do jednej studni w komorze mikrokanału dodaj 2 500 komórek. Policz komórki zgodnie z opisem w punkcie 2.2.1.
	<ol>
		<li>Pozostaw komórki w komorze na 60 min przed dodaniem pożywki (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin). Przechowuj komorę mikrokanału z wysianymi komórkami w temperaturze 37 °C w 5% CO2. Migrację komórek przez kanał można obserwować za pomocą mikroskopu.</li>
		<li>Dodaj znacznik lub wykorzystaj mikroskopijną wadę w komorze jako znacznik, aby służył on jako punkt startowy do ilościowego określenia dystansu, o jaki przesuwa się front komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustanów gradient, umieszczając blok żelu agarozowego (8 mm3) zawierający skoncentrowany czynnik wzrostu, chemoatraktant, lek lub inny testowany czynnik (tutaj jako przykład użyto 40% FBS) na jednym z końców komory mikrokanału.</li>
	<li>Wykonaj obrazy time-lapse przesuwającego się frontu komórek. W tym przypadku wyniki przedstawiają obrazy frontu komórek wykonane co 12 h przy użyciu systemu obrazowania.</li>
	<li>Wykorzystaj zdjęcia frontu komórek do ilościowego określenia szybkości wzrostu komórek. Oblicz szybkość wzrostu, używając najpierw funkcji polyfit w programie MATLAB (roipoly), aby utworzyć maskę wielokąta zdefiniowaną przez front komórek, ściany kanału i znacznik referencyjny. Wymiary tej maski dają dystans migracji frontu, z którego obliczana jest średnia prędkość frontu komórek. Podobna metoda była stosowana w innych badaniach8. 
	UWAGA: Porównaj krawędź frontu wzrostu komórek na każdej klatce z stężeniem rozpuszczalnego czynnika w tej samej odległości. Gradient stężenia czynnika rozpuszczalnego jest obliczany przy użyciu przybliżonego modelu dyfuzji 1D.</li>
	<li>Wykonaj obrazy fluorescencyjne komórek przy użyciu barwienia falloidyną i DAPI.
	<ol>
		<li>Utrwal komórki przed barwieniem falloidyną.
		<ol>
			<li>Podgrzej 4% paraformaldehyd do 37 °C.</li>
			<li>Dodaj wystarczającą ilość 4% paraformaldehydu, aby pokryć komórki. Pozostaw komórki w paraformaldehydzie na 10 min.</li>
			<li>Przepłucz dwukrotnie PBS, za każdym razem przez 15 min. Użyj wystarczającej ilości PBS, aby pokryć komórki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usuń PBS z komórek i dodaj wystarczającą ilość roztworu permeabilizującego (0,1% Triton X-100 w PBS), aby pokryć komórki. Pozostaw roztwór na 10 min.</li>
		<li>Przemyj dwukrotnie PBS, za każdym razem przez 5 min. Użyj wystarczającej ilości PBS, aby pokryć komórki.</li>
		<li>Usuń PBS z komórek i dodaj roztwór blokujący (1% bovine serum albumin w PBS) na 20 min.</li>
		<li>Usuń roztwór blokujący i przemyj 2 razy PBS, za każdym razem przez 5 min. Użyj wystarczającej ilości PBS, aby pokryć komórki.</li>
		<li>Od tego momentu chroń komórki przed światłem za pomocą folii aluminiowej, gdy nie są używane. Usuń PBS z komórek i dodaj Phalloidin 488 rozcieńczoną 1:50 w PBS na 1 h.</li>
		<li>Przemyj 2 razy w PBS przez 5 min podczas każdego mycia. Użyj wystarczającej ilości PBS, aby pokryć komórki. Następnie usuń PBS z komórek.</li>
		<li>Dodaj do komórek DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) rozcieńczony 1:1 000 w PBS na 15 min.</li>
		<li>Usuń DAPI i przemyj komórki dwukrotnie PBS, za każdym razem przez 5 min.</li>
		<li>Usuń ostatni płukanie i dodaj wystarczającą ilość PBS, aby pokryć komórki. Komórki można teraz obrazować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+fabricated+in+poly+%28dimethylsiloxane%29+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li>
<li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dynamic+temporal+and+spatial+concentration+gradients+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices.</a> Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).</li>
<li>Darby, I., Hewitson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Differentiation+in+Wound+Healing+and+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis.</a> Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).</li>
<li>Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+study+fibroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskel%22%5BJournal%5D)">A new approach to study fibroblast migration.</a> Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).</li>
<li>Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+Factors%2C+Matrices%2C+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324, 1673-1677 (2009).</li>
<li>Zengel, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21592329">µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies.</a> BMC Cell Biol. , (2011).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576901">Boyden Chamber Assay.</a> Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).</li>
<li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+revised%3A+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models%5BTitle%5D)+AND+%22JCB%22%5BJournal%5D)">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models.</a> JCB. 203 (4), 691-709 (2013).</li>
<li>Saadi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+concentration+gradients+in+2D+and+3D+environments+using+a+microfluidic+ladder+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber.</a> Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).</li>
<li>Cammer, M., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+Responses+by+Macrophages+to+a+Directional+Source+of+a+Cytokine+Delivered+by+a+Micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette.</a> Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).</li>
<li>Wells, C. M., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+migration+using+the+Dunn+chemotaxis+chamber+and+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+migration+chip+for+chemotaxis-based+microfluidic+selection+of+heterogeneous+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Wright, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+open+microfluidic+devices+for+chemotaxis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies.</a> Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).</li>
<li>Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+with+arbitrary+shapes+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+devices%3A+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5 (1), 013412(2011).</li>
<li>Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chambers+for+cell+migration+and+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Tech%3A+Rev+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research.</a> Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).</li>
<li>Tang, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTang%2C+SK+%22Basic+microfluidic+and+soft+lithographic+techniques.+Optofluidics%3A+Fundamentals%2C+Devices+and+Applications%22">Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications</a>. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. , McGraw-Hill, 2010. (2010).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+multicompartment+device+for+neuroscience+research%29%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microfluidic multicompartment device for neuroscience research).</a> Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).</li>
<li>Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Device+for+Studying+Multiple+Distinct+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains.</a> JoVE. (69), (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasza komora mikrokanałowa może być wykorzystywana do wielu celów, w tym do określania szybkości migracji komórek w odpowiedzi na czynniki wzrostu i chemoatraktanty oraz pomiaru szybkości dyfuzji leku z matrycy polimerowej. Możliwe jest wykorzystanie naszej komory mikrokanałowej do hodowli komórek i umieszczenia chemoatraktantu na jednym końcu komory. Komórki rosną w odpowiedzi na chemoatraktant, a migrację komórek można określić ilościowo, wykonując zdjęcia poklatkowe, które można analizować w celu określenia szybkości ...

Aby mogły zaistnieć kluczowe procesy, takie jak gojenie się ran, reakcje immunologiczne i rozwój embrionalny, musi nastąpić migracja komórek. Migracja komórek obejmuje interakcję między komórkami a sąsiednimi komórkami, macierzą zewnątrzkomórkową i rozpuszczalnymi sygnałami chemicznymi (atraktantami lub repelentami). Na przykład w procesie gojenia się ran fibroblasty odgrywają integralną rolę w fibrogenezie i kurczeniu się ran, gdzie komórki są rekrutowane do miejsca urazu w celu syntezy kolagenu w celu utworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej3. Zbadano liczne mechanizmy stojące za migracją fibroblastów do miejsca rany, w tym różne czynniki mechaniczne, fizyczne, elektryczne i chemotaktyczne4. Fibroblasty szczególnie dobrze reagują na różne gradienty stężeń czynników wzrostu. Te różne czynniki wzrostu współpracują ze sobą, aby zoptymalizować regenerację tkanek5. Obserwując odpowiedź chemotaktyczną fibroblastów na stężenia czynnika wzrostu, można badać wzorzec kierunkowej migracji fibroblastów i sposób, w jaki orientują się one wokół przeszkód fizycznych, aby dotrzeć do celu. Dlatego celem tego badania było po pierwsze opracowanie systemu, w którym wzrost fibroblastów mógłby być śledzony pod kierunkiem barier fizycznych, a po drugie modelowanie wzrostu fibroblastów podczas ich poruszania się w systemie.
Obecnie, test komorowy Boydena jest najczęściej używanym systemem do pomiaru migracji komórek6. Komora Boydena składa się z dwukomorowej płytki wielodołkowej, z której każda może zawierać pożywkę z chemoatraktantami lub bez7. Membrana filtracyjna zapewnia porowaty interfejs między dwiema komorami w każdej studni; Tworzy to barierę, przez którą komórki nie mogą przejść, chyba że odbywa się to przez aktywną migrację. Zazwyczaj w komorze Boydena do dolnej komory dodaje się chemoatraktant, a system może się zrównoważyć, tworząc gradient między górnym i dolnym dołkiem4. Jednym z problemów związanych z testem w komorze Boydena jest to, że strome gradienty tworzą się wzdłuż jednej osi prostopadłej do powierzchni membrany. Powoduje to, że różnica w stężeniu chemoatraktantu między górnym i dolnym dołkiem jest niższa niż pierwotnie oczekiwano. Ze względu na to ograniczenie, test w komorze Boydena utrudnia skorelowanie określonych odpowiedzi komórek z określonymi cechami gradientu, takimi jak nachylenie i różnica stężeń. Bez tych pomiarów trudno jest badać wielogradientową integrację sygnału.
Aby rozwiązać niektóre z ograniczeń tradycyjnego testu komorowego Boydena, opracowano testy mikroprzepływowe, które tworzą konfigurowalne gradienty stężeń1. Standardowe metody tworzenia układów mikroprzepływowych wymagają pomieszczeń czystych dla technik litograficznych. Techniki te mogą być trudne do nauczenia, zwłaszcza w standardowych warunkach klasowych. W związku z tym zaprojektowaliśmy system komorowy do pomiaru migracji komórek, który można wykonać bez użycia pomieszczenia czystego. Korzystając z naszego systemu, studzienki testowe można dostosować do preferowanego rozmiaru i można uzyskać liniowy gradient stężenia o niestandardowym nachyleniu. Pozwala to na dokładny pomiar chemotaksji od ruchu losowego. Konstrukcja jest niedrogim i łatwym w użyciu systemem do modelowania wzrostu komórek w odpowiedzi na różne bodźce chemiczne.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td>2-częściowy zestaw z poli(dimetylosiloksanem) zawierający bazę z elastomeru silikonowego i utwardzacz z elastomeru silikonowego</td></tr><tr><td>Arkusze akrylowe</td><td>US Plastic</td><td>44200</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe szalki Petriego&nbsp;</td><td>Sokół&nbsp;</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny&ndash; dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20s-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, typ I, niska EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013-100G</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle's Medium firmy Dulbecco</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>Składniki pożywki komórkowej</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Fisher Scientific</td><td>16000036</td><td>Składniki pożywki komórkowej</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td>Składniki pożywki komórkowej</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24384</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL System obrazowania komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AME3300</td><td>Przyrząd służący do wykonywania zdjęć poklatkowych</td></tr><tr><td>Versa Laser</td><td>Universal Laser Systems, Inc.&nbsp;</td><td>Numer modelu VLS2.30</td><td>Wycinarka laserowa służąca do cięcia tworzyw sztucznych</td></tr></tbody></table>

konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Migracja komórek jest istotną częścią odpowiedzi immunologicznej, wzrostu i gojenia się ran. Migracja komórek to złożony proces, który obejmuje interakcje między komórkami, macierzą zewnątrzkomórkową oraz rozpuszczalnymi i nierozpuszczalnymi czynnikami chemicznymi (np. chemoatraktantami). Standardowe metody pomiaru migracji komórek, takie jak test z komorą Boydena, działają poprzez liczenie komórek po obu stronach dzielnika. Techniki te są łatwe w użyciu; Oferują jednak niewielką modyfikację geometryczną dla różnych zastosowań. W przeciwieństwie do tego, urządzenia mikroprzepływowe mogą być używane do obserwacji migracji komórek z konfigurowalnymi gradientami stężeń rozpuszczalnych czynników1,2. Jednak metody wykonywania testów opartych na mikrofluidyce mogą być trudne do nauczenia.
Tutaj opisujemy prostą metodę tworzenia komór do hodowli komórkowych w celu pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na gradienty stężeń chemicznych. Nasza metoda komory migracji komórek może tworzyć różne liniowe gradienty stężeń w celu badania migracji komórek do różnych zastosowań. Ta metoda jest stosunkowo łatwa w użyciu i jest zwykle wykonywana przez studentów studiów licencjackich.
Komora mikrokanałowa została utworzona poprzez umieszczenie akrylowej wkładki w kształcie końcowej komory mikrokanałowej w szalce Petriego. Następnie poli(dimetylosiloksan) (PDMS) wylano na wierzch wkładki. Pozostawiono PDMS do stwardnienia, a następnie usunięto wkładkę. Pozwoliło to na tworzenie studni w dowolnym pożądanym kształcie i rozmiarze. Komórki mogą być następnie dodawane do komory mikrokanałowej, a środki rozpuszczalne mogą być dodawane do jednej z studzienek poprzez namoczenie bloku agarozy w żądanym środku. Blok agarozy dodaje się do jednej z studzienek i można wykonać zdjęcia poklatkowe komory mikrokanałowej w celu ilościowego określenia migracji komórek. Warianty tej metody można tworzyć dla danej aplikacji, dzięki czemu metoda ta jest wysoce konfigurowalna.

Rycina 2 przedstawia ruch czoła komórek przez kanał w odpowiedzi na gradient płodowej surowicy bydlęcej umieszczony na przeciwległym końcu kanału względem miejsca wysiania komórek. Czoło komórek pokazano w 48 h (Rycina 2A), 72 h (Rycina 2B), 96 h (Rycina 2C) i 120 h (Rycina 2D) po wysianiu. Ruch czoła komórek śledzono za pomocą tych obrazów time-lapse, a dystans migracji i tempo wzrostu obliczono za pomoc...

Ten protokół szczegółowo opisuje konfigurowalną metodę pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na chemoatraktanty, które mogą być również użyte do określenia szybkości dyfuzji leku z matrycy polimerowej.

Konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapewnienie prostego sposobu badania wpływu czynników chemotaktycznych i chemorepulsyjnych na migrację komórek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie oddziaływań komórkowych, takich jak wpływ różnych czynników wzrostu na gojenie ran. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją łatwo dostosować do różnych zastosowań i jest ona prosta w obsłudze dla badaczy o każdym poziomie zaawansowania.Procedurę zademonstrują Aniqa Chowdhury, studentka studiów licencjackich, oraz Tyler Harvey, doktorant z mojego laboratorium. Na początek należy stworzyć plik CAD z pożądanym kształtem mikrokanału. Dostosuj szerokość i długość kanału, aby uzyskać wymagany gradient.W tym przypadku kwadraty o boku 2,254 cm są połączone kanałem o szerokości 0,127 cm. Następnie należy przygotować arkusz akrylu o odpowiedniej grubości, aby uzyskać właściwą głębokość mikrokanału. Idealna szerokość arkusza akrylowego wynosi około 1/16 cala, ponieważ grubsze arkusze są trudne do cięcia, a zbyt cienkie mogą pękać lub odkształcać się podczas procesu.Zaimportuj plik CAD do urządzenia do cięcia laserowego i umieść element akrylowy na powierzchni tnącej. Następnie wytnij komorę zgodnie z protokołem producenta. Umieść świeżo wycięty element akrylowy w kształcie sztangi w małej płytce Petriego i przykryj go do momentu użycia.Do łódeczki wagowej należy dodać dziesięć części bazy elastomeru oraz jedną część utwardzacza, a następnie mieszać za pomocą mikropipety przez pięć minut. Mieszaninę należy przenieść do komory próżniowej i poddać działaniu próżni przez 30 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione w PDMS. Po zakończeniu procesu należy wyłączyć próżnię i wyjąć łódeczkę wagową.Wlej odgazowany PDMS na wkładkę z akrylu w kształcie sztangi, umieszczoną w małej płytce Petriego. Upewnij się, że PDMS całkowicie pokrywa wkładkę. Pozostaw PDMS do utwardzenia przez co najmniej 18 godzin w temperaturze pokojowej, następnie ostrożnie wytnij PDMS wokół elementu akrylowego za pomocą skalpela i usuń wkładkę.W standardnej komorze do hodowli komórek umieść komorę mikroprzepływową w szalce Petriego, stroną z elementami do góry i całkowicie pokryj ją 70% ethanol. Następnie zamknij komorę i włącz lampę UV. Naświetlaj komorę promieniami UV przez jedną do dwóch godzin.Po ekspozycji otwórz komorę z laminarnym przepływem powietrza i odczekaj 15 minut, aż przepływ zostanie ponownie ustanowiony. Następnie usuń 70% etanol i dwukrotnie przemyj komory sterylnym PBS. Do każdego płukania użyj 1 ml PBS.Po ostatnim przemyciu usunąć PBS i pozostawić komory do wyschnięcia przez noc z zdjętymi pokrywkami. Zebrać typ komórek przeznaczony do badania, a następnie dodać 100 µL zawiesiny komórkowej do 400 µL 0,4% trypanu niebieskiego i delikatnie wymieszać. Nanieść 100 µL tego roztworu na hemocytometr, delikatnie wypełniając obie komory pod szklanym nakryciem.Użyj mikroskopu z obiektywem 10x, aby ustawić ostrość na siatce komory countingowej. Następnie za pomocą ręcznego licznika zlicz żywe, nieagregujące się komórki we wszystkich czterech zestawach 16 pól na komorze. Podziel całkowitą liczbę komórek przez cztery, a następnie pomnóż otrzymaną wartość przez 50 000, aby obliczyć liczbę komórek na jeden mililitr zawiesiny komórkowej.Na podstawie tego obliczenia należy dodać 2500 komórek i 100 µL pożywki do jednej studzienki w każdej komorze. Pozostawić komórki w komorze na 60 minut, a następnie dodać dodatkową pożywkę. Aby rozpocząć, dodać agarozę do wody i podgrzewać roztwór w kuchence mikrofalowej przez jedną minutę lub do momentu, aż agaroza całkowicie się rozpuści, a roztwór stanie się przejrzysty.Pozostawić roztwór do ostygnięcia przez 15 do 30 sekund przed przelaniem do szalki Petriego. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, umieścić szalkę Petriego w komorze próżniowej i pozostawić agarozę do zastygnięcia w próżni przez 30 minut. Po zastygnięciu, za pomocą skalpela wyciąć z szalki Petriego sześcian agarozy o wymiarach 2 mm x 2 mm x 2 mm.Całkowicie zanurz sześcian w roztworze zawierającym pożądaną koncentrację czynnika chemotaktycznego i mocz blok agarozowy przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie umieść blok agarozowy z czynnikiem chemotaktycznym na przeciwległym końcu komory mikrokanału. Wykorzystaj marker, taki jak polistyrenowe mikrokulki lub defekt mikroskopowy w komorze.Aby zidentyfikować względną lokalizację początkową komórek. Należy użyć oprogramowania do obrazowania, aby co godzinę przez 12 godzin wykonywać obrazy poklatkowe przemieszczającego się frontu komórek. Przedstawiona tutaj seria obrazów dokumentuje ruch frontu komórek przez kanał w odpowiedzi na gradient płodowej surowicy bydlęcej umieszczony na przeciwległym końcu kanału.Odległość migracji mierzono na podstawie dystansu frontu wzrostu od mikroskopowej wady w urządzeniu. Z pomiarów tych ustalono, że średnia prędkość frontu komórkowego wynosiła 13,4 micrometers per hour. Po opanowaniu techniki tej, proces można przeprowadzić w cztery godziny, z dodatkowymi 18 godzinami czasu oczekiwania na utwardzenie PDMS oraz dodatkowymi 12 godzinami na obrazowanie poklatkowe.Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom o różnym stopniu zaawansowania, w tym studentom studiów licencjackich z niewielkim doświadczeniem laboratoryjnym, umożliwiając łatwe badanie gojenia ran i migracji komórek in vitro. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ostrożnym wyjęciu wkładki akrylowej z formy PDMS, aby zapewnić prawidłowe wytworzenie komory z mikrokanałem. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wykonać prostą komorę z mikrokanałem do badania migracji komórek w odpowiedzi na różne sygnały chemiczne.Po przeprowadzeniu tej procedury można badać inne bodźce, takie jak wielokrotne rozpuszczalne gradienty chemiczne, podłoża, naprężenia ścinające płynu oraz pola elektryczne, aby przeanalizować ich wpływ na migrację komórek. Należy pamiętać, że praca z wycinarkami laserowymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak przejście odpowiedniego szkolenia i stosowanie środków ochrony osobistej.

a-customizable-chamber-for-measuring-cell-migration

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano przedzielone urządzenie mikrofluidyczne do badania migracji komórek macierzystych nowotworu. Ta nowatorska platforma tworzy żywotne mikrośrodowisko komórkowe i umożliwia mikroskopową wizualizację lokomocji żywych komórek. Wysoce ruchliwe komórki nowotworowe są izolowane w celu zbadania molekularnych mechanizmów agresywnej infiltracji, co w przyszłości może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych terapii.

Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

Test ścieżki motylości fagokinetycznej jest metodą stosowaną do oceny ruchu komórek. W szczególności test ten mierzy w sposób ilościowy chemokinezę (losową motylość komórek) w czasie. Metoda ta wykorzystuje zdolność komórek do tworzenia mierzalnego śladu ich ruchu na szkiełkach nakrywkowych powlekanych koloidalnym złotem.

Ilościowa ocena migracji komórek z wykorzystaniem testu ruchliwości w śladach fagokinetycznych

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisano ilościową metodę badania spontanicznej migracji komórek w jednowymiarowym, zamkniętym mikrośrodowisku. Metoda ta wykorzystuje mikrofabrykowane kanały i może być stosowana do badania migracji dużej liczby komórek w różnych warunkach w pojedynczych eksperymentach.

Badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych

Badanie wczesnej migracji komórek śródbłonka (EEC) jest ważne dla zrozumienia patofizjologii niektórych chorób i potencjalnego zidentyfikowania nowych strategii interwencji terapeutycznej. Poniższy protokół opisuje techniki oceny migracji komórek, które zostały dostosowane do badania EWG.

Ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia

To badanie przedstawia dwie różne metody analizy inwazji i migracji komórek: test komory Boydena i test gojenia ran oparty na mikroskopie in vitro. Opisano protokoły tych dwóch eksperymentów oraz porównano ich zalety i wady.

Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.

Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

Protokół do ilościowej oceny migracji komórek 3D w obrębie i do interfejsu granulowanych hydrożeli jest przedstawiony tutaj.

Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych

Zdolność do pomiaru kinetyki uwalniania pęcherzyków może pomóc zapewnić wgląd w niektóre z podstaw nerwowe. Tu używane obrazu w czasie rzeczywistym pęcherzyków oznaczone czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym FM 4-64 do pomiaru tempa uwalniania pęcherzyków presynaptycznych neuronów hipokampa w hodowli.

Pomiar egzocytozy w Neurony Korzystanie FM etykietowania

Poznaj konfigurowalną metodę pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na czynniki chemotaktyczne. Protokół umożliwia badanie gojenia ran i interakcji komórkowych z wykorzystaniem mikrokanalów PDMS.

Konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek

Przeglądaj więcej filmów